专利名称：用于分化干细胞的方法及其在牙病治疗中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于产生分化的哺乳动物细胞的新概念和方法，所述 分化的哺乳动物细胞可被植入以修复牙周炎和其他牙病，其中这些细
胞具有与分化的牙周韧带干细胞(例如，PDLC)或牙周韧带细胞(PDL) 相同的特征和行为。PDL将根部牙骨质与牙槽骨相连接，并且对于牙 周伤口愈合是重要的。
背景技术：
骨髓被认为是"干细胞储备"的主库(predominant pool)，其 不仅包含造血干细胞(HSC)而且还包含内皮和间充质干细胞(ESC， MSC )。本发明包括的一个目标领域是获得待分化成合适的自体细胞和 /或合适的同种异体细胞的合适细胞材料，所述细胞已转化成能够被移 植入受者中而不被排斥或引起移植物抗宿主反应的细胞类型。
例如可以想象的是，除了别的可通过例如转分化(例如通过共培 养，例如将细胞与牙周韧带组织或来源于牙周韧带组织的因子共培养) 而转化的细胞类型外，尤其是任何间充质成骨细胞或者甚至成骨细胞 或成纤维细胞镨系的前体细胞和祖细胞可用于产生PDL细胞。
先前已公开了造血细胞的方法、组合物和用途。造血细胞是当与 成骨细胞共培养时可分化成成熟血细胞的细胞。特别地，通过将细胞 与成骨细胞共培养来繁殖造血细胞并保持其未成熟形态的方法公开于 美国专利#5733541。
成骨细胞提供了繁殖造血细胞并保持其未成熟形态的细胞因子和 /或^:环境。造血细胞可用于治疔某些血液相关病症和可用于治疗需要造血细胞的患者。
本发明的一个目的实际上不是保持造血细胞的未成熟形态，而是 例如通过暴露于或与牙周韧带组织或来自牙周韧带组织的因子共培养 来转分化间充质干细胞(例如来自胯带或脐带血的间充质干细胞)、 成骨细胞和相似镨系的细胞，以获得具有例如下列特征的间充质干细
胞显示出骨桥蛋白和骨钙蛋白的表达增加，同时显示出骨唾液蛋白 (BSP)的表达减少，从而导致与PDL细胞类似或相似的细胞群。这在
非常罕见的。
^雜4脊扭勿應时^射
在将单种多能成体祖细胞注射入早期胚泡后，发现所述细胞贡献 了来自所有3个胚层的大部分体细胞类型。此外，骨髄来源的造血前 体细胞似乎存在于非造血组织中，例如由McKinney-Freeman等人 (McKinney-Freeman SL， Jackson, KA,等人，PNAS USA (2002) 99: 1341 )描述的肌肉组织。
已在基质层(stromal layer)内观察到成骨细胞样细胞，所述细 胞与基质细胞系共有几种表型特征(Benayahu D等人，Calcif Tissue Int. (1992)， 51: 195-201; Benayahu D等人，Calcif Tissue Int. (1991)， 49:202-207; Mathieu E等人，Calcif Tissue Int. (1992)， 50: 362-371 )。例如，鼠类骨髓基质细胞系BMS2共有许多成骨细胞标 记物，包括高碱性磷酸酶、胶原(I )和骨桥蛋白，以及骨唾液蛋白(BSP) 的增加，这不是牙周韧带干细胞或牙周韧带细胞的特征。此外，在也 显示出骨唾液蛋白(也称为骨唾液蛋白II pr (BSP))的表达增加的 BMS2细胞(一种鼠类基质细胞系)中也检测到骨钙蛋白(一种成骨细 胞特异性蛋白)的mRNA ( Dorheim MA等人，J Cell Physiol. (1993) 154: 317-328 );根据Dorheim等人，甚至前脂肪细胞和脂肪细 胞可展示出这些成骨细胞特征。
在使用几种基质细胞系的系列实验中，Benayhu等人发现，被检 查的所有细胞类型(MBA-1:成纤维细胞，MBA-2内皮样细胞，MBA-1'3纤维内皮细胞(fibroendothelial ) , 13F1. 1克隆的前脂肪细胞， MBA-15成骨细胞)具有一些成骨细胞特征，但在表达的程度上不同 (Benayahu D等人，Calcif Tissue Int. (1992)， 51: 195-201; Benayahu D等人，Calcif Tissue Int. (1991)， 49:202-207 )。已 发现，重组人骨形态发生蛋白-2在W-20-17鼠类基质细胞系中诱导成 骨细胞分化；异位骨髄移植实验清楚地证明，新形成的骨髄基质和骨 来源于供体，而血细胞是宿主来源的(Reddi AH， Coll Relat Res. (1981)1:209-226; Kataoka H， Urist MR, Clin Orthop Relat Res. (1993)， 286: 262-270 )。
骨祖细胞来源于骨髄这样的观察结果为造血祖细胞和成骨细胞之 间的功能关联提供了进一步的证据。几位研究者已说明，原代和转化 的骨髓基质细胞可以获得成骨细胞表型，因为在将这些细胞植入扩散 盒后在体内观察到骨形成(Grigoriadis等人J Cell Biol. (1988) 106: 2139-51 )。非粘着低密度骨髓细胞在无血清条件中的体外温育也 可发育成成骨细胞样细胞，这些细胞可矿化它们的细胞外基质(Long 等人，1990;和Campbell等人，1987 )。
上述文献基本上将成骨细胞描述为通过产生可能在造血谱系的特 定刺激方面有所帮助的细胞因子和其他因子来刺激细胞的来源。
然而，本发明的范围是形成主要可用于修复牙疾病(例如牙周炎) 的细胞类型，例如PDL细胞或具有PDL特征的细胞，所述细胞可以为 同种异体来源的、成熟或未成熟的，但优选在谱系中不比脐带或脐带 血的水平更低。事实上涉及可以例如通过共培养人牙周韧带干细胞和 来源于脐带或来源于骨髓的干细胞的组合来转分化的任何间充质细 胞。备选地，可从来自臼齿或来自智牙的牙周韧带中分离和培养用于 用作PDL或PDLC这一目的的任何间充质细胞或干细胞。
发明概述
在一个方面，本发明提供了一种方法，所述方法用于繁殖直接从牙齿收获的PDL细胞以例如用于自体使用，或理想地繁殖间充质细胞， 所述间充质细胞当植入口腔，更特别地植入牙周区域和更加特别地植 入牙齿区域以固定和/或修复牙齿以及牙齿的牙周区域时不被排斥，尤
PDL或PDLC的细胞。该方法可通过下列方式来起始将来源于牙周韧
共培养:并i从某i蛋:质的表达的观:泉上看，导致产生具有与蛋白
质的表达相关的能力的间充质细胞，例如至少HLA-DR阳性(HLA-DR+)、 CD-34阴性(CD—34-) 、 Lin阳性(Lin + ) 、 Thy-l P日性(Thy-l+)、 Stro-l阳性(Stro-l +) 、 CD13阳性、CD44阳性、CD90阳性、CD73 阳性和还可能CD146/MUC 18阳性(CD146/MUC 18 +)的细胞。这些干
充质干细胞或祖细胞而对于受者具有较弱的免疫原性。
本发明的公开内容
本发明涉及用于获得具有PDL细胞的特征的哺乳动物间充质细胞 系的新概念和方法。获得的细胞是并且将持续是HLA-DR阳性 (HLA-DR+) 、 CD-34阴小生(CD-34-) 、 Lin—1阳'l"生(Lin-l +) 、 Thy-l 阳性(Thy-l+) 、 STR0-1阳性(STRO-l+) 、 CD13阳性、CD44阳性、 C謂阳性、CD73阳性和还可能CD146/MUC 18阳性(CD146/MUC 18 +) 的。这些细胞优选是牙周韧带细胞，或者未成熟的牙周韧带干细胞类 型或优选人牙周韧带干细胞(hPDLC )类型，或者来自脐带血或优选来 自人脐带血的未成熟基质或间充质细胞，所述细胞僻如通过共培养， 例如与牙周韧带组织或来自牙周韧带组织的因子一起共培养而获得。
细胞也可以具有生骨性细胞来源，其当暴露于或在牙周韧带组织或来 自该组织的因子中培养时，显示出PDL细胞的特征。在理论上，牙周 韧带细胞和/或牙周韧带干细胞的特征在于骨钙蛋白和骨桥蛋白的表 达，和最可能在于骨唾液蛋白的表达减少或甚至缺乏表达，而这种表达在成骨细胞培养物和成软骨细胞培养物中通常观察到。
具有PDL特征的细胞适合用于修复或治疗牙病症，特别是牙周炎。 为了获得可预测的牙周再生，PDL细胞的选择性粘着和增殖是必 需的。这些类型的细胞可修复受损的牙周韧带(例如，牙周炎和相似 的病症)以及同时例如产生将纤维组织与骨连接起来的牙骨质，并且 可以能够治疗牙周缺损，从而重建由于牙周炎而处于丧失危险中的牙 齿粘着。
根据本发明，这些PDL细胞(其中首先是特化的细胞)是可用于 上述修复(例如牙周炎等的修复)的细胞培养物的起始材料。当然， 如果这些细胞是自体的，则是优选的，这意味着其是在将牙齿拨出的 同时从牙齿例如智齿收获的，因而可在拨出之时立即收获细胞，或者 可将拔出的牙齿在运输培养液中在例如24小时内送至实验室，然后可 收获PDL细胞，并且立即进行培养或在液氮罐中深度冷冻以待以后使 用。
其他细胞也可能用于相同的目的，例如从患者的颌骨或其他骨结 构收获的自体或同种异体的成骨细胞。这些间充质前体细胞或祖细胞， 也可用于修复牙周炎等的目的。可来源于源自脐带或脐带血的多能间 充质干细胞的另外一组细胞也可以作为自体细胞(取自贮存的脐带血， 并后来在生命中用于修复在出生时提供了他/她的脐带血的患者的牙 周炎)而得到。或者，来自其他个体的脐带的这些多能间充质干细胞 可能在具有免疫原性方面显示出较低的倾向，从而可用作"供体"细 胞以修复牙周炎等，当使用此类细胞时，它们已经历共培养过程，其 中将细胞暴露于或与一种或多种牙周韧带组织、来源于牙周韧带组织 的牙周韧带蛋白质或因子一起共培养以获得PDL特征。
将适合用作PDL细胞或PDLC的细胞与其他哺乳动物间充质前体细 胞(例如，任何哺乳动物间充质干细胞例如成体间充质前体细胞)共 培养，在本发明的范围之内。根据本发明，也可能将PDL细胞例如与 多能间充质千细胞(例如来源于脐带或脐带血的此类千细胞)共培养， 这样，可获得适合用于修复牙周炎等的经共培养的细胞。为了获得牙周韧带干细胞群，可将间充质干细胞与牙周韧带组织、 来自牙周韧带组织的牙周韧带蛋白质或因子在牙周细胞含量存在或不 存在的情况下共培养，或者更确切地说可以通过首先在经收获以待加 入至培养基中的牙周韧带组织中消除存在的活细胞，在所述培养基中
将会培养间充质细胞以分化或转分化成PDL细胞。预期培养可从将细 胞短时间暴露于牙周韧带组织或蛋白质，变化至将细胞培养物在至少 包含牙周韧带组织、其牙周韧带蛋白质或因子的培养基中完全扩展并 持续数周直至获得足够量的细胞。这种细胞培养方法可用于来源于脐 带和/或脐带血的间充质干细胞。因此，来自脐带或来自脐带血的间充 质干细胞与牙周韧带组织、来源于其的牙周韧带蛋白质和/或因子一起 可诱导间充质干细胞以获得牙周韧带样特征，从而可在用于修复和再 生牙周组织的临床应用中用作具有或不具有支架的细胞植入体。 -嘑#乙^#/《茏{细應
通过将这些细胞暴露于和/或与牙周韧带组织或来源于牙周韧带 的因子共培养可将PDL细胞以及任何上述组合的间充质干细胞或前体 细胞分化成PDL或PDLC,所述牙周韧带组织或来源于牙周韧带的因子 可诱导前体细胞，或者阻止诸如PDL的细胞去分化。
因此，应当理解并且在本发明的范围内的是上述细胞类型在当 暴露于牙周韧带组织或来源于牙周韧带的因子、与其共培养和/或由其 诱导时，可分化或转分化成PDL或PDLC，或者如果它们一开始实际上 就是PDL时，这些细胞将不进行去分化。当在培养基中使用时，当使 用该培养基共培养来自脐带的间充质干细胞时，相同的收获的牙周韧 带组织或来源于该组织的因子可导致产生PDL或具有与PDL相同能力 的细胞，从而使得能够使用它们来治疗牙周炎等。
通过使用上述方法，可使本发明者能够培养成骨细胞或生骨性细 胞(osteogenic cells)的祖细胞(例如通过来自哺乳动物(例如来 自骨，尤其是从患者获得的骨结构)的活检组织的外植而获得的)以 发展成PDL或具有PDL行为的细胞，以便后来在患者的生命中治疗牙 周炎，这意味着当人们无法获得PDL的原代培养物时，可以以这种方式采用自体细胞植入方法。
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牙周韧带组织、来源于牙周韧带的牙周韧带蛋白质和/或因子的来 源可以是自体、同种异体或异种来源的(例如，拨出的或撕脱的猪牙 齿)。然而，预期来自牙周韧带的细胞、牙周韧带或因子的处理必须 在当组织仍然具有活力并且没有经历任何必需组分的分解时进行收获
和处理，所述必需组分是对于获得和可能对于保持培养的细胞如PDL 或PDLC或者将其本身表现为PDL或PDLC的细胞所需要的。在"牙周 组织的收获和保存"中描述了关于操作牙周组织的建议。
例如可从臼齿或从智齿收获牙周韧带，其在培养基中使用以在所 述培养的细胞中诱导"PDL效应"。这样，可将牙周韧带与已整合入 在牙周韧带中的PDL细胞一起收集，或者牙周韧带组织被除尽了这些 细胞，并且由牙周韧带组织组成，或甚至为来源于牙周韧带组织的因 子，以便将来用于PDL细胞培养或用于尝试将上述的其他间充质细胞 转分化成PDL。
根据本发明，所述"牙周韧带组织"可定义为加入至PDL细胞培 养物或间充质细胞培养物(希望被用作PDL细胞)中的诱导性混合物。 可将其进行深度冷冻(例如在液氮罐中)贮存，或进行使用，在使用 时，可将其直接与合适的生长介质(培养基)混合在一起，在所述生 长介质中，培养细胞以防止PDL细胞去分化成其他非PDL细胞，以及 分化或转分化其他所选择的细胞从而变成PDL或PDLC或者与PDL或 PDLC相似。因此，包含牙周韧带组织或来自牙周韧带的因子的所述培 养基组合物可用作生长培养基，该培养基可保持PDL细胞，从而避免 去分化或细胞"漂移(drifting)"。
如先前所描述的，也可收获、表征和汇集该牙周韧带组织(例如 被除尽了细胞)，以便与培养基一起用于培养间充质细胞以诱导PDL 细胞特征，从而产生可表征为牙周韧带细胞或所述类型的前体细胞的 所述细胞群。例如通过借助于牙周韧带组织的诱导用途从间充质细胞进行分化而获得的PDL细胞特征可通过显示出下列状态来证明所述 PDL或PDL样细胞将显示出骨桥蛋白和骨钾蛋白的表达增加以及骨唾 液蛋白(也称为骨唾液蛋白II)的表达减少(减少的BSP表达)。 f^iff织的仅^和保存
为了以对于诱导、转分化或转化间充质细胞以产生牙周韧带细胞 或行为与牙周韧带细胞类似的细胞来说所需要的量使用牙周组织，可 能必需准备后勤系统(logistic system)以使拨出的牙齿(例如，从 各种牙科诊所收集的拨出的智齿)的细胞保持存活以及阻止来自拨出 的牙齿的牙周组织分解，这很可能意味着使拨出的牙齿保持存活并且 保持在无菌条件下以防止微生物污染(可以通过使用尽可能无菌的方 法和加入足够量的在运输介质或用于贮存的培养基中存在的抗生素和 抗真菌剂来使微生物污染保持在最低限度)。Sigalas等人最近已测 试了使撕脱的牙齿的细胞保持存活的方法。已检查了作为用于撕脱的 牙齿的可能贮存培养基的许多溶液。Sigalas等人最近报导，在室温 下和在水上将人牙周韧带(PDL)细胞暴露于培养基、牛奶、Hanks平 衡盐溶液(HBSS) 、 SoftWear、 Opt i Free和Solo Care接触镜溶液、 Gatorade和自来水1小时。在暴露后即刻(0小时)以及在第24和第 48小时使用台盼蓝排除技术计数活细胞的数目，在处理后测试细胞的 增殖能力(Sigalas E， Regan JD等人Dent. Traumatol. (2004) 20:21-28 )。本研究显示，发现Hanks平衡盐溶液HBSS对于撕脱的牙 齿来说是最佳的贮存介质。可以想象许多其他类型的培养基，其加入 或不加入从一始就存在和最可能包含血清蛋白的牙周韧带组织。可将 牙齿、牙周韧带相关细胞或牙周韧带组织在液氮罐中深度冷冻。
用于确定细胞未分化成PDL或PDL细胞已去分化或飘移的方法表 明骨唾液蛋白(也称为骨唾液蛋白II或BSP)将增加，从而实际上证 明经培养的细胞事实上是成骨细胞而肯定不是PDL细胞。实际上，当 骨唾液蛋白II或BSP可以被鉴定(或显示增加)时，可意识到该PDL 细胞培养物已变成了生骨性细胞(例如，成骨细胞和非PDL-或非PDLC-分化的间充质细胞)(Fisher LW， McBride 0W，等人J. Biol.Chemistry (1990)， 265:2347-2351 )。由该基因编码的BSP蛋白是 骨基质的主要结构蛋白。其在人骨中构成了大约12%的非胶原性蛋白， 并由骨骼相关细胞类型(包括肥大软骨细胞、成骨细胞、骨细胞和破 骨细胞)合成。该蛋白质通过其酸性氨基酸簇结合钓和羟磷灰石，并 且通过识别玻连蛋白受体的RGD序列来介导细胞附着。BSP基因也被 鉴定为基因ID: 3381，并且表达结合整联蛋白的唾液蛋白(骨唾液蛋 白，也称为骨唾液蛋白II，缩写为IBSP)。我们先前通过Affymetrix Gene Chip分析已发现，在来自骨关节炎患者和非-O. A.患者的软骨细 胞中也存在玻连蛋白受体的表达(自己的观察)。然而，该表达至今 仍未在PDL或PDLC中测试到。
以下也在本领域的范围内被植入以用于牙周修复和/或牙修复的 细胞可以是自体间充质干细胞、前体细胞或祖细胞(例如从牙周区域 或牙周韧带中作为干细胞或前体细胞而收获的)，或者甚至来源于颌 骨活检组织的间充质细胞在当暴露于牙周韧带组织时也可向PDL分 化。因此，在理论上和实际在实践中，我们可使用外植体培养技术来 扩展间充质细胞或者更确切地成骨细胞或其前体以产生PDL细胞。然 后，可将这些PDL细胞用于植入患者中，以修复牙周炎等。
可以期望这些细胞进一步分化成哺乳动物间充质细胞(这可能包 括在相当复杂的过程中)，从而产生与哺乳动物间充质细胞系相似的 细胞身份(cell identity )，这种身份可通过继续地表现为至少HLA-DR 阳性(HLA-DR+) 、 CD-34阴性(CD-34-) 、 Lin-l阳性(Lin-l+)、 Thy-l阳性(Thy-l+)和Stro-l阳性(Stro-l+) 、 CD13阳性、CD44 阳性、CD90阳性、CD73阳性和可能地对于另一种蛋白质CD146/MUC18 是阳性的，但对于CD31 (造血细胞标记物)是阴性的来鉴定。
在本发明的范围内的是获得一种或几种哺乳动物细胞类型，所述 细胞类型可移植入哺乳动物(包括人)中而不引起移植的或植入的细 胞的排斥或者产生"移植物抗宿主"(GVH)排斥，既不发生细胞凋亡 也不诱导细胞凋亡，或当被移植时，不会转变成永生化细胞系。
当使用胚胎间充质干细胞进行例如关节中的植入，以试图发展用于软骨或0. A.修复的方法时，此类使用胚胎间充质干细胞的植入已显 示，这些细胞可在实验中在分化成混合的内胚层-中胚层-外胚层细胞 期间保持转化的功能，所述细胞在显著量的SCID小鼠中具有表现为畸 胎瘤的永生化行为，其中所述胚胎干细胞实际上诱导了这些永生化的 畸胎瘤(Wakitani S， Takaoka K， Hat tori T， Miyazawa N， I籠aga T， Takeda S， Watanabe TK和Tanigami A， Rheumatology (2003)， 42: 162-165 )，这表明当例如为了产生牙周韧带细胞而使用成熟度更 低的细胞时，为了该目的可能更可取的是使用来自脐带或来自脐带血 的间充质干细胞而不使用胚胎干细胞，因为此类转分化可能实际上产 生肿瘤，例如畸胎瘤。
增加人脐带血(UCB )在成体同种异体移植中的应用的一个主要限 制因素是只可收集和输注少量的祖细胞。UCB的离体扩展可能有助于 克服该限制。UCB细胞的培养是否也可导致污染性母细胞的共扩展， 从而改变导致细胞排斥出现率增加的移植物特征，这一点到目前为止 仍未明了 ，但当使用来自脐带血的间充质干细胞时应当考虑这一点。
这可例如通过在包含干细胞因子(SCF) 、 flt-3L、 11-3、 IL-6、 EPO和G-CSF的标准培养基中起始UCB单核细胞(MNC)的培养，通过 探测分离间充质千细胞(例如UCB细胞)的方法来进行研究。为了解 决污染性母细胞的问题，可同时进行X和Y染色体的所谓分裂间期 FISH分析。可在第O天和在培养期间的几个时间点上就雌性(XX)细 胞来检查雄性(XY)脐带血样品。
获谬P见勿應的才法
将哺乳动物细胞，例如哺乳动物间充质细胞、同种异体哺乳动物 间充质细胞(包括UC或UCB细胞)、自体哺乳动物间充质细胞、自体 哺乳动物成骨细胞或成骨细胞的前体/祖细胞与一种或多种牙周韧带 组织、来源于牙周韧带组织的牙周韧带蛋白质或因子一起培养。使用 经缀合的抗CD13、 CD44、 CD90、 CD73和CD31的单克隆抗体通过流式 细胞术检查和分析这些细胞。标记物例如CD13、 CD44、 CD90、 CD73 全都被认为是间充质干细胞标记物，而CD31是造血细胞标记物。hPDLC被证明对于所有4种干细胞标记物都是阳性的，而对于CD31是阴性的。 如果使用牙周韧带组织，首先要使用例如本说明书的实施例l或 6中所描述的合适的培养基来培养该组织。在整个培养期期间定期例 如每1至5天，例如每3至4天更换生长培养基。在一段时间(通常 8至11天)后，细胞(hPDLC)从牙周韧带中迁移出来，并且在当达 到足够的汇合时，例如使用酶处理(如胰蛋白酶/EDTA处理)来收获 细胞。
在37'C和5% C02下，在合适的培养皿中培养哺乳动物细胞和hPDLC 细胞并饲以生长培养基(例如DMEM/F12，其包含16Y。FCS、抗坏血酸、 庆大霉素和两性霉素)。在整个培养期期间每3至4天更换生长培养基。
在8至11天后，细胞(称为hPDLC)通常开始从牙周韧带的小碎 片中迁移出来。当培养达到70-80%的汇合(大约3周)时，使用胰蛋 白酶/EDTA处理来脱离细胞，并将其用于下面描述的实验。
备选地，可在合适的培养皿中在包含FCS和其他上述成分的上述 DMEM/F12中培养哺乳动物细胞，在整个细胞培养期期间每3至4天更 换培养基，在11天或更长的时间后，可将此类因子例如牙周韧带蛋白 质作为诱导剂加入细胞中，其中人们试图将这些细胞转分化成PDL。
i束
当在移植或植入期间允许它们粘附时，培养在各种生物可降解的 支架上的骨细胞或生骨性细胞可在支架和细胞之间产生相互作用。这 尤其可以通过使用各种生物可降解的聚合物例如PLGA支架来实现。
将可预期，可测试几种类型的支架，并且所述支架可以能够成功 地用于牙周韧带细胞和/或牙周韧带干细胞或间充质干细胞，其已被诱 导以用作牙周韧带组织。
可将待植入的细胞与支架例如羟基磷灰石载体一起植入，所述支 架可以增强牙周韧带和甚至牙骨质，以及产生插入牙骨质和骨中并同 时使牙齿保持在原位的纤维结构(例如与沙比纤维(Sharpey，s fiber ) 相似的纤维结构)。
移控的减控入的叙敏^于浴^,^^的^途使用分化的或转分化的细胞的一个目的是发展出可用于例如治疗 被损坏的牙周组织(其尤其是由于"牙周炎"而引起的)的细胞或组 织材料。称为牙周炎的口腔病症通常作为例如在龈线中由微生物(例 如，细菌或真菌)感染引起的感染而开始，该感染被诊断为龈炎或急 性龈炎。这种类型的感染最初似乎是无害的，但在一段时间内该感染 可导致对于口腔来说必需的组织，特别是将牙齿与牙槽骨结合(与牙骨 质一起)的牙周韧带的坏死。该坏死尤其是由于组织破坏酶
(tissue-destructive enzyme )(例如胶原酶)的合成增加以及由破 骨细胞导致的骨组织腐蚀的激活而引起的。这些方法能够破坏那些通 常使牙齿锚定在上颌和下颌的骨中的组织结构(参见图1)。
这些方法可在很大程度上将牙周炎的治疗改变成细胞植入修复 (可能与支架一起)。
牙根精确地安装在健康牙周组织中的骨结构(牙槽骨)中的"口 袋，，中(参见图1)。牙齿通过牙周韧带保持在原位。
在牙周炎期间，实际上是牙周韧带受影响并最终导致牙齿松动， 如图2中所显示的。
因此，细胞治疗基于例如细胞(例如PDL和/PDLC)的离体细胞培 养，所述细胞可以以各种不同的方式例如如上所述通过暴露于或与牙 周韧带或其衍生物共培养而获得，或者通过将间充质干细胞群(例如 祖细胞或前体细胞)与骨细胞合并来产生，并且可以是其他类型的间 充质细胞如例如也可以与间充质干细胞(例如来自间充质多能干细胞 (例如来源于来自脐带或来自脐带血的细胞))相合并的PDL和/或 PDLC，所述间充质细胞可以是具有较小的产生反应例如细胞排斥的倾 向的同种异体细胞，或可以是自体来源的，从而不显示排斥的迹象。 自体间充质细胞可以是生骨性细胞来源的或甚至成纤维细胞来源的， 或者甚至为可从分化性间充质细胞获得的细胞类型中的任一类型。
也在本发明的范围内的是将待植入的细胞与合适的支架相组合, 从而可以塑造希望用于特&的应用区域的产品的形状并使之与所述区 域适配，以及甚至覆盖移植的细胞以保持它们的功能，保护它们免受
15感染和甚至限制细胞生长入口腔内的不希望的区域中。
图1.位于其齿窝中的牙齿的图。
图2.牙周炎，牙龈的慢性感染，其特征在于牙齿和颌骨之间的 附着的丧失始于称为龈炎的更温和的形式(参见"1")。
图3.显示了 hPDLC的亚汇合培养。当细胞达到70%汇合时，用胰 蛋白酶处理它们。
图4.在Beckman Coulter Epics XL流式细胞仪上分析样品。通 过前向和侧向散射门控从分析中排除死细胞和碎片。
图5.使用特定的染色方案就碱性磷酸酶活性对细胞进行染色和 研究，并且成骨分化显示于该图中。
在下列非限定性实施例中举例说明本发明。
实施例1 hPDLC培养
将人笫三磨牙置于皮氏培养皿中，将2ml生长培养基(包含16% FCS、庆大霉素、抗坏血酸和两性霉素的DMEM/F12)施加至所述磨牙。
用无菌解剖刀轻轻地从牙根表面分离出牙周韧带，并将组织转移 至新的皮氏培养皿中。
将2ml生长培养基施加至所述牙周韧带组织，并用无菌解剖刀产 生小的外植体。
将来自牙周韧带组织的外植体转移至包含生长培养基的75 cm2培 养瓶中，并在37。C下在C02培养箱中进行培养。分离在来自原代细胞 培养物的集落形成单位中的由外植体产生的细胞培养物。实施例2
表面标记物的表达
使用经缀合的抗CD13、 CD44、 CD90、 CD73和CD31单克隆抗体通 过流式细胞术来分析来自原代培养物(Ef。)(定义为还未传代的主要 从外植体长出的细胞的初始CFU)的hPDLC。
CD13、 CD44、 CD90、 CD73全都被认为是间充质干细胞标记物，而 CD31是造血细胞标记物。
hPDLC被证明对于所有4种干细胞标记物都是阳性的，而对于CD31 是阴性的。
这表明，hPDLC群体由间充质祖细胞组成。 实施例3
成骨分化(基因表达)
将hPDLC接种在6孔板中，并通过将培养基从正常生长培养基改 变成成骨培养基(包含10%FCS、抗坏血酸、l(TM地塞米松、8mMp-磷酸甘油的DMEM/F12)而诱导其沿着成骨途径分化。
作为对照，将hPDLC培养在包含10% FCS的正常生长培养基中。
在培养14天后，在PBS中洗涤hPDLC，并从经诱导的培养物和对 照培养物中分离RNA。
通过使用RT-PCR，评估碱性磷酸酶(ALP) 、 I型胶原(Coll )和 骨钙蛋白(OC)的表达。
实施例4
成骨分化(组织化学分析)
将hPDLC接种在6孔板中，并通过将培养基从正常生长培养基改变成成骨培养基(包含10% FCS、抗坏血酸、l(T M地塞米松、8 mM -磷酸甘油的DMEM/F12)而诱导其沿着成骨途径分化。作为对照，将 hPDLC培养在包含10% FCS的正常生长培养基中。
在培养14天后，在PBS中洗涤hPDLC—次。然后，就ALP活性或
染色)。 '-、'。 、" '；
对于经诱导的培养物，证明了 ALP活性增加和钙沉积增加，这支 持了基因表达的结果。
所有三个标记物在经诱导的培养物中上调；这证明hPDLC能够沿 着成骨途径分化，表明该细胞群由未成熟间充质干细胞组成。
实施例5 hPDLC的冷冻
用胰蛋白酶处理hPDLC，并通过70 iam无菌滤器进行过滤，之后 进行离心。将粒状沉淀重悬浮于冷冻培养基(FCS + 10% DMSO)中， 然后将细胞转移至冷冻管。
开始进行渐进的冷冻过程，开始时于4'C进行1小时，-20X:下进 行4小时，-80C下过夜，最后进入液体N2。
实施例6
在从3个个体拨出后立即收集正常人第三磨牙。轻轻地将牙周韧 带从牙根表面分离，然后将它们切碎成小块。然后将它们转移至T-75 培养瓶内，并用生长培养基(DMEM/F12,包含16% FCS、抗坏血酸、 庆大霉素和两性霉素)在37t:和5%002下进行培养。在整个培养过程 中每3至4天更换生长培养基。
在8至11天后，细胞(称为hPDLC)开始从牙周韧带的小碎片中 迁移出来。当培养物达到70-80%汇合(大约3周)时，使用胰蛋白酶/EDTA处理来脱离细胞，并将其用于下面描述的实验。 hPDLC的亚汇合培养显示于图3中。 流式细胞术分析
为了研究hPDLC的干细胞性质进行流式细胞术分析。
将hPDLC的单细胞悬浮液在室温下与缀合有FITC的抗CD73、CD90 (已知为间充质干细胞标记物)单克隆抗体一起温育。在温育后，在 Beckman Coulter Epics XL流式细胞仪上分析样品。通过前向和侧向 散射门控从分析中排除死细胞和碎片。
结果显示于图4中。
成骨分化
以0. 5xl(r个细胞/cW接种细胞，并在生长培养基中培养过夜。通 过将细胞从生长培养基转换至骨诱导性培养基(OIM)(由DMBMF12 组成，其中含10。/。FBS、 85 ng/mL L-抗坏血酸2-磷酸、l(TM地塞米 松和8 mM (3-磷酸甘油)中来诱导成骨分化3周。在包含10% FBS的 SCM中培养无分化刺激物的对照培养物。每周更换培养基2次。
可通过VonKossa方法来检测细胞外基质(ECM)的钙化，在所述 方法中，将磷酸钙沉积物染成棕色至黑色。以0. Sxl(T个细胞/ci^的密 度将细胞接种在6孔板中，并在0IM中培养21天。此外，使用特定的 染色方案来研究碱性磷酸酶活性。
成骨分化的结果显示于图5中。
基于上述发现我们得出结论培养在上述生长培养基中的hPDLC 能够沿着成骨途径分化。
此外，该细胞群展示出对于间充质千细胞来说特征性的两种表面 标记物。本发明的特定实施方案
1. 用于繁殖哺乳动物间充质细胞的方法，所述细胞已暴露于和/ 或与牙周韧带组织、来源于牙周韧带组织的牙周韧带蛋白质或因子共 培养，并被这些因子所诱导以
a. 获得牙周特征，
b. 显示出增加的骨桥蛋白和骨钙蛋白以及减少的骨唾液蛋白(也 称为骨唾液蛋白II或BSP),
c. 能够被植入以修复和/或再生牙周组织，
d. 能够修复病症例如牙周炎，也称为牙周病，
e. 被宿主接受而无显著的免疫反应或细胞排斥。
2. 用于繁殖同种异体哺乳动物间充质细胞的方法，所述细胞来源 于脐带和/或脐带血，并且已暴露于或与牙周韧带组织、来源于牙周韧 带组织的牙周韧带蛋白质或因子共培养，并被这些因子所诱导以
a. 获得牙周特征，
b. 显示出增加的骨桥蛋白和骨钙蛋白以及减少的骨唾液蛋白，
c. 能够被植入以修复和/或再生牙周组织，
d. 能够修复病症例如牙周炎，也称为牙周病，
e. 被宿主接受而无显著的免疫反应或细胞排斥。
3. 用于繁殖自体间充质细胞的方法，所述细胞已暴露于或与牙周 韧带组织、来源于牙周韧带组织的牙周韧带蛋白质或因子共培养，并 被这些因子所诱导以
a. 获得牙周特征，
b. 显示出增加的骨桥蛋白和骨钙蛋白以及减少的骨唾液蛋白，
c. 能够被植入以修复和/或再生牙周组织，
d. 能够修复病症例如牙周炎，也称为牙周病，
e. 被宿主接受而无显著的免疫反应或细胞排斥。
4. 用于繁殖自体成骨细胞或前体/祖细胞的方法，所述细胞已暴 露于或与牙周韧带组织、来源于牙周韧带组织的牙周韧带蛋白质或因子共培养，并被这些因子所诱导以
a. 获得牙周特征，
b. 显示出增加的骨桥蛋白和骨钾蛋白以及减少的骨唾液蛋白，
c. 能够被植入以修复和/或再生牙周组织，
d. 能够修复病症例如牙周炎，也称为牙周病，
e. 被宿主接受而无显著的免疫反应或细胞排斥。
5. 用于繁殖第l至4项中所述的细胞的方法，所述细胞被直接向 下注射至剩余的牙周韧带。
6. 用于繁殖自体间充质细胞的方法，所迷细胞被直接原位注射入 牙周韧带中，从而能够原位转分化。
7. 用于繁殖哺乳动物细胞并保持其未成熟形态的方法，所述未成 熟形态被定义为HLA-DR阳性(HLA-DR+) 、 Lin阳性(Lin + ) 、 Thy-l 阳性(Thy-l+) 、 Stro-l阳性(Stro-l +) 、 CD-13阳性、CD-44阳 性、CD-90阳性、CD-73阳性和可能地CD146/MUC 18阳性,应当是
a. 能够与来自脐带的哺乳动物间充质干细胞共培养，
b. 能够与来自脐带血的哺乳动物间充质干细胞共培养，
c. 能够被植入以修复和/或再生牙周组织，
d. 能够修复病症例如牙周炎，也称为牙周病，
e. 被宿主接受而无显著的免疫反应或细胞排斥。
8. 用于繁殖哺乳动物细胞并保持其未成熟形态的方法，所述未成 熟形态被定义为HLA-DR阳性(HLA-DR+) 、 CD-34阴性(CD-34 -)、 Lin阳性(Lin + ) 、 Thy-l阳性(Thy-l+) 、 Stro-l阳性(Stro-l +)、 CD-13阳性、CD-44阳性、CD-90阳性、CD-73阳性和可能地CD146/MUC 18 P曰性，应当是
a. 能够与来自脐带的哺乳动物间充质干细胞共培养，
b. 能够与来自脐带血的哺乳动物间充质干细胞共培养， C- 食巨 够被植入以修复和/或再生牙周组织，
d. 能够修复病症例如牙周炎，也称为牙周病，
e. 被宿主接受而无显著的免疫反应或细胞排斥。9. 能够与来源于来自自体或同种异体供体的骨髓细胞或其集落 的哺乳动物细胞共培养，暴露于或与牙周韧带组织、来源于牙周韧带 组织的牙周韧带蛋白质或因子共培养，并被这些因子所诱导以
a. 获得牙周特征，
b. 显示出增加的骨桥蛋白和骨钓蛋白以及减少的骨唾液蛋白，
c. 能够被植入以修复和/或再生牙周组织，
d. 能够被植入以修复和/或再生牙周组织，
e. 能够修复病症例如牙周炎，也称为牙周病，
f. 被宿主接受而无显著的免疫反应或细胞排斥。
10. 用于繁殖哺乳动物细胞并保持其未成熟形态的方法，所述未 成熟形态被定义为HLA-DR阳性(HLA-DR+)、 Lin P日性(Lin + )、 Thy-l 阳性(Thy-l+) 、 Stro-l阳性(Stro-l +) 、 CD-13阳性、CD-44阳 性、CD-90阳性、CD-73阳性和可能地CD146/MUC 18阳性，所述方法 包括鉴定哺乳动物牙周韧带细胞的部分，可以是
a. 能够与来自脐带的哺乳动物间充质干细胞共培养，
b. 能够与来自脐带血的哺乳动物间充质干细胞共培养，
c. 能够被植入以修复和/或再生牙周组织，
d. 能够修复病症例如牙周炎，也称为牙周病，
e. 被宿主接受而无显著的免疫反应或细胞排斥。
11. 所得到的如第1和2项中所述进行处理的群体，被定义为 HLA-DR阳性(HLA-DR+) 、 Lin阳性(Lin + ) 、 Thy-l阳性(Thy-l+) 和Stro-l阳性(Stro-l +) 、 CD-13阳性、CD-44阳性、CD-90阳性、 CD-73阳性和可能地CD146/MUC 18阳性，应当可被移植入哺乳动物中
a. 进入它们的口腔而不被排斥，
b. 进入牙周区域而不被排斥，
c. 进入牙缺损而不被排斥。
12. 所得到的如笫1和2项中所述进行处理的群体，被定义为 HLA-DRP曰性(HLA-DR+) 、 Lin阳性(Lin + ) 、 Thy-l阳性(Thy-l+) 和Stro-l阳性(Stro-l +) 、 CD-13阳性、CD—44阳性、CD-90阳性、CD-73阳性和可能地CD146/MUC 18阳性，应当可被移植入哺乳动物中
a. 进入它们的口腔而不被排斥，
b. 进入牙周区域而不被排斥，
c. 进入牙缺损而不被排斥。
13. 使用细胞和支架的组合来植入第l至ll项中所描述的细胞的 方法。
14. 用于繁殖哺乳动物自体牙周韧带阳性细胞(干细胞)的方法， 所述细胞可纟皮移植
a. 进入口腔而不被排斥，
b. 进入牙周区域而不被排斥，
c. 进入牙缺损而不被排斥。
15. 使用细胞和支架的组合来植入上述权利要求中所描述的细胞 的方法。
16. 来自自体、同种异体和/或异种来源的牙周韧带或其提取物用 于使得细胞能够分化的用途。
17. 来自自体、同种异体和/或异种来源的牙周韧带或其提取物用 于使得细胞能够分化成牙周细胞、牙周干细胞和/或表现出牙周行为的 细胞的用途。
权利要求
1.用于繁殖和/或分化哺乳动物细胞的方法，该方法包括将哺乳动物细胞暴露于或与一种或多种牙周韧带组织、来源于牙周韧带组织的牙周韧带蛋白质或因子共培养，从而获得具有PDL特征并达到至少一种下列状况的细胞i)显示出通过Von Kossa方法所证明的牙周特征，在该方法中磷酸钙沉积物被染成棕色至黑色，ii)显示出增加的骨桥蛋白和骨钙蛋白以及同时减少的骨唾液蛋白(骨唾液蛋白II或BSP)，iii)能够被植入以修复和/或再生牙周组织，iv)能够通过朝向牙齿的龈线的愈合来修复病症例如牙周炎，也称为牙周病或齿根骨膜炎，和v)被宿主接受而无显著的免疫反应或细胞排斥。
2. 权利要求1的方法，其中所述哺乳动物细胞在生长培养基中繁 殖，然后通过将生长培养基变换为分化培养基例如骨诱导性培养基而被 诱导分化，由此收获具有获得的PDL特征的细胞。
3. 权利要求1或2的方法，其中所述哺乳动物细胞是哺乳动物间充质细胞、来源于脐带和/或脐带血的同种异体哺乳动物间充质细胞、 自体哺乳动物间充质细胞、自体哺乳动物成骨细胞或成骨细胞的前体细胞/祖细胞，其中这些细胞通过暴露于牙周韧带蛋白将分化成PDL细胞。
4. 权利要求3的方法，其中进行繁殖的哺乳动物间充质细胞是自 体间充质细胞，并且所获得的细胞能够原位转分化成PDL细胞或显示出 PDL特征的细胞。
5. 前述权利要求中任一项的方法，其中所获得的具有PDL特征的 细胞是HLA-DR阳性的(HLA-DR+) 、 Lin阳性的(Lin + ) 、 Thy-l阳性 的(Thy-l+) 、 Stro-l阳性的(Stro-l +) 、 CD-13阳性的、CD-44阳 性的、CD-90阳性的、CD-73阳性的，和可能CD146/MUC 18阳性的，但 对于CD31是阴性的。
6. 前述权利要求中任一项的方法，其中所获得的具有PDL特征的 细胞是CD-34阴性的。
7. 具有PDL特征并且通过权利要求1至6中任一项所描述的方法 可获得的细胞群。
8. 用于治疗牙周组织中的病症的方法，所述方法包括将通过权利 要求1至3中任一项所定义的方法而获得的细胞直接向下注射至牙周韧 带，从而导致所述细胞与周围牙根管的粘着。
9. 权利要求8的方法，其中细胞的植入采用细胞和支架的组合。
10. 主要由能够诱导PDL细胞特征的牙周韧带蛋白质组成的组织 组合物，该组合物可通过下列方式而获得在培养基中培养牙周韧带外 植体以获得细胞的迁移，并收获这些细胞。
11. 在权利要求10中描述的细胞，所述细胞能够与来源于来自自 体或同种异体供体的骨髓细胞或其集落的哺乳动物细胞共培养，暴露于 或与牙周韧带组织、来源于牙周韧带组织的牙周韧带蛋白质或因子共培 养，并通过这些因子进行诱导以a. 获得牙周特征，其显示出增加的骨桥蛋白和骨钙蛋白以及减少 的骨唾液蛋白，b. 能够被植入以修复和/或再生牙周组织，c. 能够被植入以修复和/或再生牙周组织，d. 能够修复病症，例如牙周炎，也称为牙周病，e. 被宿主接受而无显著的免疫反应或细胞排斥。
全文摘要
本发明涉及用于繁殖和/或分化哺乳动物细胞的方法，该方法包括将哺乳动物细胞暴露于或与一种或多种牙周韧带组织、来源于牙周韧带组织的牙周韧带蛋白质或因子共培养，从而获得具有PDL特征并达到至少一种下列状况的细胞i)显示出通过Von Kossa方法所证明的牙周特征，在该方法中磷酸钙沉积物被染成棕色至黑色，ii)显示出增加的骨桥蛋白和骨钙蛋白以及同时减少的骨唾液蛋白(骨唾液蛋白II或BSP)，iii)能够被植入以修复和/或再生牙周组织，iv)能够通过朝向牙齿的龈线的愈合来修复病症例如牙周炎(也称为牙周病)，和v)被宿主接受而无显著的免疫反应或细胞排斥。
文档编号A61K6/00GK101316926SQ200680044909
公开日2008年12月3日 申请日期2006年9月28日 优先权日2005年9月30日
发明者C·克劳森, K·R·派德森, K·欧瑟 申请人:复制基因股份公司