专利名称：：蛋氨酸脑啡肽在制备人或动物接种疫苗中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及蛋氨酸脑啡肽(MEK)，具体涉及蛋氨酸脑啡肽的应用。技术背景疫苗的使用仍然是目前人或动物避免微生物诸如病毒和细菌感染所引起疾病的最好方法。由于免疫学的进展，疫苗除了用于微生物的感染之外，也用于治疗其他疾病如癌症，于是所谓"治疗性疫苗"运用而生。抗原是有效疫苗最具重要元素之一，经由基因重组或合成方法能够制成更有特异性或组成多表位、多类抗原一体的疫苗而使疫苗含盖多种微生物，并且更为有效。但是一般疫苗尤其是合成疫苗有一个缺点，那就是对免疫"刺激"不强，不够"免疫激发力"(immunogenicity)，导致疫苗的接种效果不好。此外，在正常人群中，约有百分之5至10或由于遗传因素对某些疫苗没有反应。这种"没反应"或者不够免疫激发力的疫苗，可以用佐剂能够让所用的疫苗达到免疫的效果。另一个问题在使用疫苗发生的是，无法指使免疫系统导向所期望的免疫反应。在这个问题上，佐剂的运用也是关键。众所周知，免疫系统对于排解外面入侵物质的反应有两个分支。其一是所谓体液免疫系统，另一分支是细胞免疫系统。体液免疫途经抗原辨认与处理、B细胞克隆选择、T细胞干预等步骤。T细胞需要被激活才能分泌B细胞赖以成熟的细胞介素。T细胞能够辨认抗原提呈细胞所提呈的根据MHC所局限己处理的抗原。树突状细胞和巨噬细胞是B细胞以外的重要抗原提呈细胞。经过适当处理，和MHC分子结合的抗原表位(一般是含有9至12个氨基酸的肽段)被提呈细胞提呈给T细胞。此时T细胞会分泌细胞介素，细胞介素刺激所启动的B细胞使其增殖并分化成制造抗体的B淋巴细胞。细胞免疫分支涉及排斥移植的异体器官、消灭肿瘤和病毒感染的细胞。与体液免疫相似，抗原(如病毒、细菌、或肿瘤等)需要经过树突状细胞或巨噬细胞的处理(分解)并和MHC分子结合。抗原、MHC结合体由树突状细胞提呈给CD8+T淋巴细胞。经由T帮助细胞(Th)的合作和细胞介素的刺激，T细胞分化为胞质毒性T淋巴细胞(CTL)。两个免疫分支在原始的免疫应答尤如一体的两面，互相配合与平衡。在此树突状细胞的角色特别重要，树突状细胞不只处理并提呈抗原与MHC复合体完成免疫应答最为重要的初步，它也能够分辨抗原的根源性而避免自我免疫反应的后果。佐剂的运用也可影响树突状细胞的导向，即决定免疫反应的大小和是否形成体液反应、或细胞反应、或两者都有。
发明内容本发明所要解决的技术问题是蛋氨酸脑啡肽在制备人或动物接种疫苗中的应用，该应用能够加强疫苗所引起的免疫反应达到免疫的效果。对某些疫苗的接种，蛋氨酸脑啡肽能引导免疫应答指向(即体液或细胞免疫)疫苗免疫所要达到的目的。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是蛋氨酸脑啡肽在制备人或动物接种疫苗中的应用。蛋氨酸脑啡肽是一种人和动物体内自然生成，由五个氨基酸(Tyr-Gly-Gly-Phe-Met)组成的神经肽，是蛋白内啡肽的一小部分。蛋氨酸脑啡肽能够和阿片样(Opiate)受体结合而使人或动物(类似内啡肽Endorphins)产生镇定、止痛、和抗惊厥作用，并且有直接抑制肿瘤生长的功能。后继研究发现许多体内细胞都含有能和蛋氨酸脑啡肽相结合的受体，其中最为重要的是免疫系统的T细胞和NK自然杀手细胞。免疫系统对预防和抵抗微生物的感染，诸如病毒、细菌、真菌、寄生虫至关重要，而且也避免正常细胞的癌变，或访患"机会感染"和自我免疫问题。实验显示蛋氨酸脑啡肽能够剌激和增加树突状细胞的数量和成熟，具有刺激淋巴细胞生长的功能，并且引发非原发性的免疫增强作用，比如能够提高肿瘤坏死因子、白细胞介素、干扰素的生成。因此蛋氨酸脑啡肽是连接神经和免疫两个系统的重要转导信号分子，对神经和免疫系统的平衡调解起着关键性的作用。从许多研究单位后继发现蛋氨酸脑啡肽具有下列功能(1)小鼠巨噬细胞在细胞介素的刺激下，MEK加强IL-6的产量；(2)活化能被IL-2，OKT10和绵羊红细胞的T细胞受体；(3)增强TNF-a生成、NK细胞活力、IL-12的分泌；(4)促进IL-1、IL-2、IL-6的产生；(5)活化或增强"炎症"反应。从癌症病人临床淋巴细胞样品实验发现，蛋氨酸脑啡肽使用于体外激活病人的淋巴细胞用以治疗癌症没有任何毒性。而被激活的淋巴细胞能够杀灭在体外的癌细胞。在同样的试验发现蛋氨酸脑啡肽能够刺激树突状细胞的增殖和成熟(文献即将发表于国外相关科目杂志)。这是极有意义的，因为树突状细胞担任免疫应答的第一步反应，即吸收抗原、辨认抗原、加工处理抗原、结合抗原与MHC、提呈MHC与抗原的复合体并剌激T细胞、促成体液或细胞免疫反应，因此利用蛋氨酸脑啡肽作为接种疫苗的佐剂，能够加强疫苗所引起的免疫反应达到免疫的效果。另外对某些疫苗的接种，蛋氨酸脑啡肽能引导免疫应答指向(即体液或细胞免疫)疫苗免疫所要达到的目的。蛋氨酸脑啡肽的合成依照合成多肽的程序在符合cGMP的车间完成，最后用高效液相层析纯化至百分之九十八以上，任何非主要成分少于百分之零点二之下，经过无菌处理后，配成每毫升2.5毫克的注射针剂(生理食盐水，0.9%NaCl)，每一个针剂2毫升。给药用量可以从10至20微毫克/Kg开始直至250微毫克/Kg。在给药时用生理食盐水适当希释。脑啡肽可以在疫苗接种之前、后，或者与疫苗同时混合或分开接种。其他方法如肌肉注射、皮下注射、皮上透散、口腔黏膜渗透、鼻孔、眼睛滴液或喷雾、和肠化胶囊等也可以使用。图1为IL-4、GM-CSF刺激下的DC照片图2为IL-4、GM-CSF联合MEK刺激下的DC照片具体实施方式蛋氨酸脑啡肽在制备人或动物接种疫苗中的应用蛋氨酸脑啡肽的合成-蛋氨酸脑腓肽的合成可以用传统的固相合成法[参考文献J.M.StewartandJ.D.Young,SolidPhaseP邻tideSynthesis,2nded.，PierceChemicalCo.,Rockford,111(1984);J.Meienhofer,HormonalProteinsandPeptides,Vol.2,AcademicPress,NewYork,(1973)]或溶液合成法[E.SchroderandK.Lubke,ThePeptides,Vol.1,AcademicPress,NewYork,(1965)]。合成后蛋氨酸脑啡肽用高效液相层色柱纯化至98%以上。经过成盐后(醋酸、马来酸或其他盐)冷冻干燥。成品装瓶后储藏于-20°冻箱。动物实验A、蛋氨酸脑啡肽对树突状细胞的分化与增殖的影响(a)前树突状细胞从IRM-2小鼠的脾脏用淋巴细胞分离液分离，经过适当的冲洗和处理之后，在使用之前，细胞重悬于RPMI-1640培养液含有10。/。胎牛血清(FCS)，然后放置于二氧化碳温箱(37°C，5%C02)两小时。(b)不同浓度的MEK对树突状细胞的影响上述所分离的前树突状细胞分成6组，经过离心去除上清液，加入RPMI-1640含有10ng/mlIL-4，100ng/mlGM-CSF,10%FCS,和含有0ng/ml，7.5ng/ml，15ng/ml，30ng/ml，60ng/ml，120ng/ml的MEK。细胞的最后密度是2xl()S细胞/ml。所有细胞都放回CO/衡温箱，从第三天开始，每隔一天细胞培养液的一半换成新的培养液。细胞生长九天之后，细胞数目用倒置显微镜计数细胞密度。(c)树突状细胞膜表CDllc(+)、CD80表达的检验上述所制备的细胞，于第九天常规制样加入FITC(荧光标示剂)标记相应抗体(FTIC-Ab)用流式细胞仪检测树突状细胞表面分子表达，标记荧光的细胞为阳性细胞。(d)细胞培养基上清液IL-12水平的检测在(b)制备的细胞于第九天离心收集上清液，按ELISA试剂盒说明检测IL-12含量。(e)表1显示不同浓度的MEK对树突状细胞的作用，最适当的浓度是60ng/ml:(1)MTT方法测定细胞的增殖从表一可以看出MEK能够促进树突状细胞的成长和增殖，MEK的作用和它的浓度成正比，在60ng/ml时作用达到顶峰增殖达2.5培，然后降下来。表l:不同量的MEK刺激下的DC浓度(1()S个/ml)及增殖比组别MEK浓度(ng/ml)细胞个数(105/ml)增殖比(％)对照组02100.0实验组1"7.52.2土0.1127.1实验组2152.5±0.2133.3实验组3302.9±1.2159.2实验组4604.8±0.2246.5实验组51203.1±0.1165.5(2)表2列出MEK对树突状细胞膜表CDllc(+)和CD80表达的百分比。这和细胞增殖相吻合，最高峰时MEK浓度为60ng/ml。表2:DC表面抗原分子阳性百分比分组CDllc(+)的细胞百分比CD80百分比空白对照组47.2%50.3%实验组149.9%51.3%实验组251.3%54.1%实验组355.6%58.7%实验组462.7%64.6%实验组557.3%63.3%(3)MEK对IL-12分泌的情况表示在表3表3:DC培养上清中IL-12分泌水平分组IL-12分泌水平(单位pg/ml)空白对照组68实验组1102±1.1实验组2126+0.4实验组3175土1.6实验组4256±0.3实验组5227±1.9(4)图l、2分别为放大400倍的两组成熟树突状细胞照片实施例蛋氨酸脑啡肽在制备抗小鼠Lewis肺癌细胞接种疫苗中的应用。蛋氨酸脑啡肽增强树突状细胞疫苗抗小鼠Lewis肺癌细胞的实验(a)疫苗的制备小鼠脾来源的DC的制备将IRM-2小鼠颈椎脱臼处死，无菌取脾。制备脾细胞悬液，沿试管贴壁缓慢倒入盛有等体积淋巴细胞分离液的离心管中，1500卬m离心20分钟，用平头吸管吸取其中的灰白层，加入适量PBS，1000rpm离心10分钟，弃上清，1000rpm离心5分钟。然后用10%FCS的RPMI-1640悬浮，移入培养瓶中。贴壁两小时，换液，加入10ng/ml的IL-4和200ng/ml的GM-CSF，37°C、5%C02培养三天，做为备用的树突状细胞。(b)Lewis肺癌细胞抗原的制备取生长状态良好的Lewis肺癌细胞培养，调整浓度为W个/ml，取20ml，2000rpm离心5分钟，用生理盐水悬浮沉淀，反复冻融三次。15000ipm离心30分钟，收集上清液，用生理盐水l:IO稀释，转入Eperndorf管中备用。(c)常规DC疫苗的制备(a)制备的细胞37°C、5%C02培养，隔天换液，第七天时加入1.2制备的抗原100/il。第9天，收集悬浮的DC，无菌生理盐水洗三次，3000tpm离心20分钟。再用生理盐水悬浮沉淀，调制细胞浓度为107个/ml，即为DC疫苗。(d)MEK-DC疫苗的制备(a)制备的细胞贴壁培养2h后，加入含有60ng/mlMEK的因子培养基，此后每48小时换液一次，连续培养到第七天，收集DC。加入1.2制备的Lewis肺癌细胞抗原IOOmI，继续培养48小时，调制细胞浓度为107个/ml，即为MEK-DC疫苗。(e)特异性CTL活性的测定采用乳酸脱氢酶LDH法，将IRM-2小鼠分为DC组和MEK-DC组，每组10只。将两种DC疫苗以每只2xl06个细胞注射小鼠背部，每周一次，第二次免疫一周后，处死小鼠。常规方法制备脾淋巴细胞悬液作为效应细胞，以L3-8细胞作为靶细胞，靶细胞6xio"L设ioo:i、50:i、25:i效靶比，均为3复孔，测定CTL活性，计算杀伤率。杀伤率=(实验组A值一效应细胞自然释放组A值一靶细胞自然释放组A值)/(靶细胞最大释放组A值一靶细胞自然释放组A值)xi00%。(f)抑瘤实验动物实验取生长状态良好的Lewis肿瘤细胞，生理盐水洗三次，镜下调整浓度至10々ml，接种于每只小鼠的背部，接种量为0.5ml/只，待肿瘤长出l-3mi^后，将实验小鼠随即分为A、B、C组，每组10只。A组为肿瘤对照组，B组为常规DC疫苗组，C组为MEK-DC疫苗组。A、B、C组分别注射生理盐水、DC疫苗、MEK-DC疫苗0.5ml，每周一次，观察并纪录小鼠生长情况，如有死亡立即解剖取瘤称重。所有小鼠在接种DC疫苗6周后处死，取下完整瘤组织，称重并记录结果。计算抑瘤率抑瘤率=(对照组平均瘤重一实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重xl00%。统计学分析根据方差分析中一个实验组和一个对照组最小显著差法对数据进行分析。(g)体外测定特异性CTL活性表4总结MEK刺激后的融合组实验小鼠体内的淋巴细胞对Lewis肺癌细胞的特异性杀伤率明显高于DC组，有统计学意义(P<0.05)。表4:两种疫苗对Lewis肺癌细胞的CTL活性组别效靶比跳150:125:1DC疫苗41.6o/o35.8%26.9%MEK-DC疫苗65.3%43.6%31.5%(h)小鼠存活情况、瘤重及抑瘤率所有小鼠在接种疫苗6周后均未死亡，各组小鼠瘤重及抑瘤率见表5。对各组小鼠瘤重进行统计学分析PAB<0.05，说明对照组与DC组瘤重有显著性差异；PBC<0.05,说明两种疫苗在治疗肿瘤方面有显著性差异，MEK-DC疫苗在抑制肿瘤方面要明显好于DC疫苗。表5:接种疫苗4周后三组小鼠瘤重<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>权利要求1.蛋氨酸脑啡肽在制备人或动物接种疫苗中的应用。全文摘要本发明涉及蛋氨酸脑啡肽在制备人或动物接种疫苗中的应用。该应用能够加强疫苗所引起的免疫反应达到免疫的效果。对某些疫苗的接种，蛋氨酸脑啡肽能引导免疫应答指向(即体液或细胞免疫)疫苗免疫所要达到的目的。文档编号A61K39/39GK101244270SQ20071005158公开日2008年8月20日申请日期2007年2月16日优先权日2007年2月16日发明者单风平,定张,罗植农,黄建寅申请人:黄建寅;张定;单风平;罗植农