专利名称：石蒜生物碱作为肿瘤抗凋亡因子Mc1-1抑制剂的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物领域，特别涉及石蒜生物碱作为肿瘤抗凋亡因子Mcl-l (myeloid cell leukemia-1) 抑制剂的应用。
背景技术：
石蒜碱是存在于我国中药材石蒜或水仙根中的一种主要生物碱，不溶于水，但其盐酸盐可溶于 水。石蒜是石蒜科植物的鳞茎，我国大部分地方有产，具有驱痰、利尿、解毒、催吐的功效，用于 喉风、水肿、痈疽肿毒、疔疮、瘰疬等症。水仙根为同科植物水仙的鳞茎，主要分布于我国东南等 地，主治痈肿疮毒、虫咬、鱼骨哽等。现已证实上述药效主要归因于药材中以石蒜碱为主的多种生 物碱活性成分。石蒜碱己在前苏联作驱痰药使用。另据报道，石蒜碱还具有多种生物学活性，如抗 病毒和体外杀伤肿瘤细胞作用等，但对肿瘤多药耐药细胞的作用及治疗尚未见报道。
Mcl-l基因是在筛选TPA(佛波酯)诱导人髓样白血病细胞系ML-1分化的早期反应基因时发现 的，并由此命名为myeloid cell leukemia-1 (Mcl-l )。编码人Mcl-l基因定位于染色体lq21,其蛋 白分子量约40KD,虽然Mcl-l基因在正常组织广泛表达，但体内Mcl-l转基因与基因敲除实验己 提示Mcl-l同造血系统的发生以及血液肿瘤的形成密切相关,不仅Mcl-l转基因小鼠发生了淋巴瘤， 而且临床上多种血液肿瘤如白血病，淋巴瘤和多发性骨髓瘤细胞均发现Mcl-l蛋白高表达。另外其 他肿瘤如黑色素瘤，肝癌与炎症等疾病同Mcl-l密切相关。体外实验证实，Mcl-l的过度表达可使 细胞抵抗紫外(UV),TRAIL (tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing Ligand)以及化疗药物 etoposide， staurosporine, acrinomycin D等诱导的细胞凋亡；当利用抑制Mcl-l转录的小分子化合物， 或SiRNA,或Antisense寡核苷酸降低Mcl-l表达后，肿瘤细胞可被诱导凋亡。研究还表明Mcl-l 基因功能与自身免疫性疾病密切相关。
目前报道可抑制Mcl-l基因或蛋白表达的药物包括etoposide, staurosporine, STI-571, CDK (cyclin-dependent kinase)抑制剂,还有flavopiridol和roscovitine以及激酶抑制剂BAY43-9006和 蛋白合成抑制剂高三尖杉酯碱等。这些药物主要通过干扰了 Mcl-l表达调控机制降低了 McL-1蛋 白表达，如CDK抑制剂影响了 Mcl-l mRNA转录，BAY43-9006抑制翻译起始因子磷酸化等。但 在临床治疗中因肿瘤细胞常发生对上述多数药物耐药导致治疗失败。
发明内容
本发明的目的是提供石蒜生物碱的应用，具体说是作为肿瘤抗凋亡因子Mcl-l异性地抑制的应 用。石蒜生物碱可作为因Mcl-l基因表达异常所引起疾病的临床药物。
本发明所指的石蒜生物碱是从科植物石蒜或水仙根中提取的生物碱，具体说是指石蒜碱、高石 蒜碱、石蒜胺碱、石蒜伦碱、雪莲花胺碱、多花水仙碱、伪石蒜碱、双氢石蒜碱。 本发明的石蒜生物碱还包括其临床上可接受的盐酸盐、内胺盐。 本发明石蒜生物碱的用量为临床上可接受的用量。
本发明石蒜物物碱特别作为包括对STI571等抗肿瘤药物多药耐药细胞的凋亡诱导剂。
图1为流式细胞仪定量测定细胞凋亡数量。AtmexinV表示一种荧光指示剂。
图2为Western blot方法检测石蒜碱作用耐药细胞后Mcl-1蛋白被抑制，并出现细胞凋亡的
特征的PARP和Caspase-3剪切。
本发明的详述
细胞凋亡，又称程序性细胞死亡，是与细胞坏死机制不同的，在系列调控下发生的蛋白质与 DNA降解。疾病的发生同细胞凋亡调控紊乱密切相关，细胞抗凋亡特性的增强也是肿瘤发生和导 致放化疗失败的常见原因。细胞凋亡的启动有两条途径，即外源性的死亡受体途径和内源性的线粒 体途径，二者分别通过Capases的级联放大效应诱导了细胞凋亡。线粒体途径的调控由凋亡相关蛋 白Bcl-2家族成员执行，此家族成员由抗凋亡和促凋亡两组蛋白组成。抗凋亡成员包括含4个BH结构 域的Bcl-2、 Bcl-xL、 Al以及2个BH结构域的Mcl-l分子。促凋亡成员包括有多个结构域的Bax， Bak 和含BH3-only结构域的Bid， Bim， Bad和Bik等。Mcl-l主要通过结合相关的Bak，Bim,tBid后，使这 些促凋亡蛋白处于失活状态，从而抑制细胞凋亡。
白血病是造血系统的恶性肿瘤。我们对多种具有抗白血病效应的中药成分筛选实验发现，石蒜 碱(均指石蒜碱盐酸盐制剂)对原代培养的急性髓性白血病细胞和STI57I耐药的K562细胞非常敏 感，但同等浓度的石蒜碱对正常人外周血单个核细胞(PBMNCs)无明显毒性。进一步研究发现， 石蒜碱主要在转录后水平明显抑制了多个白血病细胞株和临床患者的原代培养的急性髓性白血病 细胞的抗凋亡Bcl-2家族成员Mcl-l蛋白表达，这种抑制与细胞凋亡发生的生化反应多聚ADP核糖多 聚酶PARP的剪切在药物作用时间上呈前后关系，即Mcl-l降低较PARP先出现。而石蒜碱对Mek/Erk 通路活性的抑制却发生在PARP剪切之后。为此，我们提出Mcl-l蛋白的下调可能真正介导了石蒜碱 诱导白血病细胞凋亡效应。
发明人发现石蒜碱对正常人外周血单核细胞无杀伤作用，对K562细胞，特别是STI571耐药
的K562细胞具有明显的杀伤作用，且不是多药耐药基因Mdr-l产生的药物泵的作用底物。
石蒜碱是Mcl-l基因在蛋白表达水平的特异性抑制剂，在临床可用于治疗因Mcl-l基因表达异 常所引起的疾病。适用于化疗失畋的耐药性难治疗的肿瘤，特别对包括白血病，以及其他多药耐药 性肿瘤。石蒜生物碱作对正常人外周血单核细胞无损伤作用。临床应用时，在医生指导下，石蒜碱 可制成盐酸盐或内胺盐注射液25mg/lml/支，或其他规格。用法皮下注射；用量为每次25 50mg， 1日量50mg。根据情况，在用药安全前提下，合理使用。石蒜碱有毒，需慎用。接触皮肤 即红肿发痒，进入呼吸道引起鼻出血。内服中毒，可致休克，严重时造成死亡。制备成盐形式毒性 降低，可用于临床。实施例
石蒜碱配制与细胞培养
用无菌生理盐水配置浓度为lOmM石蒜碱的储存液。K562细胞、K562耐药细胞以及原代培养的 急性髓性白血病细胞，采用常规细胞培养(含10%小牛血清，青、链霉素各100u/ml的RPMI-1640 培养液)在37'C,饱和湿度，5y。Cft孵箱中培养，每3 4天换液传代。收集对数生长期细胞，调 节细胞数为lX10Vml ,取10mL至培养皿中，分别加入终浓度分别为1、 5、 10uM的石蒜碱作用 K562细胞以及K562耐药细胞24小时，对照组除不加石蒜碱外，其余条件完全一致。37'C培养，收 集细胞。
石蒜碱抑制细胞增殖活性
MTT购置Sigraa公司。用去离子水配制成5mg/ml储存液，置-20'C备用。取实施例1所述各组 细胞100ul分别置％孔酶标板中，并加入相应浓度的药物培养，然后每孔加入10ulMTT储存液， 在37'C细胞培养箱中孵育4小时后取出，加入含HCI的异丙醇100ul，混匀，用570nM波长的酶标 仪测定光密度值(OD)。用(对照OD-处理OD) /对照ODX96计算出细胞增殖抑制率。 石蒜碱诱导凋亡
用l、 5、 10uM石蒜碱作用细胞24小时倒置光学显微镜观察细胞形态学改变。石蒜碱作用后 细胞形态上出现细胞凋亡特征。
利用南京凯基生物科技发展有限公司AnnexinV-EGFP细胞凋亡试剂盒和流式细胞仪定量测定 细胞凋亡数量。
并提取细胞总蛋白与Western blot方法检测细胞凋亡的特征性的PARP剪切。石蒜碱作用细 胞24小时后，出现PARP剪切和Caspase-3的剪切。
细胞总蛋白提取与Western blot:采用4 'C, lOOOg离心3分钟收集各组细胞，分别加入蛋 白提取液200ul [1 % Triton ， 150mM NaCL ， 25mMTris- HCL (PH7. 2) ， 0. 5mM EDTA , 0. 5mM Na3V04及蛋白酶抑制剂鸡尾酒片(每50 m1/ —片，购自Roche公司)],震荡混匀，冰上放置30 分钟，4'C， 10， 000g离心10分钟，取上清，用BCA蛋白定量法测定各标本蛋白含量，加5X上 样缓冲液,95'C5分钟，置-20 'C保存备用。每泳道取上述各标本60ug进行常规12%聚丙烯酰胺 凝胶电泳，转膜，5 %脱脂牛奶封闭，然后依次进行一抗和二抗反应(抗PAPR， Caspase-3， Mcl-1 抗体购自Cell signaling公司，抗P -Actin抗体与二抗购自BD公司，ECL显色试剂盒为Amersham ECL-plus) 。 e-Actin作为上样量的内对照。
本发明所述方法和系统在不脱离本发明之范围和实质下的多种调整和变化对本领域内的技术人员 是显而易见的。尽管本发明已经描述的相关的具体的优选方案，但应当理解本发明之权利要求不应 当受到这些特定实施方案的限制。事实上，为分子生物学或相关领域内的技术人员所显而易见的对 本发明的所述方法的调整均在本发明的范围之内。说明书附图
权利要求
1.本发明是石蒜生物碱作为肿瘤抗凋亡因子Mcl-1特异性地抑制剂的应用。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于其中所指的石蒜 生物碱是从科植物石蒜或水仙根中提取的生物碱。
3. 根据权利要求书2所述的应用，其特征在于其中石蒜生物 碱是指石蒜碱、高石蒜i威、石蒜胺碱、石蒜伦石咸、雪莲花胺石咸、多花 水仙石咸、伪石蒜碱、7又氳石蒜石威。
4. 根据权利要求书3所述的应用，其特征在于其石蒜生物碱 包括其临床上可接受的盐酸盐、内胺盐。
5. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于石蒜物物碱作为 STI571抗肿瘤药物多药耐药细胞的凋亡诱导剂。
6. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于石蒜生物碱的用 量为临床上可接受的用量。
全文摘要
本发明属于药物领域，涉及石蒜生物碱作为肿瘤抗凋亡因子Mcl-1(myeloid cell leukemia-1)抑制剂(Lycorine)的应用，它通过抑制肿瘤抗凋亡因子Mcl-1蛋白质表达，达到治疗Mcl-1蛋白质表达异常引起的疾病，如自身免疫性炎症、肿瘤等。
文档编号A61K31/4353GK101352437SQ20071003021
公开日2009年1月28日 申请日期2007年9月13日 优先权日2007年9月13日
发明者刘小珊, 蒋纪恺 申请人:汕头大学医学院