专利名称：一种金纳米棒基药物载体及其制备工艺和应用的制作方法
技术领域：
本发明是涉及一种金纳米棒基药物载体及其制备工艺和应用，具体说，是
涉及一种负载有hTERT基因反义寡聚核苷酸的金纳米棒基药物载体及其制备 工艺和应用。
背景技术：
纳米药物载体技术是以纳米颗粒作为药物的携带工具，将药物分子包裹在 纳米颗粒之中或吸附在其表面，通过细胞内吞作用将药物引入到细胞内，从而 实现有效安全的治疗。
与传统的零维纳米颗粒相比，金纳米棒在药物载体上的应用具有如下优 点1)金纳米棒特别是功能化的金纳米棒具有良好的生物相容性，对生物体 系的毒性小；2)金纳米棒具有很高的比表面积，在其壁表面修饰生物体系可 以提高负载量；3)金纳米棒可通过控制反应物的浓度制备不同长度的金纳米 棒，适用于生物领域的应用；4)金纳米棒在水溶液中分散性良好，可在水溶 液体系下稳定存在且不会发生团聚；5)金纳米棒可通过化学修饰带有不同功
能的官能团，适于不同生物体系的研究；6)金纳米棒在520nm和700~900nm 有两个明显的等离子表面共振吸收峰，可利用其光热效应治疗肿瘤细胞。
研究表明恶性肿瘤组织中的端粒酶高达84% 95%,端粒酶中的催化亚 单位hTERT(human telomerase revel etranscrlptase)是端粒酶活性决定因素，因此 hTERT基因被作为新一代肿瘤反义药物治疗的靶点。所述反义概念是lzan沐 Weintmub于1984年首次提出的，与传统的化学疗法相比，反义疗法毒副作用更 小，因为在治疗过程中反义药物能选择性地进入癌细胞，从而有效地保护正常 细胞，其基本原理就是根据碱基互补原理，用人工合成和生物合成的特定互补 的DNA或RNA序列，导入乾细胞，形成mRNA-DNA或mRNA-RNA杂交双链， 从而抑制或封闭基因表达，使其丧失活性，达到基因控制和治疗的目的。研究 学者根据人类端粒酶催化亚单位(hTERT)基因cDNA的序列分析，已设计出
hTERT基因反义寡聚核苷酸，其序列为5，-GGAGCGCGCGGCATCGCGGG-3，。
因成功的基因治疗主要取决于如何将有特异性治疗效果的治疗基因有效 地导入靶细胞，而裸露的反义寡聚核苷酸等治疗基因存在进入细胞转染效率很 低、易被核酸酶降解等问题。因此，如何开发一种高效、安全、无毒的药物载 体，以将反义寡聚核苷酸等治疗基因有效地导入靶细胞，对实现恶性肿瘤基因 疗法具有重要意义，但至今有关这类技术的报道很罕见，尤其是以人类端粒酶 催化亚单位(hTERT)基因作为药物治疗靶点，负载有hTERT基因反义寡聚核 苦酸的金纳米棒基药物载体更未见任何报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种金纳米棒基药物载体及其制备工 艺和应用，为金纳米棒在药物载体中的应用开辟一条新途径。
为解决上述发明问题，本发明釆用的技术方案如下
一种金纳米棒基药物载体，其特征在于，在金纳米棒上由内至外依次包裹 有聚阴离子膜层、聚阳离子膜层及hTERT基因反义寡聚核苷酸层。
所述聚阴离子膜层的材料选自聚苯乙烯磺酸钠、聚丙烯酸及透明质酸中的 任意一种。
所述聚阳离子膜层的材料选自聚二烯丙基二甲基氯化铵、壳聚糖、聚乙烯 亚铵、聚酰胺胺及聚丙烯胺中的任意一种。
本发明所述的金纳米棒基药物载体的制备原理是利用基团之间的静电作 用力进行层层自组装，具体工艺如下
a) 制备金纳米棒采用十六烷基三甲基溴化铵作为软模板和导向剂，用 种子生长法在水溶液中制备金纳米棒；
b) 制备聚阴离子膜层首先将步骤a)制备的金纳米棒水溶液在5000 ~ 14000rpm转速下离心10-30分钟，去掉上清液；然后将离心处理后的金纳米 棒浸入由氯化钠和聚阴离子化合物组成的混合水溶液中，其中氯化钠浓度为 0.001 ~0.1mol/l,聚阴离子化合物浓度为l~100mg/ml;最后在4 35。C进行摇 床振荡10~60分钟；
c) 制备聚阳离子膜层首先将步骤b)制备的包裹有聚阴离子膜层的金纳 米棒水溶液在5000 - 14000 rpm转速下离心10 ~ 30分钟，去掉上清液；然后
将离心处理后的包裹有聚阴离子膜层的金纳米棒浸入由氯化钠和聚阳离子化
合物组成的混合水溶液中，其中氯化钠浓度为0.001 ~0.1mol/l,聚阳离子化 合物浓度为l~100mg/ml;最后在4 ~ 35。C进行摇床振荡10 ~ 60分钟；
d)制备hTERT基因反义寡聚核苷酸层首先将步骤c)制备的包裹有聚 阴离子膜层及聚阳离子膜层的金纳米棒水溶液在5000- 14000 rpm转速下离心 10~30分钟，去掉上清液，然后用pH7.2的磷酸盐缓冲溶液进行分散，控制溶 液中包裹有聚阴离子膜层及聚阳离子膜层的金纳米棒的浓度为0.001 ~ O.lmol/1;最后将分散在pH7.2的磷酸盐缓冲溶液中的hTERT基因反义寡聚核 苷酸加入到上述溶液中，控制hTERT基因反义寡聚核苷酸的终浓度为5~ 150,ol/l，再静置10 60分钟，在5000~ 14000rpm转速下离心10~30分钟， 去掉上清液，重新分散在pH7.2的磷酸盐缓冲溶液中即可。
步骤b)中所述的聚阴离子化合物为聚苯乙烯磺酸钠、聚丙烯酸或透明质 酸，优选聚苯乙烯磺酸钠。
步骤c)中所述的聚阳离子化合物为聚二烯丙基二甲基氯化铵、壳聚糖、聚 乙烯亚铵、聚酰胺胺及聚丙烯胺中的任意一种，优选聚乙烯亚铵。
本发明中的金纳米棒的制备工艺已在Langmuir期刊，2004,20 (15)， 6414 ~ 6420中公开，为现有技术，在此不再赘述。
本发明所述的金纳米棒基药物载体因负载有hTERT基因反义寡聚核苷酸， 所以可应用于制备恶性肿瘤细胞端粒酶的抑制剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下
本发明首次将hTERT基因反义寡聚核苷酸负载在金纳米棒上，解决了裸
露的反义寡聚核苷酸存在转染率低的问题，所制备的金纳米棒基药物载体不仅 具有转染率高、靶向性强、抑制恶性肿瘤细胞端粒酶活性的效果明显等优点，
而且安全、无毒，为金纳米棒在生物医药领域的应用开辟了一条新途径；另外，
本发明的层层自组装制备工艺操作简单，成本低廉，适于规模化生产。
图l为经过不同修饰后的金纳米棒的紫外-可见光谱图； 图中曲线1为未修饰的金纳米棒的紫外-可见光谱图；曲线2为包裹有 聚阴离子膜层的金纳米棒的紫外-可见光谱图；曲线3为包裹有聚阴离子膜层
及聚阳离子膜层的金纳米棒的紫外-可见光谱图；a 、 b为金纳米棒的两个表 面等离子共振特征吸收峰。
图2为未修饰的金纳米棒的电镜图3为包裹有聚阴离子膜层及聚阳离子膜层的金纳米棒的电镜图。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细、完整地说明 实施例1
一、 试剂与仪器
氯金酸(HAuCU)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、硝酸银(AgN03)、 抗坏血酸(AA)均购自国药集团化学试剂有限公司，硼氢化钠(NaBH4)购 自上海三浦化工有限公司，hTERT基因反义寡聚核苷酸(5， -GGAGCGCGCGGCATCGCGGG-3 ，)由上海生工生物科技公司合成，聚乙烯亚 铵(PEI)、聚苯乙烯磺酸钠(PSS)购自Aldrich,釆用双蒸水。
二、 金纳米种子的制备
将0.25ml 0.01M HAuCl4加入到9.15ml 0.1M CTAB溶液中轻轻搅拌混匀，
溶液呈橙黄色；在冰水洛下加入0.60ml 0.01MNaBH4溶液，快速搅拌2分钟， 溶液呈淡棕黄色；在3(TC水浴中静置2小时，备用。
三、 金纳米棒的制备
首先将28.27ml 0.10M CTAB和0.01M 1.2ml HAuCU在30。C水浴下轻轻搅 拌混匀，然后加入0.18ml 0.01MAgN03和0.20ml 0.10M的抗坏血酸，搅拌混 匀，得到无色透明的生长溶液；最后加入0.15ml上述种子溶液，轻轻搅拌10 秒，随着反应的进行，溶液颜色发生如下变化无色—浅粉紫色—紫色—深紫 色；在3(TC水洛下静置24小时即可。
四、 聚阴离子膜层的制备
首先将上述制备的金纳米棒水溶液在14000 rpm转速下离心IO分钟，去 掉上清液(即弃除溶液中游离的CTAB);然后将离心处理后的金纳米棒浸入由 NaCl和PSS组成的混合水溶液中，其中NaCl浓度为O.OOlmol/1, PSS浓度 为10mg/ml;最后在25"C进行摇床振荡30分钟。
五、 聚阳离子膜层的制备 首先将上述制备的包裹有PSS膜层的金纳米棒水溶液在14000 rpm转速下 离心10分钟，去掉上清液(即弃除溶液中游离的PSS);然后将离心处理后的包 裹有PSS膜层的金纳米棒浸入由NaCl和PEI组成的混合水溶液中，其中NaCl 浓度为0.001mol/l， PEI浓度为10mg/ml;最后在25℃进行摇床振荡30分钟。
六、hTERT基因反义寡聚核苷酸层的制备
首先将上述制备的包裹有PSS膜层及PEI膜层的金纳米棒水溶液在14000 rpm转速下离心10分钟，去掉上清液(即弃除溶液中游离的PEI),然后用pH7.2 的磷酸盐缓冲溶液进行分散，控制溶液中包裹有PSS膜层及PEI膜层的金纳米 棒的浓度为O.Olmol/1;最后将分散在pH7.2的磷酸盐缓冲溶液中的hTERT基 因反义寡聚核苷酸加入到上述溶液中，控制hTERT基因反义寡聚核苷酸的终 浓度为75umo1/1,再静置30分钟，在14000rpm转速下离心10分钟，去掉上 清液(即弃除溶液中游离的hTERT基因反义寡聚核苷酸)，重新分散在pH7.2的 磷酸盐缓冲溶液中即可。
由图l可见经过阴、阳离子高聚物修饰的金纳米棒的纵向吸收峰波长由 727nm红移到736nm,发生了明显红移，说明金纳米棒修饰上了 PEI/PSS膜。
由图2和图3所示的电镜图可进一步证明PEI/PSS包裹上了金纳米棒，其 厚度大约在3-5nm左右。
实施例2
一、 试剂与仪器
与实施例1中所述相同。
二、 金纳米种子的制备
与实施例1中所述相同。
三、 金纳米棒的制备
与实施例1中所述相同。
四、 聚阴离子膜层的制备
首先将上述制备的金纳米棒水溶液在14000 rpm转速下离心10分钟，去 掉上清液(即弃除溶液中游离的CTAB);然后将离心处理后的金纳米棒浸入由 NaCl和PSS组成的混合水溶液中,其中NaCl浓度为0.001mol/l， PSS浓度 为100mg/ml;最后在35℃进行摇床振荡10分钟。
五、 聚阳离子膜层的制备
首先将上述制备的包裹有PSS膜层的金纳米棒水溶液在14000 rpm转速下 离心10分钟，去掉上清液(即弃除溶液中游离的PSS);然后将离心处理后的包 裹有PSS膜层的金纳米棒浸入由NaCl和PEI组成的混合水溶液中，其中NaCl 浓度为0.001mol/l， PEI浓度为100mg/ml;最后在35。C进行摇床振荡10分钟。
六、hTERT基因反义寡聚核苷酸层的制备
首先将上述制备的包裹有PSS膜层及PEI膜层的金纳米棒水溶液在14000 rpm转速下离心IO分钟，去掉上清液(即弃除溶液中游离的PEI)，然后用pH7.2 的磷酸盐缓冲溶液进行分散，控制溶液中包裹有PSS膜层及PEI膜层的金纳米 棒的浓度为O.lmol/1;最后将分散在pH7.2的磷酸盐缓冲溶液中的hTERT基因 反义寡聚核苷酸加入到上述溶液中，控制hTERT基因反义寡聚核苦酸的终浓 度为150pmol/l,再静置10分钟，在14000rpm转速下离心IO分钟，去掉上清 液(即弃除溶液中游离的hTERT基因反义寡聚核苷酸)，重新分散在pH7.2的磷 酸盐缓冲溶液中即可。
实施例3
一、 试剂与仪器 与实施例1中所述相同。
二、 金纳米种子的制备 与实施例1中所述相同。
三、 金纳米棒的制备 与实施例1中所述相同。
四、 聚阴离子膜层的制备
首先将上述制备的金纳米棒水溶液在5000 rpm转速下离心30分钟，去掉 上清液(即弃除溶液中游离的CTAB);然后将离心处理后的金纳米棒浸入由 NaCl和PSS组成的混合水溶液中，其中NaCl浓度为O.lmol/1, PSS浓度为 lmg/ml;最后在4'C进行摇床振荡60分钟。
五、 聚阳离子膜层的制备
首先将上述制备的包裹有PSS膜层的金纳米棒水溶液在5000 rpm转速下 离心30分钟，去掉上清液(即弃除溶液中游离的PSS);然后将离心处理后的包 裹有PSS膜层的金纳米棒浸入由NaCl和PEI组成的混合水溶液中，其中NaCl 浓度为0.1mo1/1， PEI浓度为lmg/ml;最后在4'C进行摇床振荡60分钟。
六、hTERT基因反义寡聚核苷酸层的制备
首先将上述制备的包裹有PSS膜层及PEI膜层的金纳米棒水溶液在5000 rpm转速下离心30分钟，去掉上清液(即弃除溶液中游离的PEI),然后用pH7.2 的磷酸盐缓冲溶液进行分散，控制溶液中包裹有PSS膜层及PEI膜层的金纳米 棒的浓度为0.001mol/l;最后将分散在pH7.2的磷酸盐缓冲溶液中的hTERT基 因反义寡聚核苷酸加入到上述溶液中，控制hTERT基因反义寡聚核苷酸的终 浓度为5pnol/i,再静置60分钟，在5000rpm转速下离心30分钟，去掉上清 液(即弃除溶液中游离的hTERT基因反义寡聚核苷酸)，重新分散在pH7.2的磷 酸盐缓冲溶液中即可。
实施例4
一、 试剂与仪器 与实施例1中所述相同。
二、 金纳米种子的制备 与实施例1中所述相同。
三、 金纳米棒的制备 与实施例1中所述相同。
四、 聚阴离子膜层的制备
首先将上述制备的金纳米棒水溶液在5000 rpm转速下离心30分钟，去掉 上清液(即弃除溶液中游离的CTAB);然后将离心处理后的金纳米棒浸入由 NaCl和PSS组成的混合水溶液中，其中NaCl浓度为O.lmol/1， PSS浓度为 100mg/ml;最后在4'C进行摇床振荡60分钟。
五、 聚阳离子膜层的制备
首先将上述制备的包裹有PSS膜层的金纳米棒水溶液在5000 rpm转速下 离心30分钟，去掉上清液(即弃除溶液中游离的PSS);然后将离心处理后的包 裹有PSS膜层的金纳米棒浸入由NaCl和PEI组成的混合水溶液中，其中NaCl 浓度为0.1mo1/1， PEI浓度为100mg/ml;最后在4。C进行摇床振荡60分钟。
六、 hTERT基因反义寡聚核苷酸层的制备
首先将上述制备的包裹有PSS膜层及PEI膜层的金纳米棒水溶液在5000 rpm转速下离心30分钟，去掉上清液(即弃除溶液中游离的PEI),然后用pH7.2 的磷酸盐缓冲溶液进行分散，控制溶液中包裹有PSS膜层及PEI膜层的金纳米
棒的浓度为0.01mol/l;最后将分散在pH7.2的嫌酸盐缓冲溶液中的hTERT基 因反义寡聚核苷酸加入到上述溶液中，控制hTERT基因反义寡聚核苷酸的终 浓度为50nmo1/1，再静置60分钟，在5000rpm转速下离心30分钟，去掉上清 液(即弃除溶液中游离的hTERT基因反义寡聚核苷酸)，重新分散在pH7.2的磷 酸盐缓冲溶液中即可。 实施例5
一、 Hela细胞的培养
Hela宫颈癌细胞株购自中科院上海细胞库。将Hela细胞在含10%小牛血 清的RPMI-1640培养基中于37i:、 5%(302饱和温度下培养。实验选用对数生 长期细胞。
二、 细胞转染率的测定
将荧光染料FAM标记的裸露的hTERT基因反义寡聚核苷酸及FAM标记 的本发明的金纳米棒基药物载体，分别加入到对数生长期的Hda细胞中，在 37°C、 5% C02饱和温度下培养24h;取未经任何处理的对数生长期的Hela细 胞作为阴性对照；胰酶消化后，用70%的乙醇固定；用流式细胞仪分别检测其 细胞转染率。实验结果表明本发明的金纳米棒基药物载体可将hTERT基因 反义寡聚核苷酸的转染率提高56.78%。
三、 细胞调亡率的测定
将裸露的hTERT基因反义寡聚核苷酸、包裹有PSS膜层及PEI膜层的金 纳米棒及本发明的金纳米棒基药物载体分别加入到对数生长期的Hda细胞中， 在37。C、 5% C02饱和温度下培养48h;取未经任何处理的对数生长期的Hela 细胞作为阴性对照；胰酶消化后，用70%的乙醇固定；用流式细胞仪分别检测 它们的凋亡率。实验结果表明经过裸露的hTERT基因反义寡聚核苷酸处理 的Hela细胞凋亡率为5.7%，经过包裹有PSS膜层及PEI膜层的金纳米棒处理 的Hela细胞凋亡率为6.7%，经过本发明的金纳米棒基药物载体作用的Hela 细胞凋亡率达到20.7%。
权利要求
1. 一种金纳米棒基药物载体，其特征在于，在金纳米棒上由内至外依次包裹有聚阴离子膜层、聚阳离子膜层及hTERT基因反义寡聚核苷酸层。
2. 根据权利要求1所述的金纳米棒基药物载体，其特征在于，所述聚阴离 子膜层的材料选自聚苯乙烯磺酸钠、聚丙烯酸及透明质酸中的任意一种。
3. 根据权利要求1所述的金纳米棒基药物载体，其特征在于，所述聚阳离 子膜层的材料选自聚二烯丙基二甲基氯化铵、壳聚糖、聚乙烯亚铵、聚酰胺胺 及聚丙烯胺中的任意一种。
4. 一种权利要求l所述的金纳米棒基药物载体的制备工艺，其特征在于， 包括如下具体步骤a) 制备金纳米棒釆用十六垸基三甲基溴化铵作为软模板和导向剂，用 种子生长法在水溶液中制备金纳米棒；b) 制备聚阴离子膜层首先将步骤a)制备的金纳米棒水溶液在5000 ~ 14000rpm转速下离心10~30分钟，去掉上清液；然后将离心处理后的金纳米 棒浸入由氯化钠和聚阴离子化合物组成的混合水溶液中，其中氯化钠浓度为 0.001 ~ O.lmol/1,聚阴离子化合物浓度为l~100mg/ml;最后在4 35。C进行摇 床振荡10~60分钟；c) 制备聚阳离子膜层首先将步骤b)制备的包裹有聚阴离子膜层的金纳 米棒水溶液在5000 ~ 14000 rpm转速下离心10 ~ 30分钟，去掉上清液；然后 将离心处理后的包裹有聚阴离子膜层的金纳米棒浸入由氯化钠和聚阳离子化 合物组成的混合水溶液中，其中氯化钠浓度为0.001-O.lmol/1，聚阳离子化 合物浓度为1-100mg/ml;最后在4 ~ 35"C进行摇床振荡10 ~ 60分钟；d) 制备hTERT基因反义寡聚核苷酸层首先将步骤c)制备的包裹有聚 朋离子膜层及聚阳离子膜层的金纳米棒水溶液在5000- 14000 rpm转速下离心 10~30分钟，去掉上清液，然后用pH7.2的磷酸盐缓冲溶液进行分散，控制溶 液中包裹有聚阴离子膜层及聚阳离子膜层的金纳米棒的浓度为0.001 ~ O.lmol/1;最后将分散在pH7.2的磷酸盐缓冲溶液中的hTERT基因反义寡聚核 苷酸加入到上述溶液中，控制hTERT基因反义寡聚核苷酸的终浓度为5~ 150,ol/l,再静置10 60分钟，在5000- 14000rpm转速下离心10~30分钟，去掉上清液，重新分散在pH7.2的磷酸盐缓冲溶液中即可。
5. 根据权利要求4所述的金纳米棒基药物载体的制备工艺，其特征在于, 步骤b)中所述的聚阴离子化合物为聚苯乙烯磺酸钠、聚丙烯酸或透明质酸。
6. 根据权利要求5所述的金纳米棒基药物载体的制备工艺，其特征在于, 所述的聚阴离子化合物为聚苯乙烯磺酸钠。
7. 根据权利要求4所述的金纳米棒基药物载体的制备工艺，其特征在于， 步骤c)中所述的聚阳离子化合物为聚二烯丙基二甲基氯化铵、壳聚糖、聚乙烯 亚铵、聚酰胺胺及聚丙烯胺中的任意一种。
8. 根据权利要求7所述的金纳米棒基药物载体的制备工艺，其特征在于, 所述的聚阳离子化合物为聚乙烯亚铵。
9. 一种权利要求1所述的金纳米棒基药物载体的应用，其特征在于，所述 金纳米棒基药物载体用于制备恶性肿瘤细胞端粒酶的抑制剂。
全文摘要
本发明公开了一种金纳米棒基药物载体，该载体特征是在金纳米棒上由内至外依次包裹有聚阴离子膜层、聚阳离子膜层及hTERT基因反义寡聚核苷酸层。本发明的金纳米棒基药物载体是利用基团之间的静电作用力进行层层自组装原理制备而得，可应用于制备恶性肿瘤细胞端粒酶的抑制剂。本发明首次将hTERT基因反义寡聚核苷酸负载在金纳米棒上，解决了裸露的反义寡聚核苷酸存在转染率低的问题，所制备的金纳米棒基药物载体不仅具有转染率高、靶向性强、抑制恶性肿瘤细胞端粒酶活性的效果明显等优点，而且安全、无毒，为金纳米棒在生物医药领域的应用开辟了一条新途径；另外，本发明的制备工艺操作简单，成本低廉，适于规模化生产。
文档编号A61K31/7088GK101380473SQ20081020113
公开日2009年3月11日 申请日期2008年10月14日 优先权日2008年10月14日
发明者贾能勤, 陈守慧 申请人:上海师范大学