专利名称：：健儿清解液指纹图谱控制方法
技术领域：
：本发明涉及一种中药复方制剂健儿清解液的指纹图谱控制方法，具体地说是涉及一种指纹图谱技术来控制健儿清解液药品的质量。
背景技术：
：该发明中所涉及的健儿清解液药物为国家标准品种，健儿清解液是目前临床中可同时治疗小儿呼吸系统疾病和消化系统疾病的药品之一，其市场份额已占目前儿童用药的5%以上。健儿清解液目前国内有17家企业拥有国家食品药品监督管理局颁发的生产批文，在市场销售的产品有7家左右。由于历史的原因，这些产品普遍存在着作用物质不清楚，质量不可控，从而影响了该产品疗效的发挥，甚至存在着用药安全性隐患。国际上常采用指纹图谱对植物药进行质量控制，效果显著，如韩国、日本、德国等。他们比较重视对植物药的开发和利用，外国(德国)用指纹图谱技术控制质量的银杏制剂，在国际上具有很强的竞争力。加入世贸组织之后，生产植物药的大国也都将进入我国进行竞争，我国的中药企业面临着严峻的挑战。而针对健儿清解液药品建立指纹图谱来控制其质量还未见相关文献。
发明内容本发明的目的在于提供一种健儿清解液指纹图谱控制方法，从而实现通过针对健儿清解液药品建立指纹图谱来控制其质量的目的。该方法操作方便、精度高，产品质量稳定可靠。为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下本发明提供的一种健儿清解液指纹图谱控制方法，包括将健儿清解液成品配制的供试液，在一定的色谱条件下测试供试液指纹图谱，供试液指纹图谱与对照指纹图谱经计算机辅助相似度评价软件计算指纹图谱的相似度，获得相似度数值，依据指纹图谱相似度应大于0.90作为质控标准来控制健儿清解液的质量。上述的健儿清解液指纹图谱建立方法，包括如下步骤1)健儿清解液供试品溶液的制备先将金银花、菊花、苦杏仁、连翘分别蒸馏提取芳香水；将山楂用乙醇加热提取后按顺序进行过滤留滤液、浓縮成浸膏得山楂中间体、加水溶解制成山楂药液；陈皮用乙醇进行渗漉，将渗漉液浓縮成浸膏得陈皮中间体，加水溶解制成陈皮药液；再合并上述药液及芳香水，加入适量枸橼酸、单糖浆及苯甲酸，加水定容，搅匀，过滤即得健儿清解液。取健儿清解液过C18固相小柱，用水洗涤，弃去水洗涤液，再用甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液备用；2)测试吸取健儿清解液供试品溶液注入液相色谱仪，依照高效液相色谱法测定，制定健儿清解液指纹图谱，其中，高效液相色谱条件为色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；采用梯度洗脱，流动相A为O.1X的甲酸水溶液，流动相B为乙腈；梯度洗脱程序如下0分钟时，97%流动相A、3V流动相B;13分钟时，95%流动相A、5X流动相B;27分钟时，85%流动相A、15X流动相B;35分钟时，80%流动相A、20V流动相B;45分钟时，80%流动相A、20V流动相B;60分钟时，72%流动相A、28V流动相B;65分钟时，40%流动相A、60V流动相B;67分钟时，0%流动相A、100X流动相B;75分钟时，0%流动相A、100X流动相B;90分钟时，97%流动相A、3X流动相B;流速1.OmLmin—1;检测波长280nm;柱温25°C;流动相A与流动相B是按体积比添加。上述步骤(1)中健儿清解液供试品溶液的制备1)将金银花、菊花、苦杏仁、连翘分别蒸馏提取芳香水；2)将山楂用80%乙醇加热提取2次，每次2小时，过滤，合并滤液，滤液回收乙醇，浓縮成浸膏得山楂中间体，加水溶解制成山楂药液；3)将陈皮用60%乙醇进行渗漉，收集渗漉液并浓縮成浸膏，再加适量水溶解；4)合并上述各步所得的药液及芳香水，在加入枸橼酸0.020.08g、单糖浆200400ml及苯甲酸，加水定容至1000ml，搅匀，过滤即得健儿清解液成品；5)取健儿清解液成品0.52ml，通过C18固相小柱，用水0.52ml洗涤，弃去水洗涤液，再用甲醇0.52ml洗脱，收集洗脱液备用。步骤(2)中色谱条件为进样量1020iil，流速1.OmL*min—1;检测波长280nm;柱温25t:。上述步骤(2)中流动相A溶液的配制比例是按体积百分比配制，流动相B溶剂为色谱纯，C18固相小柱的填料规格500mg，临用前用甲醇3ml活化，再用水3ml洗涤。本发明所述的健儿清解液所用药材山楂和/或陈皮中间体指纹图谱建立方法，包括如下步骤1)山楂中间体供试品溶液的制备取山楂中间体0.52mL，用甲醇稀释至10ml，再取lml甲醇稀释液，接着用水稀释至10ml，通过C18固相小柱，用0.52mL水洗涤，弃去水洗涤液，再用0.52mL甲醇洗脱，收集洗脱液；和/或陈皮中间体供试品溶液的制备取陈皮中间体0.52mL，用水稀释至10ml，再通过C18固相小柱，接着用0.52mL水洗涤，弃去水洗涤液，然后用0.52mL甲醇洗脱，收集洗脱液，最后精密取甲醇洗脱液500iil，用甲醇稀释至lml;2)测试精密吸取山楂和/或陈皮中间体供试品溶液注入液相色谱仪，依照高效液相色谱法及上述的色谱条件测定，制定山楂和/或陈皮中间体指纹图谱。本发明所述的健儿清解液所用山楂和/或陈皮药材指纹图谱建立方法，包括如下步骤1)山楂药材供试品溶液的制备先用80%乙醇加热提取2次，每次两小时，过滤后合并滤液，接着浓縮成浸膏，再加适量的水溶解，然后取上述溶解液0.52mL，通过C18固相小柱，用水0.52mL洗涤，弃去水洗涤液，再用甲醇0.52mL洗脱，收集洗脱液备用；和/或陈皮药材供试品溶液的制备陈皮用60%乙醇进行渗漉，收集渗漉液并浓縮成浸膏，再加适量水溶解，然后取上述溶液0.52mL，通过C18固相小柱，用水0.52mL洗涤，弃去水洗涤液，再用甲醇0.52mL洗脱，收集洗脱液备用；2)测试精密吸取山楂和/或陈皮药材供试品溶液分别注入液相色谱仪，依照高效液相色谱法及上述的色谱条件测定，制定山楂和/或陈皮药材指纹图谱。本发明所述的健儿清解液对照指纹图谱的获取方法按权利要求2步骤(1)所述方法制备10批次健儿清解液样品供试品溶液，按上述的色谱条件分析，获取10批次健儿清解液HPLC指纹图谱，以该10批次的数据为基础，运用计算机辅助软件导出对照指纹图谱。上述的健儿清解液对照指纹图谱的获取方法中参数设置为时间窗宽度0.10秒；校正方式采用多点校正；校正色谱峰的确定4个较高的色谱峰峰1:12.7min、峰2:15.9min、峰3:28.2min、峰4:46.8min。本发明所述的健儿清解液所用药材山楂和/或陈皮中间体对照指纹图谱的获取方法按权利上述方法制备多批次山楂和/或陈皮中间体供试品溶液，按上述的色谱条件分析，获取多批次山楂和/或陈皮中间体HPLC指纹图谱，以这些数据为基础，运用计算机辅助软件导出对照指纹图谱。上述的山楂中间体对照指纹图谱的获取方法中参数设置为时间窗宽度0.10秒；校正方式采用多点校正；校正色谱峰的确定6个较高的色谱峰，峰1:18min、峰2:22.8min、峰3:28.3min、峰4:40.3min、峰5:40.8min、峰6:58.2min;和/或陈皮中间体对照指纹图谱的获取方法中参数设置为时间窗宽度0.10秒；校正方式采用多点校正；校正色谱峰的确定2个较高的色谱峰，峰1:43.5min、峰2:48.lmin。本发明所述的健儿清解液所用药材山楂和/或陈皮中间体指纹图谱控制方法，包括将山楂和/或陈皮中间体制备的供试液，在上述的色谱条件下测试供试液指纹图谱，供试液指纹图谱与对照指纹图谱经计算机辅助相似度评价软件计算指纹图谱的相似度，获得相似度数值，依据指纹图谱相似度应大于0.90作为质控标准来控制山楂和/或陈皮中间体的质量。本发明所述的健儿清解液所用山楂和/或陈皮药材对照指纹图谱的获取方法为按上述方法制备多批次山楂和/或陈皮药材供试品溶液，按上述的色谱条件分析，获取多批次山楂和/或陈皮药材HPLC指纹图谱，以这些数据为基础，运用计算机辅助软件导出对照指纹图谱。上述的山楂药材对照指纹图谱的获取方法中参数设置为时间窗宽度0.10秒；校正方式采用多点校正；校正色谱峰的确定6个较高的色谱峰，峰1:18min、峰2:22.8min、峰3:28.3min、峰4:40.3min、峰5:40.8min、和峰6:58.2min;和/或陈皮药材对照指纹图谱的获取方法中参数设置为时间窗宽度0.10秒；校正方式采用多点校正；校正色谱峰的确定2个较高的色谱峰，峰1:43.5min、峰2:48.lmin。本发明所述的健儿清解液所用山楂和/或陈皮药材指纹图谱控制方法，包括将山楂和/或陈皮药材用溶剂提取制备样品的供试液，在上述的色谱条件下测试供试液指纹图谱，供试液指纹图谱与对照指纹图谱经计算机辅助相似度评价软件计算指纹图谱的相似度，获得相似度数值，依据指纹图谱相似度应大于0.90作为质控标准来控制山楂和/或陈皮药材的质量。本发明与现有技术相比具备以下有优点本发明针对健儿清解液的特性，建立起健儿清解液的指纹图谱体系，并以计算机辅助将产品指纹图谱与对照指纹图谱经进行指纹图谱的相似度评价，从而来控制健儿清解液产品的质量，使得产品质量稳定可靠，药性和疗效基本一致，安全性高，同时该方法操作方便、精度高、提高了生产效率。图1是空白试验的指纹图谱；图2是苯甲酸的指纹图谱；图3是健儿清解液120min的指纹图谱；图4A是10批健儿清解液(10ml规格)的指纹图谱叠加图；图4B是10批健儿清解液(10ml规格)的对照指纹图谱；图5A是IO批健儿清解液(100ml规格)的指纹图谱叠加图；图5B是IO批健儿清解液(100ml规格)的对照指纹图谱；图6A是7批山楂中间体的指纹图谱叠加图；图6B是7批山楂中间体的对照指纹图谱；图7A是6批陈皮中间体的指纹图谱叠加图；图7B是6批陈皮中间体的对照指纹图谱；图8A是7批山楂的指纹图谱叠加图；图8B是7批山楂的对照指纹图谱；图9A是6批陈皮的指纹图谱叠加图；图9B是6批陈皮的对照指纹图谱。具体实施例方式为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。健儿清解液指纹图谱分析方法建立及质量性评价具体情况如下本品的HPLC及LC/MS分析表明，药材、中间体和成品的色谱图有较多的信息及一定的相关性，采用国家药典会编写的"中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版"进行分析，生成了对照指纹图谱。经过多批次长期观察，发现成品批间的指纹图谱相似度差异较小。本品亦进行了GC及GC/MS分析，结果表明其相关性较差。故本项未列入质量标准中。1.1仪器与试剂Agilent1100LC系统(含在线真空脱气机，低压四元梯度泵或双高压泵，自动进样器，柱温箱，可变波长检测器(VWD)或光二极管阵列检测器(DAD)，色谱工作站；乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为去离子水；健儿清解液(国药控股深圳中药有限公司，批号(10ml):060105、060104、060111、060201、060203、060307、060317、060309、060315、060314;批号(100ml):060303、050304、050401、050601、050504、050701、050101、040701、040602、040404)、山楂与陈皮中间体(国药控股深圳中药有限公司)、山楂与陈皮药材(国药控股深圳中药有限公司)。81.2色谱条件的确定色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(ZorbaxSBC18，4.6mmX250mm，5ym)，流速1.OmL*min—、进样流量是1020y1，检测波长280nm，柱温25°C，采用梯度洗脱，流动相A为0.1%的甲酸水溶液，流动相B为含乙腈溶剂。梯度洗脱程序如下表1:表1流动相A与流动相B完整的梯度表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>1.3试品溶液的制备1.3.1健儿清解液供试品溶液的制备金银花、菊花、连翘、苦杏仁分别蒸馏提取芳香水；山楂用80%乙醇加热提取2次，每次2小时，过滤，合并滤液，滤液回收乙醇，浓縮成浸膏得山楂中间体，加水溶解制成山楂药液；陈皮用60%乙醇进行渗漉，收集渗漉液，回收乙醇，浓縮成浸膏得陈皮中间体，加水溶解制成陈皮药液；再合并上述药液及芳香水，加入适量枸橼酸、单糖浆及苯甲酸，加水使至1000ml，搅匀，过滤即得健儿清解液取健儿清解液过C18固相小柱，用水洗涤，弃去水洗涤液，再用甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液备用。1.3.2山楂与陈皮中间体供试品溶液的制备山楂中间体供试品溶液的制备取山楂中间体lml，用甲醇稀释至10ml，再取lml甲醇稀释液，接着用水稀释至10ml，通过C18固相小柱，用lml水洗涤，弃去水洗涤液，再用lml甲醇洗脱，收集洗脱液。陈皮中间体供试品溶液的制备取陈皮中间体lml，用水稀释至10ml，再通过C18固相小柱，接着用lml水洗涤，弃去水洗涤液，然后用lml甲醇洗脱，收集洗脱液，最后精密取甲醇洗脱液500iil，用甲醇稀释至lml。1.3.3山楂与陈皮药材供试品溶液的制备山楂药材供试品溶液的制备先用80%乙醇加热提取2次，每次两小时，过滤后合并滤液，接着浓縮成浸膏，再加适量的水溶解，然后取上述溶解液lml，通过C18固相小柱，用水1ml洗涤，弃去水洗涤液，再用甲醇1ml洗脱，收集洗脱液备用；陈皮药材供试品溶液的制备陈皮用60%乙醇进行渗漉，收集渗漉液，回收乙醇，浓縮成浸膏得陈皮中间体，加水溶解制成陈皮药液，然后取上述溶液lml，通过C18固相小柱，用水1ml洗涤，弃去水洗涤液，再用甲醇1ml洗脱，收集洗脱液备用；1.4指纹图建立方法分析1.4.1健儿清解液成品的指纹图建立方法分析1.4.1.l空白试验取纯化水lml，通过C18固相小柱(填料规格500mg)，临用前用甲醇3ml活化，再用水3ml洗涤)，用水lml洗涤，弃去水洗涤液，再用甲醇lml洗脱，收集洗脱液，即得空白溶液。精密吸取20ia，注入液相色谱仪，照色谱条件测定，结果见图l，结果表明空白不干扰称取苯甲酸1.5g，溶入1000ml水中，按上述方法制得苯甲酸供试品溶液。精密吸取20iU，注入液相色谱仪，照色谱条件测定，结果见图2。1.4.1.2仪器精密度精密吸取本品的同一供试品溶液(060303)，连续进样5次(进样量20y1)，测定主要色谱峰面积，结果见表2。表2仪器精密度试验结果峰号tR(min)峰面积保留时间RSD%峰面积RSD%111.969.26768.88668.37767.96667.6490.090.96212.6445.875442.914441.745442.216443.76900.37315.92093.4992096.8722098.1822092.4912082.64200.29428.1200.814198.786216.560216.213215.17304.25529.090.97990.93490.38790.29889.2620.020.77632.4182.799181.353179扁180.561203.09205.40740.057.24855,14056.14954.70553.9650.042.31843.110893.5610828.7910851.6110888.1810935.3300.38946.71961.9381945,5871951.1761932.2401899.58701.241047.9187.373176.686182.425174.940178.6850.052.761.4.1.3重复性取同一批供试品(0600303)1.Oml，平行5份，按正文指纹图谱项下的方法测定，测定主要色谱峰面积，结果见表3。表3重复性结果峰号tw(min)峰面积保留时间RSD%峰面积RSI)0/0111.969.26766.37568.32665.98667.4820.082.0112.7445.658448.374438,628435.534443.4290.02U8315.92186.5242093.3422090.1842103.2642128.07501.88428.1200.634199.786213.265210.372208,46202.9129.092.50690.95191.45990.29888.5280.021.63632.4183.942181.343178.629189.321185.08602.19740.057.34855.24555.14654.67853.8650.042.33843.110913.2410834.7910836.4810942.0810935.880.030.49946.71968.3821956.7681947.3491953.2461898.36701.391047.9189.623186.566182.325179.215180.6480.052.351.4.1.4稳定性取同一1共试品溶液(060303)，分别放置0、2、4、6、8、12小时，分别进样，;则定指纹图谱』犯定主要色谱峰面积，见表4。试验表明，在12小时内，供试品溶液稳定。表4稳定性考查结果保留峰面峰号t;j(min)峰面积、时间RSD%积%111.970.48769.81770.60970.53570.32869.3760.030.70212.8450.13450.171450.887451.881453.064446.85200.47315.92039.8612035.1632031,0492029.4902025.5372023.49000.30428.1196.869194.334197.662197.238196.234193.19400.9029.191.08586.21390.37891.38891.61490.0380.012.23632.4181.885190.59184.16186.636188.505187.09501.66740.160細55.77056.57253.80957.96455.8010.023.76843.211055.7611085.2511119.4711177.7011223.6511114.7900.55946.71848.8241826.6981812.9741790.9221767.3091740.20502.22保留峰面峰号t/f(min)峰面积时间RSD%积RSD%1048.0174.826180.771184.552182.449173.747179.1950.072.371.4.1.5记录时间的确定11按正文色谱条件，记录65分钟后，保持流动相比例不变继续记录55分钟(即记录120分钟指纹图谱)，见图3。结果表明，保留时间65120分钟内未检出色谱峰，故确定分析时间为65分钟。1.4.1.6健儿清解液对照指纹图谱的建立1.4.1.6.1计算软件采用国家药典会编写的"中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版"。1.4.1.6.2参数设置:参照谱图本品采用对照指纹图谱(共有模式)为参照谱图。时间窗宽度O.IO秒数据剪切主峰系制剂中的添加剂苯甲酸，对相似度计算供献较大，故不进行积分。校正方式相似度计算时采用多点校正方式。校正色谱峰的确定4个较高的色谱峰峰1(12.7min)峰2(15.9min)峰3(28.2min)峰4(46.8min)。根据试验结果，并参照《中药注射剂色谱指纹图谱实验研究技术指南》的规定，且本发明为口服制剂，规定本品的指纹图谱应与相同规格的健儿清解液对照指纹图谱相似，相似度不应低于0.90。1.4.2山楂中间体指纹图建立方法分析为了考察与成品的相关性，采用与健儿清解液相同的仪器，色谱条件、检测方法和供试品溶液制备。系统适应性试验见各该中间体指纹图谱标准草案。1.4.2.l仪器精密度精密吸取本品的同一供试品溶液(060303)，连续进样5次(进样量20y1)，测定主要色谱峰面积，结果见表5。表5仪器精密度试验结果峰号tw(min)峰面积保留时间RSD%峰面积RSD%112.050,86049.32047.12848.80847.83202.94215.340.83741.42740.62342.96942.36302.41317.753.33555.44951,88852.46854.15202.6312<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>1.4.2.3稳定性取同一供试品溶液(060303)，分别放置0、2、4、6、8、12小时，分别进样，测定指纹图谱，测定主要色谱峰面积，见表7。试验表明，在12小时内，供试品溶液稳定。表7稳定性试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>1.4.2.4山楂中间体对照指纹图谱的建立1.4.2.4.1计算软件采用国家药典会编写的"中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版"。1.4.2.4.2参数设置:参照谱图本品采用对照指纹图谱(共有模式)为参照谱图。时间窗宽度O.10秒数据剪切空白试验无干扰，故不需剪切。校正方式相似度计算时采用多点校正方式。校正色谱峰的确定6个強度较高的色谱峰(^分别约为18min、22.8min、28.3min、40.3min、40.8min、和58.2min)。根据试验结果，规定本品的指纹图谱应与山楂中间体对照指纹图谱相似，相似度不应低于0.90。1.4.3陈皮中间体指纹图建立方法分析1.4.3.l仪器精密度精密吸取本品的同一供试品溶液(060301)，连续进样5次(进样量20iU)，测定主要色谱峰面积，结果见表8。表8仪器精密度试验结果峰号t/(min)峰面积保留时间RSD%峰面积RSD%132.41186.9451190.6651196.1701190.8301189.40700.28243.39815.8789814.9219799.3769778.8039828.05800.19348.09356.4709361.6209371.4919372,7739381.9020.010.11452.3699.476702.562699.682703.220692.86100.5963.4588.421572.248574.210567.010583.75501.521.4.3.2重复性取同一批供试品(060301)1.0ml，平行5份，按指纹图谱的方法测定，领;u定主要色谱峰面积，结果见表9。表9重复性结果峰号tw(min)峰面积保留时间RSD%峰面积RSD%132.41186.9451190.6651190.8301189.4071194.05100.22243.39815.8789814.9219778.8039828.0589805.7310.030.19348.09356.4709361.6209372.7739381.9029394.7510.050.16452.3699.476702.562703.220682.861703.07501.25563.4576.850564.047576.543556.669589.65502.231.4.3.3稳定性取同一供试品溶液(060301)，分别放置0、2、4、6、8、12小时，分别进样，测定指纹图谱，测定主要色谱峰面积，见表10。试验表明，在12小时内，供试品溶液稳定。表10稳定性考查结果132.41219.2441236.9551233.0801230.69]1230.9681263.71501.2143.39905.1629跳8949977.2839944.1599884.7899724.6000.070.8848.09662.6499670.6869668.3779661.0699678.9999674.1810.090.07452.3696.27712.959720.64727.003685.972731.42302.51563.4謹.716805.304803.413795.520815細828,53902.901.4.3.4陈皮中间体对照指纹图谱的建立1.4.3.4.1计算软件采用国家药典会编写的"中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版"。1.4.3.4.2参数设置:15峰号tw(min)峰面积峰面积RSD%%留间D保时s参照谱图本品采用对照指纹图谱(共有模式)为参照谱图。时间窗宽度O.10秒数据剪切空白试验无干扰，故不需剪切。校正方式相似度计算时采用多点校正方式。校正色谱峰的确定2个强度较高的色谱峰(tK分别约为43.5min、48.lmin)。根据试验结果，规定本品的指纹图谱应与陈皮中间体对照指纹图谱相似，相似度不应低于0.90。1.4.4山楂药材指纹图建立方法分析1.4.4.l仪器精密度精密吸取本品的同一供试品溶液(060303)，连续进样5次(进样量20y1)，测定主要色谱峰面积，结果见表11。表11仪器精密度试验结果峰号t*(min)峰面积保留时间RSD%峰面积RSD%112.049.86249.32448.56348.80847.8420.031.57215.342.48641.35840.88642.63840.96202.01317.754,32155.32852.67952.84556.24302.85428.2986.375952.662930.182967.038952.6420.042.16528.799.864104.897103.248103.446106.5790.052.40630.9561.298548.216531.958538.524546.3680.062.03了32.5758.894761.526757.648730.056764.5860.051.85840.1155.679151.482156.346153.038147.8620.042.24940.7137.056138.163132.685130.546131.1280.032.601043,562.42664.03763.95462.02360.9860.022.081158.1125,876125.358122.648121.038120.0202.101.4.4.2重复性取同一批供试品(060303)1.0ml，平行6份，按指纹图谱的方法测定，测定主要色谱峰面积，结果见表12。表12重复性结果16<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>1.4.4.4.2参数设置:参照谱图本品采用对照指纹图谱(共有模式)为参照谱图；时间窗宽度O.IO秒；校正色谱峰的确定6个强度较高的色谱峰(^分别约为18min、22.8min、28.3min、40.3min、40.8min、和58.2min);根据试验结果，考虑到药材来源的稳定性，规定本品的指纹图谱应与山楂对照指纹图谱相似，相似度不应低于0.90。1.4.5陈皮药材指纹图建立方法分析1.4.5.l仪器精密度精密吸取本品的同一供试品溶液(060301)，连续进样5次(进样量20iU)，测定主要色谱峰面积，结果见表14。表14仪器精密度试验结果峰号.tfl(min)峰面积保留时间RSD%峰面积RSD%132.41060.5381089.5651095.2381091.8361089.5020.021.30243.38915,7868924.8688965.3648948.8038922,04700.2348.09556.4639361.6209247.5629372.7739185.9560.071.52452,3686.764702.562703.665703,282692.8850.031.09563.4586.436567.258569.896573.026583.7550.121.481.4.5.2重复性取同一批供试品(060301)1.Oml，平行5份，按指纹图谱的方法测定，测定主要色谱峰面积，结果见表15。表15重复性结果峰号t;j(min)峰面积保留时间RSD%峰面积RSD%132.41086.8971091.5621092,3561089.6621124.0550.041.40243.38855.6358903.8628978.9898628.0588705.7310.141.64348.09489.3549361.6209675.7859881.2049402.8630.082.25452.3701.567702.562708.223683.648710.0250.061.49563.4583.684561.264573.356557.669589.6860.122.411.4.5.3稳定性取同一供试品溶液(060301)，分别放置0、2、4、6、8、12小时，分别进样，测定指纹图谱，测定主要色谱峰面积，见表16。试验表明，在12小时内，供试品溶液稳定。表16稳定性考查结果tfl(min)峰面积保留时间RSD%峰面积RSD%132.41088.3641068.9561053.0621048.6851026.0381063.7150.021.99243.38957,3568跳5268757.2498689.8568484.5988924扁02.0548.09762.6499670.6869568.3779451.0699278.9999674.1800.041.85452.3724.277720.959709.640701.003685.972732.35602.39563.4851.716835.304813.413805.520800.068831.6340.072.411.4.5.4对照指纹图谱的建立1.4.5.4.1计算软件采用国家药典会编写的"中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版"。1.4.5.4.2参数设置参照谱图本品采用对照指纹图谱(共有模式)为参照谱图。时间窗宽度O.10秒数据剪切空白试验无干扰，故不需剪切。校正方式相似度计算时采用多点校正方式。校正色谱峰的确定2个强度较高的色谱峰(tK分别约为43.5min、48.lmin)。根据以上试验结果，考虑到药材来源的稳定性，规定本品的指纹图谱应与陈皮对照指纹图谱相似，相似度不应低于O.90。下面结合具体实施方式对本发明进行进一步说明。实施例1健儿清解液对照指纹图谱的获取及质量稳定性评价指纹图谱相似度计算结果各取IO批(10ml规格)和10批(100ml规格)的健儿清解液，按下述(1)项下供试品溶液制备方法制成健儿清解液供试品溶液，按(2)项下色谱条件分析(1)供试品溶液的制备方法取成品lml，通过C18固相小柱(填料规格为500mg，临用前用甲醇3ml活化，再用水3ml洗涤)，用水lml洗涤，弃去水洗涤液，再用甲醇lml洗脱，收集洗脱液，即得。(2)色谱条件高效液相色谱条件为色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(ZorbaxSBC18，4.6mmX250mm，5iim);采用梯度洗脱，流速1.OmL.min—、进样量20ii1，检测波长280nm，柱温25°C。流动相A为0.1%的甲酸水溶液，流动相B为含乙腈，梯度洗脱程序如表1。10批(10ml规格)健儿清解液指纹图谱叠加图4A和对照指纹图谱如图4B，相似度计算结别见表17;10批(100ml规格)健儿清解液指纹图谱叠加图5A和对照指纹图谱如图5B，相似度计算结别见表18。表1710批健儿清解液(10ml规格)的相似度<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>相似度平均值分别为0.965(10批，规格100ml/支)表17和表18结果表明，10批(10ml)和10批(100ml)健儿清解液的相似度值均大于0.95，结果表明，国药控股深圳中药有限公司生产的健儿清解液药品各批次和各规格间质量均一，稳定。实施例2山楂中间体对照指纹图谱的获取及质量稳定性评价指纹图谱相似度计算结果取7批山楂中间体，按下述(1)项下供试品溶液制备方法制成山楂中间体供试品溶液，按(2)项下色谱条件分析(1)供试品溶液的制备方法取山楂中间体lml，用甲醇稀释至10ml，取lml，用水稀释至10ml，通过C18固相小柱(填料规格为500mg，临用前用甲醇3ml活化，再用水3ml洗涤)，用水1ml洗涤，弃去水洗涤液，再用甲醇1ml洗脱，收集洗脱液。(2)色谱条件高效液相色谱条件为色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(ZorbaxSBC18，4.6mmX250mrn，5iim);采用梯度洗脱，流速1.OmL.min—、进样量20ii1，检20测波长280nm，柱温25°C，理论板数按主峰计应不低于80000。流动相A为0.1%的甲酸水溶液，流动相B为含乙腈，梯度洗脱程序如表1。7批山楂中间体指纹图谱叠加图6A和对照指纹图谱如图6B，相似度计算结别见表19;表197批山楂中间体的相似度<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表19结果表明，相似度平均值0.994(7批)，7批山楂中间体的相似度值均大于0.90。结果表明，国药控股深圳中药有限公司生产的健儿清解液药品的药材山楂中间体各批次间质量均一，稳定。根据以上试验结果，暂定本品的指纹图谱应与山楂中间体对照指纹图谱相似，相似度不应低于0.90。实施例3陈皮中间体对照指纹图谱的获取及质量稳定性评价指纹图谱相似度计算结果取6批陈皮中间体，按下述(1)项下供试品溶液制备方法制成陈皮中间体供试品溶液，按(2)项下色谱条件分析(1)供试品溶液的制备方法取陈皮中间体lml，用水稀释至10ml，通过C18固相小柱(填料规格为500mg，临用前用甲醇3ml活化，再用水3ml洗涤)，用水1ml洗涤，弃去水洗涤液，再用甲醇1ml洗脱，收集洗脱液，精密取出500iU，用甲醇稀释至1ml，即得。(2)色谱条件高效液相色谱条件为色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(ZorbaxSBC18，4.6mmX250mrn，5iim);采用梯度洗脱，流速1.OmL.min—、进样量20ii1，检测波长280nm，柱温25°C，理论板数按主峰计应不低于60000。流动相A为0.1%的甲酸水溶液，流动相B为含乙腈，梯度洗脱程序如表1。6批陈皮中间体指纹图谱叠加图7A和对照指纹图谱如图7B，相似度计算结别见表20;表206批陈皮中间体的相似度编号批号相似度值10603010.99520607010.9920606010.99740605010.9920605030.99360606020,945表20表明，相似度平均值0.986，6批陈皮中间体的相似度值均大于0.90。结果表明，国药控股深圳中药有限公司生产的健儿清解液药品的药材陈皮中间体各批次间质量均一，稳定。根据以上试验结果，暂定本品的指纹图谱应与陈皮中间体对照指纹图谱相似，相似度不应低于O.90。实施例4山楂药材对照指纹图谱的获取及质量稳定性评价指纹图谱相似度计算结果取7批山楂提取液，按下述(1)项下供试品溶液制备方法制成山楂中间体供试品溶液，按(2)项下色谱条件分析(1)供试品溶液的制备方法将山楂用80%乙醇加热提取2次，每次两小时，滤过，合并滤液，回收乙醇，浓縮成浸膏，加适量的水溶解。取上述溶液lml，通过C18固相小柱(填料规格为500mg，临用前用甲醇3ml活化，再用水3ml洗涤)，用水1ml洗涤，弃去水洗涤液，再用甲醇1ml洗脱，收集洗脱液，即得。(2)色谱条件高效液相色谱条件为色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(ZorbaxSBC18，4.6mmX250mrn，5iim);采用梯度洗脱，流速1.OmL.min—、进样量20ii1，检测波长280nm，柱温25°C，理论板数按主峰计应不低于80000。流动相A为0.1%的甲酸水溶液，流动相B为含乙腈，梯度洗脱程序如表1。7批山楂指纹图谱叠加图8A和对照指纹图谱如图8B，相似度计算结别见表21;表217批山楂药材的相似度编号批号相似度值10602010.95520603010.92130606010.96840606020.9690601010.98260512010.97670607020.985表21表明，相似度平均值0.965，7批山楂的相似度值均大于0.90。结果表明，国药控股深圳中药有限公司生产的健儿清解液药品的药材山楂提取液体各批次间质量均一，稳定。根据以上试验结果，考虑到药材来源的稳定性，暂定本品的指纹图谱应与山楂对照指纹图谱相似，相似度不应低于0.90。实施例522陈皮对照指纹图谱的获取及质量稳定性评价指纹图谱相似度计算结果取6批陈皮提取液，按下述(1)项下供试品溶液制备方法制成陈皮中间体供试品溶液，按(2)项下色谱条件分析(1)供试品溶液的制备方法陈皮用60%乙醇进行渗漉，收集渗漉液，回收乙醇，浓縮成浸膏，加适量水溶解；取上述溶液1ml，通过C18固相小柱(填料规格为500mg，临用前用甲醇3ml活化，再用水3ml洗涤)，用水1ml洗涤，弃去水洗涤液，再用甲醇1ml洗脱，收集洗脱液，即得。(2)色谱条件高效液相色谱条件为色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(ZorbaxSBC18，4.6mmX250mrn，5iim);采用梯度洗脱，流速1.OmL.min—、进样量20ii1，检测波长280nm，柱温25°C，理论板数按主峰计应不低于60000。流动相A为0.1%的甲酸水溶液，流动相B为含乙腈，梯度洗脱程序如表1。6批陈皮指纹图谱叠加图9A和对照指纹图谱如图9B，相似度计算结别见表22;表226批陈皮的相似度^^相似度值10603010.98320607010.98630606010.995^相似度值i060501O細50605030.991_^_030311_0.935_表22结果表明，相似度平均值0.978，6批陈皮的相似度值均大于0.90。结果表明，国药控股深圳中药有限公司生产的健儿清解液药品的药材陈皮提取液体各批次间质量均一，稳定。根据以上试验结果，考虑到药材来源的稳定性，暂定本品的指纹图谱应与陈皮对照指纹图谱相似，相似度不应低于0.90。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。2权利要求一种健儿清解液指纹图谱控制方法，其特征在于包括将健儿清解液成品配制的供试液，在一定的色谱条件下测试供试液指纹图谱，供试液指纹图谱与对照指纹图谱经计算机辅助相似度评价软件计算指纹图谱的相似度，获得相似度数值，依据指纹图谱相似度应大于0.90作为质控标准来控制健儿清解液的质量。2.根据权利要求1所述的健儿清解液指纹图谱控制方法，其特征在于所述的健儿清解液指纹图谱建立方法，包括如下步骤1)健儿清解液供试品溶液的制备先将金银花、菊花、苦杏仁、连翘分别蒸馏提取芳香水；将山楂用乙醇加热提取后按顺序进行过滤留滤液、浓縮成浸膏得山楂中间体、加水溶解制成山楂药液；陈皮用乙醇进行渗漉，将渗漉液浓縮成浸膏得陈皮中间体，加水溶解制成陈皮药液；再合并上述药液及芳香水，加入适量枸橼酸、单糖浆及苯甲酸，加水定容，搅匀，过滤即得健儿清解液。取健儿清解液过C18固相小柱，用水洗涤，弃去水洗涤液，再用甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液备用；2)测试吸取健儿清解液供试品溶液注入液相色谱仪，依照高效液相色谱法测定，制定健儿清解液指纹图谱，其中，高效液相色谱条件为色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；采用梯度洗脱，流动相A为0.1%的甲酸水溶液，流动相B为乙腈；梯度洗脱程序如下0分钟时，97%流动相A、3X流动相B;13分钟时，95%流动相A、5X流动相B;27分钟时，85%流动相A、15X流动相B;35分钟时，80%流动相A、20X流动相B;45分钟时，80%流动相A、20X流动相B;60分钟时，72%流动相A、28X流动相B;65分钟时，40%流动相A、60X流动相B;67分钟时，0%流动相A、100X流动相B;75分钟时，0%流动相A、100X流动相B;90分钟时，97%流动相A、3X流动相B;流速1.OmLmin—1;检测波长280nm;柱温25°C。3.根据权利要求2所述的健儿清解液指纹图谱控制方法，其特征在于所述步骤(1)中健儿清解液供试品溶液的制备1)将金银花、菊花、苦杏仁、连翘分别蒸馏提取芳香水；2)将山楂用80%乙醇加热提取2次，每次2小时，过滤，合并滤液，滤液回收乙醇，浓縮成浸膏得山楂中间体，加水溶解制成山楂药液；3)将陈皮用60%乙醇进行渗漉，收集渗漉液并浓縮成浸膏得陈皮中间体，加水溶解制成陈皮药液；4)合并上述各步所得的药液及芳香水，在加入枸橼酸0.020.08g、单糖浆200400ml及苯甲酸，加水定容至1000ml，搅匀，过滤即得健儿清解液成品；5)取健儿清解液成品0.52ml，通过C18固相小柱，用水0.52ml洗涤，弃去水洗涤液，再用甲醇0.52ml洗脱，收集洗脱液备用；所述的步骤(2)中色谱条件为进样量1020iU，流速l.OmL'min—1;检测波长280nm;柱温25°C。4.根据权利要求2所述的健儿清解液指纹图谱控制方法，其特征在于所述的步骤(2)中流动相A溶液配制比例是按体积百分比配制，所述的流动相B溶剂为色谱纯，所述的C18固相小柱的填料规格500mg，临用前用甲醇3ml活化，再用水3ml洗涤。5.根据权利要求2所述的健儿清解液的指纹图谱控制方法，其特征在于所述的山楂和/或陈皮中间体指纹图谱建立方法，包括如下步骤1)山楂中间体供试品溶液的制备取山楂中间体O.52mL，用甲醇稀释至10ml，再取lml甲醇稀释液，接着用水稀释至10ml，通过C18固相小柱，用0.52mL水洗涤，弃去水洗涤液，再用0.52mL甲醇洗脱，收集洗脱液；和/或陈皮中间体供试品溶液的制备取陈皮中间体O.52mL，用水稀释至10ml，再通过C18固相小柱，接着用0.52mL水洗涤，弃去水洗涤液，然后用0.52mL甲醇洗脱，收集洗脱液，最后精密取甲醇洗脱液500iil，用甲醇稀释至lml;2)测试精密吸取山楂和/或陈皮中间体供试品溶液注入液相色谱仪，依照高效液相色谱法及权利要求2步骤(2)的色谱条件测定，制定山楂和/或陈皮中间体指纹图谱。6.根据权利要求2所述的健儿清解液的指纹图谱控制方法，其特征在于所述的山楂和/或陈皮药材指纹图谱建立方法，包括如下步骤1)山楂药材供试品溶液的制备先用80%乙醇加热提取2次，每次两小时，过滤后合并滤液，接着浓縮成浸膏，再加适量的水溶解，然后取上述溶解液0.52mL，通过C18固相小柱，用水0.52mL洗涤，弃去水洗涤液，再用甲醇0.52mL洗脱，收集洗脱液备用；和/或陈皮药材供试品溶液的制备陈皮用60%乙醇进行渗漉，收集渗漉液并浓縮成浸膏，再加适量水溶解，然后取上述溶液0.52mL，通过C18固相小柱，用水`0.52mL洗涤，弃去水洗涤液，再用甲醇0.52mL洗脱，收集洗脱液备用；2)测试精密吸取山楂和/或陈皮药材供试品溶液分别注入液相色谱仪，依照高效液相色谱法及权利要求2步骤(2)的色谱条件测定，制定山楂和/或陈皮药材指纹图谱。7.根据权利要求2所述的健儿清解液的指纹图谱控制方法，其特征在于所述的健儿清解液对照指纹图谱的获取方法按权利要求2步骤(1)所述方法制备IO批次健儿清解液样品供试品溶液，按权利要求2步骤(2)的色谱条件分析，获取10批次健儿清解液HPLC指纹图谱，以该10批次的数据为基础，运用计算机辅助软件导出对照指纹图谱。8.根据权利要求7所述的健儿清解液的指纹图谱控制方法，其特征在于所述的健儿清解液对照指纹图谱的获取方法中参数设置为时间窗宽度0.10秒；校正方式采用多点校正；校正色谱峰的确定4个较高的色谱峰峰1:12.7min、峰2:15.9min、峰3:28.2min、峰4:46.8min。9.根据权利要求7所述的健儿清解液的指纹图谱控制方法，其特征在于所述的山楂和/或陈皮中间体对照指纹图谱的获取方法按权利要求5步骤(1)所述方法制备多批次山楂和/或陈皮中间体供试品溶液，按权利要求2步骤(2)色谱条件分析，获取多批次山楂和/或陈皮中间体HPLC指纹图谱，以这些数据为基础，运用计算机辅助软件导出对照指纹图谱。10.根据权利要求9所述的健儿清解液的指纹图谱控制方法，其特征在于所述的山楂中间体对照指纹图谱的获取方法中参数设置为时间窗宽度0.10秒；校正方式采用多点校正；校正色谱峰的确定6个较高的色谱峰，峰1:18min、峰2:22.8min、峰3:28.3min、峰4:40.3min、峰5:40.8min、峰6:58.2min;和/或陈皮中间体对照指纹图谱的获取方法中参数设置为时间窗宽度0.10秒；校正方式采用多点校正；校正色谱峰的确定2个较高的色谱峰，峰1:43.5min、峰2:48.lmin。11.根据权利要求9所述的健儿清解液的指纹图谱控制方法，其特征在于所述山楂和/或陈皮中间体指纹图谱控制方法，包括将山楂和/或陈皮中间体制备的供试液，在权利要求2步骤(2)的色谱条件下测试供试液指纹图谱，供试液指纹图谱与对照指纹图谱经计算机辅助相似度评价软件计算指纹图谱的相似度，获得相似度数值，依据指纹图谱相似度应大于0.90作为质控标准来控制山楂和/或陈皮中间体的质量。12.根据权利要求7所述的健儿清解液的指纹图谱控制方法，其特征在于所述的山楂和/或陈皮药材对照指纹图谱的获取方法为按权利要求6步骤(1)所述方法制备多批次山楂和/或陈皮药材供试品溶液，按权利要求2步骤(2)的色谱条件分析，获取多批次山楂和/或陈皮药材HPLC指纹图谱，以这些数据为基础，运用计算机辅助软件导出对照指纹图谱。13.根据权利要求12所述的健儿清解液的指纹图谱控制方法，其特征在于所述的山楂药材对照指纹图谱的获取方法中参数设置为时间窗宽度0.10秒；校正方式采用多点校正；校正色谱峰的确定6个较高的色谱峰，峰1:18min、峰2:22.8min、峰3:28.3min、峰4:40.3min、峰5:40.8min、和峰6:58.2min;和/或陈皮药材对照指纹图谱的获取方法中参数设置为时间窗宽度0.10秒；校正方式采用多点校正；校正色谱峰的确定2个较高的色谱峰，峰1:43.5min、峰2:48.lmin。14.根据权利要求12所述的健儿清解液的指纹图谱控制方法，其特征在于所述山楂和/或陈皮药材指纹图谱控制方法，包括将山楂和/或陈皮药材用溶剂提取制备样品的供试液，在权利要求2步骤(2)的色谱条件下测试供试液指纹图谱，供试液指纹图谱与对照指纹图谱经计算机辅助相似度评价软件计算指纹图谱的相似度，获得相似度数值，依据指纹图谱相似度应大于0.90作为质控标准来控制山楂和/或陈皮药材的质量。全文摘要本发明公开了一种健儿清解液指纹图谱控制方法，包括将健儿清解液成品配制的供试液，在一定的色谱条件下测试供试液指纹图谱，供试液指纹图谱与对照指纹图谱经计算机辅助相似度评价软件计算指纹图谱的相似度，获得相似度数值，依据指纹图谱相似度应大于0.90作为质控标准来控制健儿清解液的质量。本发明针对健儿清解液的特性，建立起健儿清解液的指纹图谱体系，并以计算机辅助将产品指纹图谱与对照指纹图谱进行相似度评价，从而来控制健儿清解液产品的质量，使得产品质量稳定可靠，药性和疗效基本一致，安全性高，同时该方法操作方便、精度高、提高了生产效率。文档编号A61K36/752GK101744920SQ201010108838公开日2010年6月23日申请日期2010年2月4日优先权日2010年2月4日发明者刘力,刘强,刘灿群,孙国英,张春丽,李秋怡,殷米来,苏丽静,金霞,陈剑洪,黄超申请人:国药控股深圳中药有限公司