专利名称：自组装复合纳米颗粒肿瘤疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种新型治疗性肿瘤疫苗，具体地说涉及一种自组装复合纳米颗粒肿瘤疫苗及其制备方法。
背景技术：
肿瘤疫苗是肿瘤生物治疗中的重要手段，它通过激发机体免疫系统，在体内产生针对肿瘤细胞的特异性的识别和杀伤。在预防肿瘤的复发和转移方面，肿瘤疫苗具有手术、化疗、放疗三大传统治疗手段无法比拟的独特优势[Mocellin S，et al Cancer vaccine developmenton the way to break immunetolerance to malignant cells.Exp Cell Res.2004；299(2)267-78]。
肿瘤疫苗，目前已经研究和开发的有以下多种形式(1)以肿瘤全细胞为基础的疫苗肿瘤裂解物，基因转染的肿瘤细胞，肿瘤细胞RNA疫苗等；(2)肿瘤抗原疫苗以明确的肿瘤抗原为基础，包括肽疫苗，DNA疫苗，自身RNA疫苗等；(3)DC为基础的疫苗包括肿瘤-DC融合细胞疫苗，肿瘤裂解物、RNA和抗原肽冲击DC疫苗等。其它还有热休克蛋白融合肽疫苗，RNA疫苗、外小体(exosomes)疫苗等。但上述疫苗，尚没有达到理想的免疫治疗效果[Yannelli JR，etal On the road to a tumor cell vaccine20 years ofcellular immunotherapy.Vaccine.2004；23(1)97-113]。肿瘤疫苗的制备涉及到肿瘤抗原、免疫递呈、免疫共刺激及免疫微环境等多方面的问题，只有将多种免疫学机制和多种疫苗形式有机地融合到一起，才有可能使多种作用机制，协同性发挥作用，最大程度地增强肿瘤疫苗的免疫保护效果。目前的肿瘤疫苗制备技术，尚不能达到上述目的，本发明将发展自组装复合纳米颗粒疫苗技术，实现多种免疫学机制和多种疫苗形式的有机融合，大幅度提高肿瘤疫苗的免疫保护效果。
发明内容
本发明提供了一类融合多种作用机制的自组装复合纳米颗粒肿瘤疫苗，还提供了自组装复合纳米颗粒肿瘤疫苗的制备方法。
本发明公开的自组装复合纳米颗粒肿瘤疫苗，为一种由肿瘤细胞膜脂质、蛋白质分子元件、DNA质粒三种成分自组装形成的纳米颗粒，如
图1所示。它是将肿瘤抗原分子、免疫佐剂分子等各种分子元件构建到真核表达载体上，分别锚定表达在肿瘤细胞表面，然后将表达有关分子元件的细胞进行混合，提取收获细胞膜，将细胞膜裂解成含有锚定形式蛋白质分子元件的膜脂质成分，与含有肿瘤抗原分子、免疫调节分子的DNA质粒混合，在一定的缓冲条件下自组装形成纳米颗粒肿瘤疫苗。电镜结果显示，自组装纳米颗粒复合肿瘤疫苗颗粒直径为100-300nm，有利于单核巨噬系统吞噬。
组成肿瘤疫苗的蛋白质形式或基因形式的分子元件，含有肿瘤抗原分子、免疫佐剂分子等的一种或几种；肿瘤抗原分子包括特异性肿瘤抗原和抗转移和血管靶点的抗原；免疫佐剂分子包括GM-CSF、IL-2、B7、4-1BBL、SLC、CD40L、FL等。
组成肿瘤疫苗的蛋白质分子元件，融合有来源于人免疫球蛋白的IgGFc蛋白片段，通过GPI与细胞膜脂质成分连接，并融合有来源于鱼精蛋白的阳离子蛋白片段，可与含阴离子电荷的核酸结合，结合一种或几种含有肿瘤抗原分子、免疫调节分子DNA质粒。
本发明提供的自组装复合纳米颗粒肿瘤疫苗，含有以下具体的技术特征1、复合抗原靶点本发明除了利用肿瘤细胞本身提供肿瘤抗原，还选择已知的特异性肿瘤抗原、血管靶点和转移靶点，从多种层面上解决靶抗原的选择问题，对抗原进行进一步强化，使激发的免疫反应，不但能够攻击肿瘤细胞本身，而且对肿瘤新生血管生成及肿瘤转移，都能够发挥强力的抑制作用，从而实现对肿瘤细胞的立体化攻击和抑制，比目前其它肿瘤疫苗选择单向靶点(主要是肿瘤抗原)有较大优势[Liu JY，et al Immunotherapy of tumorswith vaccine based on quail homologous vascular endothelial growth factorreceptor-2.Blood.2003；102(5)1815-23]。
2、佐剂分子配伍目前有多种免疫佐剂分子和DC递呈细胞等曾用于疫苗的研究，我们对这些免疫分子及细胞的协同作用做了细致深入的配伍研究，找到了最佳的分子配伍方案，发现GM-CSF、IL-2、B7可以作为基本配伍方案、4-1BBL、SLC、CD40L、FL等对上述基本配伍方案具有强化作用，可作为基本配伍方案的拓展和补充。由此设计的疫苗佐剂系统，能够动员多种作用机制，协同性发挥作用，使疫苗在结构和功能上都得到了较好的优化，是目前其它模式疫苗难以媲美的[Van Tendeloo VF，et al.Gene-based cancervaccinesan ex vivo approach.Leukemia.2001；15(4)545-58]。
3、细胞表面锚定糖基化磷脂酰肌醇(GPI)，是对蛋白质进行翻译后修饰的一种脂性结构，蛋白质可通过GPI结构锚定于细胞膜表面，而不跨越其磷脂膜双层结构[Cimino AM，et al Cancer vaccine developmentproteintransfer of membrane-anchored cytokines and immunostimulatory molecules.Immunol Res.2004；29(1-3)231-40]。本项目用GPI修饰各种分子元件，以GPI锚定蛋白的形式表达于细胞膜表面，有利于在细胞膜自组装形成脂质体时，自发的整合到脂质体中，使所得到的脂质体，含有所需要的所有分子元件，从而发挥分子的免疫协同作用。表面锚定技术和自组装嵌合膜脂质体技术的联合应用，巧妙地解决了将多种功能分子元件进行有机整合的问题，是疫苗设计上的一个重要突破。
4、基因锚定DNA疫苗被称为疫苗史上的第三次革命，是将含有目的基因的真核质粒直接注入机体。它以能产生蛋白疫苗不能产生的细胞免疫反应而倍受关注。鱼精蛋白是一段含有28个氨基酸的小肽，鱼精蛋白含有丰富的正电荷，可与DNA质粒高亲和力结合。可以通过鱼精蛋白基因的表达，将含抗原和各种免疫分子的DNA质粒，负载到在膜表达的功能蛋白上(融合有阳离子鱼精蛋白片段)，在阳离子蛋白上形成“簇状”的分布形式，我们称之为“基因簇锚定技术”，通过上述策略，可将核酸疫苗与蛋白质疫苗有机融合，更好地激发机体的高效免疫应答[Li S，et al Characterization of cationiclipid-protamine-DNA(LPD)complexes for intravenous gene delivery Gene Ther.1998；5(7)930-7.]。
5、自组装膜脂质纳米颗粒近年来，脂质体作为药物载体的研究愈来愈受到重视，进展迅速。脂质体是网状内皮系统最好的药物载体，用于疫苗类药物具有独特的优势。目前，将脂质体用作疫苗佐剂已有很多报道，大部分都取得了良好效果。常规脂质体都是用磷脂、胆固醇等脂性材料进行人工合成，而细胞膜本身就含有丰富的磷脂和胆固醇等脂性材料，在一定的缓冲条件下能够自组装形成脂质体纳米粒，并使多种机制融于一体，协同发挥作用[Westerman LE，Jensen PE.Liposomes composed of reconstituted membranes forinduction of tumor-specific immunity.Methods Enzymol.2003；373118-27]。
纳米粒疫苗有效解决了肿瘤疫苗整合多种免疫机制的技术难题，将多种机制有效地融于一体，使多种分子元件能够有效地组装到一个简单的开放性系统，为肿瘤抗原提供了良好的负载、支撑、递呈和佐剂功能，有利于融合多种作用机制，协同性发挥作用，达到更好地激发机体免疫系统的目的。
与单独的蛋白质疫苗或DNA疫苗相比，同时含有多种蛋白质或基因形式分子元件的自组装复合纳米颗粒肿瘤疫苗在免疫效应功能上更具优势，能够融合多种作用机制，协同性发挥作用。首先由GM-CSF等免疫调节分子趋化和诱导DC细胞，加工递呈蛋白质抗原，实现初次免疫。纳米颗粒疫苗中其它免疫分子可以动员局部的免疫细胞，形成活跃的免疫微环境。接着含有肿瘤抗原成分和各种免疫分子的基因在DC中进行表达，再次形成免疫冲击。由于首次免疫已经形成了活跃的免疫学微环境(包括刺激产生的各种趋化因子、细胞因子和抗体等)，第二次免疫冲击时将可能获得更好的效果。而且第一次免疫冲击是由蛋白质抗原完成的，容易激发体液免疫应答，第二次免疫冲击则主要是由DNA疫苗形式的抗原完成的，有利于激发细胞免疫应答。因此，自组装复合纳米颗粒肿瘤疫苗一次免疫注射，至少能够形成两次免疫冲击，免疫应答的效果也呈递进式上升。既能够有效地激发体液免疫应答，也能够有效地激发细胞免疫应答。在上述自组装复合纳米颗粒肿瘤疫苗的结构中，融合了肿瘤靶向分子及相关攻击元件，通过肿瘤靶向分子，捕获体内的肿瘤细胞，在对残留的肿瘤细胞实施打击的同时，也在体内对其进行免疫学标记和修饰，使之成为具有个体特异性的活疫苗。
本发明涉及的自组装复合纳米颗粒肿瘤疫苗可以通过以下方法制备1、构建通用肿瘤疫苗真核表达载体pCI-Pr-GPI
如图2所示，pCI-pr-GPI是在真核表达质粒pCI-neo原多克隆位点NheI和NotI之间插入通用序列构建而成的。通用序列的基因顺序为5’-鱼精蛋白片段基因-人IgGFc-GPI-3’。外源免疫分子基因可以方便的插入NheI和EcoRV位点中进行克隆表达。除pCI载体多克隆位点NheI和NotI之间插入的相关基因元件外，pCI-pr-GPI含有pCI载体的整个骨架结构，如CMV早期启动子、嵌合内含子、Neo筛选标记、SV40增强子、氨苄抗性基因Ampr等。
2、获得多种稳定表达各种分子元件的肿瘤细胞株综合考虑免疫系统的激活条件，获得相关肿瘤复合靶抗原、免疫调节分子的基因，插入上述通用载体上，分别转染肿瘤细胞，筛选获得多种稳定表达相关分子元件的肿瘤细胞株。表达的分子元件为融合蛋白，其羧基端连有IgG Fc和鱼精蛋白，最后通过GPI结构锚定于肿瘤细胞膜上。IgG Fc除了可用于表达后的荧光检测，本身还有吸引巨噬细胞、刺激免疫应答的功能。鱼精蛋白含有丰富的正电荷，可与DNA质粒高亲和力结合。
3、自组装纳米颗粒疫苗将表达不同分子元件的肿瘤细胞混合，通过低渗方式去除细胞内成分，离心获得细胞膜，用细胞裂解液裂解，获得膜脂质，富含GPI锚定表达的多种分子元件，包括肿瘤抗原和免疫调节分子；在一定的缓冲条件下，与表达不同分子元件的真核表达质粒孵育，通过鱼精蛋白结合核酸，有由膜脂质、蛋白分子与核酸共同作用，形成自组装复合纳米粒疫苗。
本发明的特点及优点如下突破了整合多种分子元件于一体的技术瓶颈，将蛋白质疫苗和DNA疫苗有机地融为一体，使多种功能分子元件及蛋白质、核酸等多种物质形态，能够有机融合到一个开放性的免疫增效系统，为靶抗原提供了良好的负载、支撑、递呈和佐剂功能，有利于使多种作用机制，协同性发挥作用。同时，本发明在工艺上巧妙避开了常规生物技术药物所不可避免的蛋白质纯化等复杂昂贵的工艺，有利于进行产业化开发和应用。
附图简要说明图1为自组装复合纳米颗粒肿瘤疫苗结构示意2为通用肿瘤疫苗表达载体pCI-pr-GPI示意3为pCI-pr-GPI-GM-CSF酶切鉴定图1、DL-2000marker2、pCI-GPI-GM-CSF酶切后结果3、pCI-GPI-GM-CSF PCR结果图4为pCI-pr-GPI-GM-CSF锚定表达示意5为自组装复合纳米颗粒肿瘤疫苗的透射电镜照片(颗粒大小为100-300nm)具体实施方式
本发明更详细的实施方法可参见实施例，本实施例是用于解释、而不是以任何方式限制本发明。
实施例一、通用肿瘤疫苗表达载体pCI-pr-GPI的构建和鉴定1、确定通用序列按照技术方案，通用序列的顺序为5’-NheI-EcoRV-G-G-G-鱼精蛋白基因-IgG Fc-GPI-Not-3’。免疫调节分子基因插入NheI-EcoRV酶切位点之间，由3个G组成的连接臂使表达的分子具有一定的空间自由度，易于保持其天然活性。整个通用序列的基因共有1472bp，序列如下GCGGCTAGC(NheI)GATATC(EcoRV)GGAGGGGGA CGCTCCCAGTCCCGGAGCAGATACTACAGGCAGCGCCAGAGAAGCCGGAGGCGCAGAAGAAGGTCC GTTGGTGAGAGCTCAGCGCTCCTGCCTGGACGCATCCCGGCTATGCAGCCCCAGTCCAGGGCAGCAAGGCAGGCCCCGTCTGCCTCTTCACCCGGAGGCCTCTGCCCGCCCCACTCATGCTCAGGGAGAGGGTCTTCTGGCTTTTTCCCCAGGCTCTGGGCAGGCACAGGCTAGGTGCCCCTAACCCAGGCCCTGCACACAAAGGGGCAGGTGCTGGGCTCAGACCTGCCAAGAGCCATATCCGGGAGGACCCTGCCCCTGACCTAAGCCCACCCCAAAGGCCAAACTCTCCACTCCCTCAGCTCGGACACCTTCTCTCCTCCCAGATTCCAGTAACTCCCAATCTTCTCTCTCCAGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGGTAAGCCAGCCCAGGCCTCGCCCTCCAGCTCAAGGCGGGACAGGTGCCCTAGGGTAGCCTGCATCCAGGGACAGGCCCCAGCCGGGTGCTGACACGTCCACCTCCATCTCTTCCTCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGTGGGACCCGTGGGGTGCGAGGGCCACATGGACAGAGGCCGGCTCGGCCCACCCTCTGCCCTGAGAGTGACCGCTGTACCAACCTCTGTCCCTACAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCTTAAGTCCGGGAAAA GGCAGCGGCACCACCAGCGGCACCACCCGCCTCCTGAGCGGCATGACCTGCTTCACCCTGACCGGCCTGCTGGGCACCCTGGTGACCATGGGCCTGCTGACCTAAGCGGCCGC(NotI)GCG通用基因序列设计后，委托上海生工生物工程有限公司进行全序列合成。
2、通用序列插入pCI载体双酶切上述通用基因片段和用碱变性法提取的质粒pCI-neo(构自Invitrogen公司)，分别用NheI和NotI双酶切。酶切体系还有10×缓冲液(H)4μl，10u/μl的NotI 2μl，10u/μl的NheI 2μl加水至总体积40μl，37℃水浴8小时。酶切后产物割胶回收目的片段，具体方法参见华舜试剂盒说明书。
插入连接取1.5ml灭菌Eppendorf管加入双酶切后质粒pCI和通用基因片段各1μl，10×T4DNA连接缓冲液1μl，T4DNA连接酶(12u/μl)1μl，加灭菌双蒸水至15μl，16℃过夜。
3、转化和表达无菌取100μl感受态细胞(HB101菌株按《分子克隆》—科学出版社，第二版的CaCl2方法制备)，至于冰浴中，加入连接产物8μl，轻轻旋转以混匀内容物，在冰浴中放置30分钟，立即转移到42℃水浴中静置2分钟，然后每管加入0.5ml不加抗生素的LB培养基，37℃水浴15分钟后，30℃摇床轻摇45分钟；取200μl转化菌体，均匀涂布于含有100mg/ml氨苄的琼脂平板培养基上，在超净工作台吹干约10分钟，37℃倒置培养过夜。
从平板中挑取菌落约10个，分别接种于含100mg/ml氨苄LB培养基中(5ml/管)，32℃摇床培养过夜。次日4、载体的鉴定取1μl过夜培养菌采用PCR法进行初步鉴定，引物选用pCI载体中的sp6和t7一对测序引物。PCR进行PCR扩增，扩增体系为10×Buffer 5μl，R1、F1各1μl，4dNTPs(2.5mM)4μl，Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.5μl，加水至50μl。(Taq DNA聚合酶、Buffer、dNTPs均购自于Tacara生物技术有限公司)。PCR扩增反应94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分，共30个循环。
根据1.5％琼脂糖凝胶电泳结果选取阳性克隆，并进一步用酶切鉴定后，进行序列测定。测序结果证明通用基因序列已正确无误地插入了pCI载体中，即通用肿瘤疫苗表达载体pCI-pr-GPI构建成功。
实施例二、获得锚定表达相关分子元件的肿瘤细胞株(以GM-CSF/Renca为例)1、GM-CSF基因的获得根据gene bank上GM-CSF基因序列设计引物，委托上海生工生物工程有限公司合成F1GCGCTAGCAGCCTCTCAGCACCCACCCGCTCACC，R1GC GATATCTTTTTGGACTGGTTTTTTGC。
提取小鼠PBMC细胞用5ug/ml的ConA诱导4hr，提取总RNA进行RT-PCR，具体方法参见Introgene Trozol试剂盒说明书。PCR扩增后在分子量为400bp处有条带出现，测序为GM-CSF基因。
2、pCI-pr-GPI/GM-CSF重组质粒的获得PCR扩增后产物纯化后和质粒pCI-pr-GPI分别用NheI、EcoRV双酶切，然后使酶切后的基因和质粒连接、转化后用PCR法和双酶切法进行鉴定，获得pCI-pr-GPI/GM-CSF重组质粒。具体操作均同实施例一所述3、重组质粒pCI-pr-GPI/GM-CSF转染Renca细胞Renca细胞为本研究室保存的Balb/c小鼠来源的肾癌细胞系。Renca细胞转染前传代，接种于六孔板上，使次日细胞能铺满孔底面地70％，转染步骤按Invitrogen公司的Lipofectamine2000 Reagent说明书进行。分别取1μg质粒，用无双抗DMEM培养基稀释到250μl，为A液；另取7μl Lipofectamine2000用无双抗DMEM培养基稀释到250μl，为B液，将B液室温放置5分钟后，立即将A液B液轻轻混匀，为C液，室温放置20分钟。取出六孔板用新鲜培养基洗一次后，每孔加入2.5ml新鲜培养基。将C液分别加入到各孔中，混匀，置CO2培养箱培养。转染48小时后，至细胞密度达到50-70％融合时，弃培养液，换用含有G-418(400μg/ml)培养基进行抗性筛选，同时用未转染的细胞作对照。当对照细胞几乎全部死亡时，G-418的浓度降至200μg/ml以维持筛选作用。待2wk左右出现阳性细胞克隆时，扩大培养进行后续实验。
收集pCI-pr-GPI/GM-CSF和空载体pCI-pr-GPI/GM-CSF转染的Renca细胞，用4℃预冷的PBS(含20ml/L小牛血清)洗涤3次，加入荧光标记的羊抗鼠GM-CSF(1∶1000稀释)，于冰浴中震荡孵育45min，再用PBS洗3次。加5g/L多聚甲醛固定后，于荧光显微镜下观察并照相，结果证明pCI-pr-GPI载体能够很好地将GM-CSF表达在宿主细胞膜上(图4)。
实施例三、自组装复合纳米颗粒疫苗1、获得多种相关分子元件锚定表达的细胞膜收集多种相关分子元件修饰的Renca细胞共108个，用含有蛋白酶抑制剂的低渗buffer(25mmol/L Tris-HCl.PH7.4)裂解细胞，用27号针头(4.5号)抽吸3次以上，混匀2,300rpm(2,000g)离心10min，取上清(含有膜成分)。25,400rpm(22,000g)离心30min，取沉淀。
2、复合纳米粒疫苗的形成用溶液I(0.15mol/L NaCl，10mmol/L Tris，pH8.0)洗两次，用溶液II(0.14mol/L NaCl，25mmol/L Tris-HCl，pH7.4，其中含有2％1-S-Octyl Beta-D-thioglucopyranoside)溶解，达到浓度相当108个/mL，4℃震荡30min。离心取上清，取质粒DNA100μg，加入上述含膜脂质及锚定表达的阳离子融合蛋白质的溶液中，用透析液(0.14mol/L NaCl，25mmol/LTris-HCl，pH7.4)透吸过夜，更换三次透析液，收集形成的复合纳米颗粒疫苗。电镜观察颗粒大小。
权利要求
1.一种自组装复合纳米颗粒肿瘤疫苗，其特征在于由肿瘤细胞膜脂质、蛋白质分子元件、DNA质粒三种成分自组装形成的纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述，组成肿瘤疫苗的蛋白质分子元件，含有肿瘤抗原分子、免疫佐剂分子的一种或几种，通过GPI与细胞膜脂质成分连接。
3.根据根据权利要求1所述，组成肿瘤疫苗的DNA质粒成分中，含有肿瘤抗原分子、免疫佐剂分子的一种或几种。
4.根据权利要求2所述，在组成肿瘤疫苗的蛋白质分子元件中，融合有来源于鱼精蛋白的阳离子蛋白片段，可与含阴离子电荷的核酸结合，结合一种或几种含有肿瘤抗原分子、免疫调节分子DNA质粒。
5.根据权利要求2，组成肿瘤疫苗的蛋白质分子元件，融合有来源于人免疫球蛋白的IgGFc蛋白片段。
6.根据权利要求2，蛋白质形式的肿瘤抗原分子、免疫佐剂分子的一种或几种，通过GPI与细胞膜脂质成分连接。
7.根据权利要求2和3，肿瘤抗原分子包括特异性肿瘤抗原和抗转移和血管靶点的抗原；免疫佐剂分子包括GM-CSF、IL-2、B7、4-1BBL、SLC、CD40L、FL等。
8.根据根据权利要求1所述，自组装靶向复合纳米颗粒肿瘤疫苗的制备方法，包括以下步骤1)通用锚定真核表达载体的构建；2)构建含有不同分子元件基因的锚定表达载体；3)含有不同分子元件基因的锚定表达载体，转染相应的肿瘤细胞株，并鉴定分子在细胞膜表面的锚定表达情况；4)收获上述细胞的细胞膜成分；5)细胞膜裂解成含有锚定形式蛋白质分子元件的膜脂质成分，与含有肿瘤抗原分子、免疫调节分子的DNA质粒混合，在一定的缓冲条件下自组装形成纳米颗粒肿瘤疫苗。
9.根据权利要求8，通用表达载体为pCI-pr+-GPI，含有来源于鱼精蛋白的阳离子蛋白片段基因序列、来源于人免疫球蛋白的IgGFc蛋白片段基因序列和GPI信号肽基因序列。并保留pCI-neo载体的骨架结构，如CMV早期启动子、嵌合内含子、Neo筛选标记、SV40增强子、氨苄抗性基因Ampr等。
全文摘要
本发明公开了一种自组装复合纳米颗粒肿瘤疫苗及其制备方法。本发明公开的自组装复合纳米颗粒肿瘤疫苗是由肿瘤细胞膜脂质、蛋白质分子元件、DNA质粒三种成分组成的。它是将肿瘤抗原分子、免疫佐剂分子等各种分子元件构建到真核表达载体上，分别锚定表达在肿瘤细胞表面，然后将表达有关分子元件的细胞进行混合，提取收获细胞膜，将细胞膜裂解成含有锚定形式蛋白质分子元件的膜脂质成分，与含有肿瘤抗原分子、免疫调节分子的DNA质粒混合，在一定的缓冲条件下自组装形成纳米颗粒肿瘤疫苗。本发明所提供的制备自组装复合纳米颗粒肿瘤疫苗的技术和方法，可用于设计和制备多种恶性肿瘤的治疗性疫苗，也可用于各类传染病及非传染病疫苗的制备。
文档编号A61K39/395GK1927401SQ20051009588
公开日2007年3月14日 申请日期2005年9月7日 优先权日2005年9月7日
发明者于继云, 修冰水, 阎瑾琦, 刘荷中, 陈兴, 刘颖, 黄悦, 胡巍 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所