专利名称：苦参生物碱在制备治疗人表观遗传失活疾病药物的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物学制药领域，特别涉及苦参生物碱在制备治疗人表观遗传失活疾 病药物应用。 技术背景-继人类基因组计划圆满完成之后，研究人员已正式启动了 "人类基因组表观遗传 计划(Human Epigenome Project)",这是一项针对控制人类基因"开"和"关"的主 要化学变化进行的图谱绘制工作。基因表达的"开关"是由表观遗传因素(Epigenetics) 控制。表观遗传因素是在不影响DNA序列的情况下通过对染色体结构或DNA空间结 构进行表观遗传修饰来开启或关闭，增强或抑制特定基因的表达，包括DNA甲基化和 聚梳蛋白家族表达、组蛋白乙酰化等。大部分情况下，人类疾病有半数原因与基因遗 传有关，另一半则取决于表观遗传变化。虽然它与肿瘤发生是否存在因果关系的争议 持续了二十年，但愈来愈多的证据表明肿瘤的发病机制中，表观遗传因素的变化可先 于遗传因素的改变，表观遗传因素变化引发肿瘤一说现已得到证实。DNA甲基化是指哺乳动物基因组DNA的胞嘧啶(C)的5'位通过DNA甲基转移 酶(DNAmethyltransferase， DNMT)介导发生的甲基化修饰反应，此反应主要发生在 含-CG-的DNA序列中。CpG岛是指基因组DNA上富含CpG的区域，主要分布在基 因的启动子和第一外显子。据估计人类基因组DNA上约29， 000个CpG岛，多为低 甲基化，人类50%基因的5'端可出现CpG岛。基因的转录调节同启动子CpG岛甲基 化密度和发生的区域有关。高表达基因(如管家基因)的CpG岛趋于低甲基化，而低 表达基因常呈现高甲基化。细胞的正常发育和分化过程也可通过这种不同基因甲基化 调节以控制不同生理状态下基因表达来实现；有研究表明随年龄的增加，重要基因的 甲基化程度也增加；广泛的低甲基化和CpG岛的高甲基化共存是许多肿瘤细胞的表观 遗传学特征。 CpG岛甲基化谱的系统性和全面性特点同中医药学整体观的哲学体系完全吻合。 由此看来，CpG岛甲基化谱不但与决定疾病不同中医症侯群的分子机制密切相关，还 可能是中医药辩证施治的科学依据。为此研究CpG岛甲基化谱的CpG岛芯片技术又将 带给具有丰富内涵的中医药研究新的契机。
发明内容
本发明的目的是提供苦参生物碱作为制备治疗人表观遗传失活疾病药物的应用本发明所说的苦参生物碱是从苦参、山豆中提取的生物碱。包括参碱、氧化苦参 碱、羟基苦参碱及其临床上可接受的盐。本发明所说的人表观遗传失活是指人细胞内基因在DNA表达调控区域甲基化发 生变异、聚梳蛋白家族表达发生变异、或甲基化转移酶活性发生改变导致正常组织中 的细胞增殖、分化和凋亡等发生紊乱由此而引起的疾病。具体是指肿瘤、白血病。本发明苦参生物碱的用量为临床上可接受的用量。本发明所述的苦参生物碱通过影响肿瘤细胞DNA水平甲基化，聚梳蛋白家族表达 调控抑癌基因表达，诱导肿瘤细胞分化、凋亡，抑制肿瘤细胞增殖，达到治疗和预防 肿瘤疾病，以及其它疾病。
图1为RIZ1启动子呈高甲基化水平，经过0.1 mg/ml苦参碱或0.2 mg/ml苦参液 作用K562细胞6天，甲基化程度降低，处理组U出现条带。图2为不同药物作用K562细胞不同时间后RIZ1表达的变化，J5 — actin作为内对照。 其中图中1、 DNAMarker; 2、 0小时；3、 24小时；4、 72小时。
具体实施方式
苦参碱、氧化苦参碱以及羟基苦参碱等生物碱是我国传统中药苦参、山豆的 多种活性成分中较为重要的一种生物碱。我们观察到苦参煎液可诱导人白血病K562 细胞部分分化基础上，发现苦参碱、氧化苦参碱等中药苦参、山豆根中生物碱单体可 抑制K562细胞增殖，促使细胞向红系分化，进一步观察到细胞在信号转导、细胞周期 以及癌基因等诸多方面发生了相应变化[1]，我们选择含有细胞周期、受体、信号转导、 转录因子、癌基因等相关的7600条人类基因的国产基因表达谱芯片检测了苦参碱作用K562细胞24小时的差异表达基因，并发现此过程中有300多个基因的表达情况明显 发生变化，且与增殖、分化和代谢相关的基因占多数，此研究结果同我们以往获得的 研究数据基本吻合。随着微观生物学在表观遗传学(Epigenetic)方面研究的深入，依 据这些研究结果，进一步利用PCR技术，MSP-PCR技术，毛细管电泳等技术，发现 了中药苦参、山豆根以及从中提取的苦参碱、氧化苦参碱、羟基苦参碱等化合物可改 变人类细胞表观遗传因素。从而可以应用这些物质改变生物的表观遗传，以及治疗或 预防由于表观遗传因素引起的疾病提供了新途径。如图一所示，通过Methylation Specific PCR (甲基化特异性PCR， MSP)技术， 研究发现RIZ1启动子呈高甲基化水平，经过0.1 mg/ml苦参碱或0.2 mg/ml苦参液作 用K562细胞6天，甲基化程度降低，处理组U出现条带。如图二所示，在对照组K562细胞中，RIZ1抑癌基因低表达，0.1mg/ml苦参碱或 0.2 mg/ml苦参液作用K562细胞24小时和72小时RIZ1的转录表达明显比对照组升 高，并随着作用时间延长而表达增加。结合图一结果表明苦参碱和苦参液诱导RIZ1基 因表达是通过降低RIZ1启动子甲基化实现。目前临床尚没有通过改变肿瘤细胞的表观遗传学性状治疗肿瘤的中药。通过改 变RIZ1等抑癌基因表观遗传学性状，由转录沉默状态转变为转录表达，不但可以发挥 抗肿瘤作用，还可以用于肿瘤预防作用。特别是通过RIZ1基因表达，可影响组蛋白甲 基化，改善染色体的稳定性，对肿瘤预防和辅助肿瘤化疗有积极作用。 实施例1细胞培养K562细胞采用常规细胞培养，含10%小牛血清，青、链霉素各100u/ml 的RPMI1640培养液，在37。C，饱和湿度，5XC02孵箱中培养，每3 4天换液传代。 2药物处理细胞收集对数生长期细的苦参碱或0.2 mg/ml的苦参液分别作用K562细 胞24和72小时，其中处理72小时组为先用药物作用细胞24小时，离心去掉上清液，加 无药物的新鲜培养基培养24小时后再加入同等浓度药物处理24小时。对照组不加药物 处理，其余条件完全一致。37'C培养，收集细胞。3 RNA提取采用细胞总RNA提取试剂盒(RNeasy Protect Mini Kit， QIAGEN)，具体 操作参照试剂盒说明书进行。电泳分析其完整性，用紫外法对样品RNA进行定量与纯度测定。4 RT-PCR:取1 u g总RNA， 分别用通用引物(Hexanucleotide-Mix, Roche)与RIZ基 因的特异性引物(5' -ACACCAATCCGGGTCTTGTC-3')进行逆转录反应。具体操作为RNA 样品先经7(TC预变性3分钟,加入20 W逆转录反应体系中，然后经37'C (通用引物组) 或42。C (RIZ特异性引物组)逆转录1小时，70°C 10min，然后置于-20。C保存备用。引物由上海基康生物技术有限公司合成，RIZ1基因引物序列为上游5' -GAACACTACTGAGCCTGTGG-3'，下游5' -ACACCAATCCGGGTCTTGTC-3'。扩增片断长度为 123bp。
e-actin的引物序列上游5' -ACACTGTGCCCATCTACGAGG-3'，下游5' -AGGGG5CCGGACTCGTCATACT—3'，扩增片断为621bp。 PCR条件为94。C预变性5分钟； 扩增35个循环，即94'C 45秒、62°C 45秒、72°C 1分钟；最后72'C延伸10分钟。5 PCR产物测定将全部PCR扩增产物加入2.0M琼脂糖凝胶中，以100V电压电泳40分 钟，溴化乙锭染色，将电泳结果直接置于凝胶成像系统装置中摄像分析。本发明用苦参碱为例进行实验，其他的氧化苦参碱、羟基苦参碱、N-甲基金雀花 碱、安那吉碱、膺靛叶碱、脱氢苦参碱、d-异苦参碱、苦参啶、去甲苦参酮、苦参碇 醇、苦参醇、新苦参醇、去甲苦参醇等，本领域普通技术人员参照苦参碱的实验方法， 就可以实现本发明的内容。
权利要求
1、苦参生物碱在制备治疗人表观遗传失活疾病药物的应用。
2、 根据权利要求l所述的应用，其特征在于所说的苦参生物碱 是从苦参、山豆中提取的生物碱。
3、 根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的生物碱是指 苦参碱、氧化苦参碱、羟基苦参碱、N-曱基金雀花碱、安那吉碱、膺 靛叶碱、脱氢苦参碱、d-异苦参碱、苦参啶、去甲苦参酮、苦参碇醇、 苦参醇、新苦参醇、去曱苦参醇。
4、 根据权利要求3所述的应用，其特征在于其苦参生物碱包括 其临床上可接受的盐。
5、 根据权利要求l所述的应用，其中人表观遗传失活是指人细胞 内基因在DNA表达调控区域甲基化发生变异、聚梳蛋白家族表达发生 变异、或曱基化转移酶活性发生改变由此而引起的疾病。
6、 根据权利要求书5所述的应用，其所述的疾病是指肿瘤、白 血病。
7、 根据权利要求1所述的应用，其特征在于苦参生物碱的用 量为临床上可接受的用量。
全文摘要
表观遗传失活对生物基因表达、生长、发育等生命行为产生重要影响，特别是对抑癌基因表达调控的作用异常，导致表观遗传失活疾病发生，如肿瘤、白血病等。中药苦参、山豆根以及从中提取的苦参碱、氧化苦参碱、羟基苦参碱等化合物可抑制肿瘤表观遗传失活，诱导抑癌基因表达，抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞分化和凋亡，达到治疗和预防肿瘤。
文档编号A61K31/4353GK101152177SQ200710030219
公开日2008年4月2日 申请日期2007年9月13日 优先权日2007年9月13日
发明者刘小珊, 蒋纪恺 申请人:汕头大学医学院