专利名称：轭合方法
技术领域：
本发明涉及使效应基团(例如，细胞毒性剂)或报道基团(例如，放射性标记)与细胞结合剂例如抗体或其片段通过双官能连接体轭合的新方法。更具体地，本发明涉及使效应基团(例如，美登木素生物碱)或报道基团(例如，放射性标记)与细胞结合剂(例如抗体或其片段)通过双官能连接体轭合的新方法，使得该过程消除了导致由于分子内或分子间反应而生成的不期望的水解物类或不期望的交联物类生成的步骤。
背景技术：
细胞结合剂例如抗体与效应基团例如小细胞毒性剂或细胞毒性蛋白的轭合物在开发抗癌治疗剂方面引起浓厚兴趣(Richart，A.D.和Tolcher，A. W. ,2007, Nature Clinical Practice, 4, 245-25) 0这些轭合物由于针对肿瘤细胞的细胞表面上表达的抗原所选择的抗体的高特异性而是肿瘤特异性的。当特异性结合至肿瘤细胞时，抗体-细胞毒性剂轭合物被内化入靶癌细胞并在其中降解，由此释放抑制必要细胞功能例如微管动力学或DNA复制的活性细胞毒性剂，导致癌细胞的杀伤。已经采用各种连接体连接抗体与细胞毒性剂，目的是增强内化时细胞内物质的递送和轭合物的加工，同时保持轭合物在血浆中期望的稳定性。这些连接体包括被设计具有不同程度的空间位阻而影响其分子内硫醇还原动力学的二硫化物连接体、可裂解的肽连接体例如缬氨酸-瓜氨酸连接、和不可裂解连接体例如硫醚连接(ffiddison, W.等，J. Med. Chem.，2006，49，4392-4408 ;Erickson，H.等， Cancer Res. ，2006，66，4426-4433)。细胞结合剂例如抗体与标记或报道基因的轭合物用于癌症患者的肿瘤成像应用、 诊断各种疾病的免疫测定应用、使用放射性核素-配体轭合物的癌症疗法、和纯化生物活性剂例如蛋白、肽和寡核苷酸的亲和色谱应用。与细胞结合剂轭合的标记或报道基因包括荧光团和亲和标记例如生物素。经由不可还原的连接(例如硫醚连接)连接的细胞结合剂例如抗体(Ab)与效应基团(例如，细胞毒性剂)或报道基团(例如，放射性标记)的常规轭合方法采用两个不同的抗体反应步骤，并必须使用纯化步骤。在第一反应步骤中，抗体与带有两个不同反应性基团(例如，X和Y)的异双官能连接体反应。例如，在一种方法中，抗体的反应性残基(例如赖氨酸氨基残基)与异二双官能试剂的X反应性基团(例如N-羟基琥珀酰亚胺酯)的反应导致在抗体的一个或多个反应性残基(例如赖氨酸氨基残基)处加入具有Y反应性基团的连接体。最初修饰的抗体产物必须在可以发生下一步骤之前从过量连接体或水解连接体试剂纯化。在第二反应步骤中，含有Y反应性基团(例如马来酰亚胺或卤代乙酰胺)的连接体修饰的抗体与含有反应性基团例如硫醇的效应物例如效应基团(C)(例如，细胞毒性剂)反应生成抗体-效应物轭合物，其在额外纯化步骤中再次纯化(参见例如，美国专利 5，208，020,5, 416，064或5，024, 834)。因此，在以上方法中，需要至少两个纯化步骤。
包括两个反应和纯化步骤以轭合抗体与效应基团或报道基团的另一种方法利用抗体中的硫醇残基(通过用硫醇生成试剂例如2-亚胺基硫烷修饰抗体或者通过诱变加入非天然半胱氨酸残基或者通过还原天然二硫键而产生)与含有Y反应性基团(例如马来酰亚胺或卤代乙酰胺)的同双官能连接体Y-L-Y反应。在抗体或肽中加入反应性基团Y例如马来酰亚胺(或卤代乙酰胺)的主要缺点是反应性马来酰亚胺(或卤代乙酰胺)基团与抗体或肽中天然组氨酸、赖氨酸、酪氨酸或半胱氨酸残基经历分子内或分子间反应(Papini, A.等，ht. J. P印t. Protein Res.，1992，39， 348-355 ；Ueda, T.等，Biochemistry, 1985，24，6316-6322)，以及 Y 马来酰亚胺基团的水性失活。在与效应基团或报道基团C的第二反应之前，抗体中加入的马来酰亚胺(或卤代乙酰胺)基团Y与抗体中天然组氨酸、赖氨酸或半胱氨酸残基的不期望的分子内或分子间反应以及Y马来酰亚胺基团的水性失活产生交联蛋白或不均一轭合物并降低与效应基团或报道基团C的第二反应的效率。不均一轭合物产物一由于最初加入的基团Y(例如马来酰亚胺基团)与抗体或肽中天然基团(例如组氨酸、赖氨酸、酪氨酸或半胱氨酸)的不期望反应或水性失活产生的无活性马来酰亚胺残基而产生的交联蛋白或肽一可能具有比期望的均一轭合产物差的活性和稳定性。之前已经描述了通过二硫键轭合抗体与含硫醇细胞毒性剂的方法(参见例如，美国专利 5，208，020,5, 416，064,6, 441，163，美国专利公开号 2007/0048314 Al)。这些方法包括抗体与异双官能试剂的最初反应，随后与含硫醇细胞毒性剂的第二反应。已经在美国专利6，441，163 Bl中描述了可选方法，其中细胞毒性剂的二硫化物连接的反应性酯首先被纯化，然后与抗体反应，但是该方法在抗体反应步骤之前包括从含硫醇基细胞毒性剂开始的额外的反应和纯化步骤。目前制备细胞结合剂轭合物的方法的其他缺点是需要两个纯化步骤，这两个纯化步骤降低了总产率，并且还使该方法对于放大生产而言变得繁琐和不经济。鉴于以上所述，本领域需要开发制备细胞结合剂-药物轭合物组合物的改良方法，所述细胞结合剂-药物轭合物组合物具有很高纯度并且其制备不需要繁琐步骤并减少了用户的时间和成本。本发明提供了这种方法。本发明的这些和其他优点以及其他发明特征将根据本文提供的发明描述而变得明显。发明概述本发明描述了用于制备式C-L-CBA的不可还原的硫醚连接的轭合物的轭合方法， 其中C代表效应分子或报道分子(例如，细胞毒性剂或放射性标记)，L是连接体，CBA是细胞结合剂(例如，抗体或其片段)，通过利用含硫醇细胞毒性剂(例如，美登木素生物碱)与异或同双官能试剂(例如，可裂解或不可裂解的连接体)的直接反应，随后混合未纯化的反应混合物与细胞结合剂(例如，抗体或其片段)，由此通过更有效、高产率且容易放大的工艺产生不可还原的硫醚连接的轭合物。另一个重要的优点是这种轭合方法产生无链间蛋白交联或失活残基(例如，马来酰亚胺或卤代乙酰胺残基)的硫醚连接的不可还原的轭合物。 本说明书公开的新方法可用于制备由上式表示的任何轭合物。附图简述
图1显示了抗体与美登木素生物碱DMl (或DM4)和马来酰亚胺-PEGn-NHS连接体的反应混合物的轭合。
图2显示使用本发明描述的方法制备的Ab-(PEG4-Mal)-DM4轭合物与使用传统两步方法制备的轭合物的还原SDS-PAGE。每个样品泳道含有IOyg蛋白；凝胶用考马斯蓝染色。泳道1和2含有分子量标志物。泳道3含有通过传统两步方法制备的具有6. 1DM4/Ab 的轭合物。泳道4含有通过本发明描述的方法制备并且含有6. 2DM4/Ab的轭合物。图3显示了使用本发明描述的方法制备的Ab-(PEG4-Mal)_DM4轭合物与使用传统两步方法制备的轭合物的蛋白LabChip电泳。A. Ab-(PEG4-Mal)-DM4轭合物在还原条件下的蛋白 LabChip 电泳(Agilent 2100 Bioanalyzer/Agilent Protein 230 试剂盒)。泳道1 分子量标记物；泳道2 使用本发明描述的方法合成的Ab-PEG4-Mal-DM4，6. 2D/Ab ；泳道3 使用两步轭合方法合成的Ab-PEG4-Mal-DM4，6. 1D/Ab ；泳道4 未轭合的Ab (每条泳道 0. 24微克总蛋白)。较高标记物、系统峰和较低标记物条带代表从试剂盒添加的外部标记物。B.来自蛋白LabChip电泳的蛋白条带的定量。图4显示了使用本发明描述的方法制备的Ab-(PEG4-Mal)-DM4轭合物与使用传统两步方法制备的轭合物的MS。Α.通过传统两步方法制备的具有6. 1DM4/Ab的轭合物的MS。 由于轭合物的明显不均一性，MS峰不能良好分辨。B.通过本发明描述的方法制备并含有 6. 1DM4/Ab的轭合物的MS。由于轭合物的均一性，MS峰被良好分辨。图5显示了具有6. 7DM1/抗体的抗CanAg抗体-PEQ-Mal-DMl轭合物(使用本发明描述的方法制备)对表达CanAg抗原的C0L0205细胞的结合与未修饰抗体对表达CanAg 抗原的C0L0205细胞的结合。结合使用荧光单位测量。图6显示了具有6. 7DM1/抗体的抗CanAg抗体-PEG4-Mal-DMl轭合物(使用本发明描述的方法制备)对表达CaniVg抗原的C0L0205细胞的体外细胞毒性。轭合物被添加至 C0L0205细胞，在与轭合物连续孵育5天之后，使用WST-8测定法测量细胞存活。使用过量未轭合的抗CanAg抗体阻断轭合物对靶癌细胞的结合和细胞毒性来进行对照试验以说明轭合物的特异性。图7显示抗体与DMl (或DM4)和马来酰亚胺-磺基-NHS连接体的反应混合物的轭合。图8显示使用本发明描述的方法制备的Ab-(磺基-MaD-DMl轭合物与使用传统两步方法制备的轭合物的还原SDS-PAGE。每个样品泳道含有IOyg蛋白；凝胶用考马斯蓝染色。泳道1含有分子量标志物。泳道3和5含有通过本发明描述的方法制备并分别含有 3. 6/Ab和6. 2DM4/Ab的轭合物。泳道2和4含有通过传统两步方法制备并分别含有4. 0/ Ab和5. 7DM1/Ab的轭合物。图9显示了使用本发明描述的方法制备的Ab-(磺基-MaD-DMl轭合物与使用传统两步方法制备的轭合物的蛋白LabChip电泳。A. Ab-(磺基-MaD-DMl轭合物在还原条件下的蛋白 LabChip 电泳(Agilent 2100 Bioanalyzer/Agilent Protein 230 试剂盒)。泳道1 分子量标记物；泳道2 未轭合的Ab ；泳道3 使用两步轭合方法合成的Ab-磺基-Mal-DM1，5. 7D/Ab ；泳道4 使用本发明描述的方法合成的Ab-磺基_Mal_DMl，5. 6D/Ab ； 每孔0. 22微克总蛋白。较高标记物、系统峰和较低标记物条带代表从试剂盒添加的外部标记物(每孔0. M微克总蛋白)。B.来自蛋白LabChip电泳的蛋白条带的定量。图10显示了通过本发明描述的方法制备的抗体_(磺基-MaD-DMl轭合物与通过传统两步轭合方法制备的轭合物的LC-MS比较。A.使用本发明描述的方法制备的具有
53. 6DM1/Ab的轭合物的MS显示具有1-6DM1分离轭合物峰的均一轭合物。B.通过传统两步轭合方法制备的具有4. 0DM1/Ab的轭合物的MS显示对应于轭合物以及具有水解或交联连接体的轭合物(例如具有2DM1的轭合物，加一个L、两个L和三个3L)的峰，表明不均一的产物。图11显示了具有5. 6DM1/抗体的抗CanAg抗体-磺基-Mal-DMl轭合物(使用本发明描述的方法制备)对表达CanAg抗原的C0L0205细胞的结合与未修饰抗体对表达 CanAg抗原的C0L0205细胞的结合。结合以荧光单位测量。图12显示了具有5. 6DM4/抗体的抗CanAg抗体-磺基-Mal-DMl轭合物(使用本发明描述的方法制备)对表达CaniVg抗原的C0L0205细胞的体外细胞毒性。轭合物被添加至C0L0205细胞，在与轭合物连续孵育5天之后，使用WST-8测定法测量细胞存活。使用过量未轭合的抗CanAg抗体阻断轭合物对靶癌细胞的结合和细胞毒性来进行对照试验以说明轭合物的特异性。图13显示抗体与DMl (或DM4)和磺基-NHS SMCC连接体的反应混合物的轭合。图14显示使用本发明描述的方法制备的Ab-(SMCC)-DMl轭合物与使用传统两步方法制备的轭合物的还原SDS-PAGE。每个样品泳道含有IOyg总蛋白；凝胶用考马斯蓝染色。泳道1含有分子量标志物，泳道2含有未轭合的Ab，泳道3含有通过传统两步方法制备的具有3. 1DM1/Ab的轭合物，泳道4含有通过本发明描述的方法制备的具有3. 1DM1/Ab的轭合物。图15显示了使用本发明描述的方法制备的Ab-(SMCC)-DMl轭合物与使用传统两步方法制备的轭合物的蛋白LabChip电泳。A. Ab-SMCC-DMl轭合物在还原条件下的蛋白 LabChip 电泳(Agilent 2100 Bioanalyzer/Agilent Protein 230 试剂盒)。泳道 1 分子量标记物；泳道2 使用本专利描述的方法合成的Ab-SMCC-DMl，3. 1D/Ab ；泳道3 未轭合的 Ab ；泳道4 使用两步轭合方法合成的Ab-SMCC-DMl，3. 1D/Ab ；(每个泳道含有0. 24微克总蛋白)。较高标记物、系统峰和较低标记物条带代表从试剂盒添加的外部标记物。B.来自蛋白LabChip电泳的蛋白条带的定量。图16显示了通过本发明描述的方法制备的抗体-(SMCC)-DMl轭合物与通过传统两步轭合方法制备的轭合物的LC-MS比较。A.通过连续两步方法制备的具有3. 1DM1/Ab的轭合物的MS。由于水解和交联的连接体片段的存在，每个主要轭合物峰具有伴随的侧峰。 B.通过本发明描述的方法制备的具有3. 1DM1/Ab的轭合物的MS。由于轭合物的均一性，MS 峰被良好分辨。图17显示了所提出的通过传统两步方法轭合期间链间交联和马来酰亚胺失活的机制。图18显示使用本发明描述的方法制备的Ab-(磺基-Mal)_DM4轭合物的非还原 SDS-PAGE以及在抗体轭合反应之前使用4-马来酰亚胺丁酸猝灭游离DM4硫醇(在初始 DM4+NHS-磺基-Mal异双官能试剂偶联反应之后)。每个样品含有IOyg蛋白；凝胶用考马斯蓝染色。泳道1和5含有分子量标志物。泳道2含有单独的Ab。泳道3含有通过本发明描述的方法制备的轭合物，未添加4-马来酰亚胺丁酸。泳道4含有通过本发明描述的方法制备的轭合物，在初始DM4+NHS-磺基-Mal异双官能试剂之后(在抗体轭合步骤之前)添加4-马来酰亚胺丁酸。
图19显示了使用DMl (或DM4)和SPDB连接体的反应混合物制备二硫化物连接的抗体轭合物。图20显示通过抗体与DMl (或DM4)和SPDB和NHS_PEG4_Mal连接体两者的未纯化反应混合物轭合而制备具有二硫化物和不可裂解的PEG4-Mal连接体的抗体-美登木素生物碱轭合物。图21显示具有二硫化物和不可裂解的PEG4_Mal连接体的抗体-美登木素生物碱轭合物(通过抗体与DMl或DM4与SPDB和NHS_PEG4_Mal连接体两者的未纯化反应混合物轭合而制备)的MS。图22显示抗体与DMl (或DM4)和SMCC连接体的反应混合物的轭合。图23显示通过本发明描述的方法使用SMCC制备的抗体-SMCC-DMl轭合物的MS， 所述轭合物含有平均3. IDMl/抗体。图M显示使用DMl (或DM4)和SSNPB连接体的反应混合物制备二硫化物连接的抗体轭合物。图25显示抗体与DMl (或DM4)和具有脂肪族线性碳链的异双官能连接体的反应混合物的轭合。发明详述现在详细参考本发明的某些实施方案，其实例以所附结构和式描述。虽然结合所列举的实施方案描述了本发明，但要理解，它们不是要将本发明限制于那些实施方案。相反，本发明预期涵盖权利要求书限定的本发明范围内可能包括的所有替代、修改和等同物。 本领域技术人员将知道可用于实施本发明的与本文描述的那些类似或等同的许多方法和材料。本发明描述了使含硫醇的效应基团(例如，细胞毒性剂)或报道基团(例如，放射性标记)与细胞结合剂(例如，抗体)轭合的新方法，其中含硫醇的效应物或报道分子首先与双官能连接体试剂在有机、水性或有机/水性混合溶剂中反应，随后未纯化的反应混合物与细胞结合剂在有机、水性或有机/水性混合溶剂中反应。图例缩写以下方案和实施例的描述中使用的缩写是C =效应基团或报道基团(例如，细胞毒性剂或放射性标记)L =连接体(例如，可裂解或不可裂解的连接体)X =胺反应性基团(例如，N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)、磺基-NHS酯、对硝基苯酚酯、四氟磺酸苯基酯、1-羟基-2-硝基-苯-4-磺酸酯)Y =马来酰亚胺或卤代乙酰胺(碘乙酰胺、溴乙酰胺)Yb是反应性混合二硫基(例如，2-吡啶基二硫基、4-吡啶基二硫基、2-硝基-吡啶基二硫基、5-硝基-吡啶基二硫基、2-羧基-5-硝基-吡啶基二硫基)X'=酰胺键Y'=硫醚(R-S-R')或硒醚(Rle-R')键Yb' = 二硫(R-S-S-R')键在本发明的一个实施方案中，描述了用于制备细胞结合剂与效应分子或报道分子的硫醚连接的轭合物的方法，该方法包括以下步骤a)使式X-L-Y的异双官能连接体与含硫醚的效应分子或报道分子C(例如，美登木素生物碱或放射性核素)在水性溶剂、有机溶剂或有机/水性混合反应混合物中接触，产生式X-L-Y' -C的中间产物；b)使反应混合物无需纯化与细胞结合剂例如抗体(Ab)混合产生式Ab_(X' -L-Y'轭合物，其中L是
具有1-10个碳原子的取代或未取代的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基、简单或取代的芳基单元(取代基选自烷基、烷氧基、商素、硝基、氟代、羧基、磺酸酯、磷酸酯、氨基、羰基、 哌啶基)或含有聚乙二醇的单元(优选1-500个PEG间隔物、更优选I-M个PEG间隔物或更优选2-8个PEG间隔物)；X和Y是胺或硫醇反应性基团例如N-羟基琥珀酰亚胺酯和马来酰亚胺或卤代乙酰胺；Ab是抗体；m是1-20的整数；X'是与抗体反应时修饰的X位点(例如，酰胺键)；Y'是与例如效应基团或报道基团的细胞毒性剂或放射性标记反应时修饰的 Y位点(例如，硫醚键)；和c)通过正切流动过滤、透析或色谱(例如，凝胶过滤、离子交换色谱、疏水相互作用色谱)或其组合纯化轭合物。优选地，Y是选自马来酰亚胺或卤代乙酰胺的硫醇反应性基团。优选地，L是具有1-6个碳或2-8个PEG间隔物的直链或支链烷基。 优选地，C是选自美登木素生物碱、CC-1065类似物、紫杉烷、DNA结合剂的细胞毒性剂，并且更优选地，它是美登木素生物碱。式1禾Π 2中表示的反应工序X-L-Y+C — X-L-Y' -C (1)Ab+X-L-Y' -C (从反应 1 未纯化)一Ab-(X' -L-Y' -C)m(2)不涉及中间产物X-L-Y' -C的任何纯化，并且因此提供了将之与抗体直接混合 (未纯化的中间产物被添加至抗体，或者抗体被添加至未纯化的中间产物)的优势，从而使该方法有利于轭合，因为这不需要繁琐的纯化步骤。重要的是，与通过传统两步反应和纯化工序制备的轭合物中发现的链间蛋白交联和失活马来酰亚胺残基不同，该方法产生没有链间蛋白交联或失活马来酰亚胺残基的均一轭合物。反应1可以高浓度的异双官能连接体、X-L-Y和效应基团或报道基团C在水性溶剂、有机溶剂或有机/水性反应混合物中进行，导致比通过传统两步反应和纯化工序制备的轭合物的水性溶液中较低浓度时更快的反应速率。反应1中产生的中间产物X-L-Y' -C可以未纯化的低温冷冻状态在适当低pH(例如，pH 4-6)的水性溶剂、有机溶剂或混合的有机/水性混合物中或者以冻干状态保存延长的时段，并且可以在后来与抗体溶液混合以在约4-9的较高pH值下进行最终的轭合反应，由此增加该反应工序的方便性。中间产物可以在与细胞结合剂混合之前按需要用有机溶剂或水性缓冲液或有机溶剂与水性缓冲液的混合物稀释。在本文结合数值使用的术语"约"应该被理解为指所有此类数值，包括来自其的所有数值和小的变化。中间产物 X-L-Y' -C与抗体的反应可以在以下pH值下进行约4至约pH9、优选约5至8. 7的pH范围、更优选约 6. 5 至约 8. 5 的 pH 范围、例如 pH 6. 5,6. 6,6. 7,6. 8,6. 9,7. 0,7. 1,7. 2,7. 3、 7. 4,7. 5,7. 6,7. 7,7. 8,7. 9,8. 0,8. 1,8. 2,8. 3,8. 4 和 8. 5、其中的 pH 范围或其小变化。用于抗体与中间产物X-L-Y' -C在约6. 5至约8. 5的优选pH范围下反应的缓冲液是pKa值在该PH范围附近的缓冲液，例如磷酸盐缓冲液和HEPES缓冲液。这些优选的缓冲液不应该具有伯氨基或仲氨基或者可以与连接体X (例如N-羟基琥珀酰亚胺酯)反应的其他反应性基团。在第一反应中使用比异双官能连接体X-L-Y化学计量或略微过量的C以保证在向抗体添加未纯化混合物之前所有Y基团(例如马来酰亚胺)被反应。可以进行用猝灭试剂(例如4-马来酰亚胺丁酸、3-马来酰亚胺丙酸或N-乙基马来酰亚胺或碘乙酰胺或碘乙酰胺丙酸)的任选额外处理以保证任何未反应的C在与抗体混合之前被猝灭以最小化硫醇-二硫化物与天然抗体二硫基的任何不希望的交换反应。在用极性带电硫醇猝灭试剂 (例如4-马来酰亚胺丁酸或3-马来酰亚胺丙酸)猝灭时，过量的未反应的C被转化成极性带电加合物，其可以容易地与共价连接的轭合物分离。任选地，最终反应混合物在纯化之前与亲核物质例如含氨基的亲核物质(例如，赖氨酸、牛磺酸、羟胺)反应以猝灭任何未反应的连接体(X-L-Y' -C)。用于抗体与美登木素生物碱(DMx)和异双官能连接体的未纯化的初始反应混合物反应的可选方法包括将DMx和异双官能连接体的初始反应混合物与抗体在低pH (pH 5) 下混合(在DMx-连接体反应结束时)，随后添加缓冲剂或碱以增加pH至约6. 5-8. 5以进行轭合反应。该新方法用于制备抗体与细胞毒性美登木素生物碱药物的轭合物。基于还原 SDS-PAGE、蛋白LabChip电泳和质谱对轭合物的鉴定，使用在反应工序1_2中列出的该方法制备的抗体-美登木素生物碱轭合物出乎意料地在均一性方面远优于通过传统两步反应和纯化工序制备的轭合物。包括反应工序1-2的本发明描述的轭合方法不需要任何中间纯化步骤，并因此显著比传统两步方法更方便。在本发明的第二个实施方案中，描述了用于制备细胞结合剂与效应分子或报道分子的硫醚连接轭合物的方法，该方法包括以下步骤a)使式Y-L-Y的同双官能连接体与含硫醇或胺的效应基团或报道基团C (例如细胞毒性剂)在水性溶剂、有机溶剂或有机/水性混合反应混合物中接触以产生Y-L-Y' -C，b)反应混合物无需纯化与例如抗体在水性溶液或水性/有机混合物中混合产生式Ab-(X' -L-Y' -C)m的轭合物，其中L如上文定义；Y是硫醇或胺反应性基团例如马来酰亚胺或卤代乙酰胺，或N-羟基亚磺酰亚胺或磺基N-羟基亚磺酰亚胺；Ab是抗体；m是1至20的整数；Y'是与抗体反应时修饰的Y位点(例如，硫醚键或酰胺键)或与细胞毒性剂或效应基团或报道基团反应时修饰的Y位点(例如，硫醚键或酰胺键)，和c)通过正切流动过滤、透析或色谱(例如，凝胶过滤、离子交换色谱、疏水相互作用色谱)或其组合纯化轭合物。式3和4中表示的反应工序Y-L-Y+C — Y-L-Y' -C (3)Ab+Y-L-Y ‘ -C (从反应 3 未纯化)—Ab- (Y ‘ -L-Y ‘ -C) m (4)不涉及中间产物Y-L-Y' -C的任何纯化，并因此是有利的轭合方法。在第三个实施方案中，描述了用于制备细胞结合剂与效应分子或报道分子的二硫化物连接的轭合物的方法，该方法包括以下步骤a)使式X-L-Yb的异双官能连接体与效应基团或报道基团C (例如细胞毒性剂)在水性溶剂、有机溶剂或有机/水性混合反应混合物中接触以产生中间产物X-L-Y/ -C ；b)使反应混合物无需纯化与抗体在水性溶液或水性/ 有机混合物中混合产生式Ab-(X' -L-Yb'轭合物，其中L如上文定义；Yb是反应性二硫化物例如吡啶基二硫化物或硝基吡啶基二硫化物；X是胺反应性基团例如N-羟基琥珀酰亚胺酯或磺基N-羟基琥珀酰亚胺酯；Ab是抗体；m是1至20的整数；X'是与抗体反应时修饰的X位点(例如酰胺键)Jb是与细胞毒性剂或效应基团或报道基团反应时修饰的 Yb位点(二硫化物)；和c)通过正切流动过滤、透析或色谱(例如，凝胶过滤、离子交换色谱、疏水相互作用色谱)或其组合纯化轭合物。反应工序以式5和6表示X-L_Yb+C — X-L-Y/ -C (5)Ab+X-L-Yb ‘ -C (从反应 5 未纯化)—Ab- (X-L-Yb ‘ -C) m (6)在第四个实施方案中，描述了通过两个类型的连接体一不可裂解的(硫醚键)和可裂解的(二硫键)一制备抗体与效应基团或报道基团轭合物的方法，该方法包括以下步骤a)使X-L-Y和X-L-%连接体与细胞毒性剂C接触以产生式X-L-Y' -C和X-L-Yb' -C 的中间化合物，b)如反应式7-9所示使反应混合物无需纯化与抗体顺序或同时混合X-L-Y+C — X-L-Y' -C (7)X-L-Yb+C — X-L-Yb ‘ -C (8)Ab+X-L-Y ‘ -C+X-L-Yb ‘ -C (从反应 7-8 未纯化)一Ab- (X ‘ -L-Y ‘ -C) m(X' -L-Yb ‘ -C)m' (9)以提供轭合物Ab-(X' -L-Y' -C)m(X' -L-Yb' _C)m'，其中 X、L、Y'、C、Yb' 和m的定义如上文给出，并且m'是1至20的整数；和c)通过正切流动过滤、透析或色谱 (例如，凝胶过滤、离子交换色谱、疏水相互作用色谱)或其组合纯化轭合物。这两个连接体效应中间体(X-L-Y' -C和X-L-Yb' -C)无需纯化以不同顺序(首先X-L-Y' -C、然后 X-L-Yb' -C，或者首先X-L-Yb' -C、然后X-L-Y' -C，或者同时)和不同比例与抗体混合。反应1、3、5和7-8可以高浓度双官能连接体(X_L_Y、X-L-Yb或Y_L_Y)和效应基团或报道基团C在水性溶剂、有机溶剂或有机/水性反应混合物中进行，导致比通过传统两步反应和纯化工序制备的轭合物的水性溶液中较低浓度时更快的反应速率，其中试剂溶解度是限制性的。在反应1、3、5和7-8中产生的中间产物X-L-Y' -C或Y-L-Y' -C或X_L_Yb' -C 可以未纯化的低温冷冻状态在适当低PH的水性溶剂、有机溶剂或混合的有机/水性混合物中或者以冻干状态保存延长的时段，并且可以在后来与抗体溶液混合以进行最终的轭合反应，由此增加该反应工序的方便性。在第一反应中使用比异双官能连接体X-L-Y或Y-L-Y或X-L-Yb化学计量或略微过量的C以保证在向抗体添加未纯化混合物之前所有Y基团(例如马来酰亚胺)被反应。 可以进行用猝灭试剂(例如4-马来酰亚胺丁酸或3-马来酰亚胺丙酸或N-乙基马来酰亚胺或碘乙酰胺或碘乙酸)的任选额外处理以保证任何未反应的基团(例如硫醇)在添加至抗体之前被猝灭以最小化硫醇-二硫化物与天然抗体二硫基的任何不希望的交换反应。在 C与双官能连接体初始反应之后，用带电极性硫醇猝灭试剂猝灭过量的C，使过量C转化成高极性的水溶性加合物，其容易通过凝胶过滤、透析或TFF与共价连接的轭合物分离。最终轭合产物不含有任何非共价连接的C。任选地，最终反应混合物2、4、6和9在纯化之前用亲核物质例如含氨基的亲核物质(例如，赖氨酸、牛磺酸、羟胺)处理以猝灭任何未反应的连接体(X-L-Y' -C、Y-L-Y' -C 或 X-L-Yb' -C)。抗体与DMx和双官能连接体的未纯化初始反应混合物的反应的可选方法包括将 DMx和异双官能连接体的初始反应混合物与抗体在低pH(pH 5)下混合(在DMx-连接体反应结束时)，随后添加缓冲剂或碱以增加PH至约6. 5-8. 5以进行轭合反应。通过将衍生自两种或多种不同效应物的两种或多种连接体-效应物中间体无需纯化地顺序或同时添加至抗体，超过一种类型效应物的多个拷贝可以与抗体轭合。
效应基团术语效应基团或效应分子可互换使用并且本文使用的术语"效应基团"或"效应分子"意思是包括细胞毒性剂。在某些方面，可能希望效应基团或效应分子通过各种长度的间隔臂连接以降低潜在位阻。超过一种效应子的多个拷贝可以通过向抗体顺序或同时添加未纯化的衍生自两个或多个不同效应子的两个或多个连接体-效应物中间体而轭合至抗体。可用于本发明的细胞毒性剂包括化疗剂或化疗剂的结构类似物。“化疗剂" 是用于治疗癌症的化合物。化疗剂的实例包括烷化剂，例如硫化三环氮丙基磷和环磷酰胺(CYTOXAN )；磺酸烷基酯例如白消安、英丙舒凡和嗪消安；氮丙啶例如benzodopa、 卡波醌、meturedopa和uredopa ；氮丙啶和甲基三聚氰胺，包括六甲基蜜胺、三亚乙基蜜胺、三乙烯磷酰胺、三乙烯硫代磷酰胺和三甲基三聚氰胺；己酸配质(特别是bullatacin 和bullatacinone)；喜树碱(包括合成的类似托泊替康)；苔藓抑素；callystatin ； CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；crypt0phycin(特别是 cryptophycin 1和cryptophycin 8)；多拉司他汀；倍癌霉素(包括合成类似物KW-2189 和CBI-TMI)；软珊瑚醇；pancratistatin ；匍枝珊瑚醇；海绵抑制素；氮芥，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、cholophosphamide、雌氮芥、异环磷酰胺、双氯乙基甲胺、盐酸甲氧氮芥、苯丙氨酸氮芥、新氮芥、胆留醇对苯乙酸氮芥、泼尼氮芥、氯乙环磷酰胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，例如亚硝基脲氮芥、氯脲菌素、福替目丁、环己亚硝脲、嘧啶亚硝脲、雷莫司汀；抗生素， 例如烯二炔抗生素(例如，加利车霉素，特别是加利车霉素Yl和加利车霉素ΘΙ，参见例如 Angew Chem Intl. Ed. Engl. 33 :183-186(1994) ；dynemicin,包括 dynemicin A ；埃斯波霉素；以及新制癌菌素生色团及相关的色蛋白烯二炔抗生素生色团chromomophores)、 aclacinomysins、方文线菌素、authramycin、重氮丝氨酸、博莱霉素、方文线菌素C、carabicin、 洋红霉素、嗜癌霉素；色霉素、放线菌素D、道诺红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸、阿霉素(包括吗啉代-阿霉素、氰基吗啉代-阿霉素、2-吡咯啉代-阿霉素和脱氧阿霉素)、表柔比星、依索比星、去甲氧基柔红霉素、麻西罗霉素、nitomycins、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、派来霉素、potfiromycin、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链唑霉素、杀结核菌素、乌苯美司、新制癌菌素、佐柔比星；抗代谢物，例如氨甲喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸、氨甲喋呤、蝶酰三谷氨酸、曲美沙特；B票呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；pyrimnidine类似物，例如盐酸环胞苷、氮杂胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、5氟脱氧尿苷、5-FU ；雄激素，例如卡鲁睾酮、丙酸屈他雄酮、表硫雄醇、环戊缩环硫雄烷、睾内酯；抗肾上腺，例如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，例如亚叶酸；乙酰葡醛酸内酯；酸磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；bestrabucil ；比山群；edatraxate ；defofamine ；地美可辛；地吖醌；elfomithine ；醋酸羟哔咔唑；环氧聚微管素；环氧甘醚；环氧甘醚；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美登木素生物碱，例如美登素和安丝菌素；丙米腙；米托蒽醌；单哌潘生丁 ；二胺硝吖啶；喷司他丁 ；蛋氨氮芥；吡喃阿霉素；鬼臼酸；2-乙基酰胼；甲基苄胼；PSK.丙亚胺；根霉素；西佐喃；诸螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2，2'，2〃 -三氯乙胺；单端孢霉烯族毒素(特别是T-2毒素、verracurin Α、杆孢菌素A和anguidine)； 氨基甲酸乙酯；长春花碱酰胺；氮烯唑胺；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；溴丙哌
11嗪；gacytosine;阿拉伯糖苷(〃 Ara-C")；环磷酰胺；硫化三环氮丙基磷；紫杉烷，例如紫杉醇(TAXOL, , Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ.)和多烯紫杉醇 (TAXOTERE ，Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6_ 硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲喋呤；钼类似物，例如顺钼和卡钼；长春花碱；钼；表鬼臼毒素(VP-16)； 异环磷酰胺；丝裂霉素C ；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；诺消灵；表鬼白毒噻吩糖苷；道诺霉素；氨喋呤；希罗达；伊班膦酸盐；CPT-Il ；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000 ；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；卡培他滨；和以上任何的药学可接受的盐、酸或衍生物。 该定义还包括作用为调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素剂，例如抗雌激素，包括例如三苯氧胺、雷洛昔芬、芳香酶抑制性4( -咪唑、4-羟基三苯氧胺、曲沃昔芬、keoxifene, LY117018、奥那司酮和托瑞米芬(Fareston)；和抗雄激素，例如氟他米特、尼鲁米特、比卡鲁胺、Ieuprolide和戈舍瑞林；siRNA和以上任何的药学可接受的盐、酸或衍生物。可用于本发明的其他化疗剂公开于美国公开号20080171040或美国公开号20080305044，并通过引用整体并入。在一个优选实施方案中，化学治疗性细胞毒性剂基本上是小分子细胞毒性剂。“ 小分子药物〃在本文广泛用于指可以具有例如100至1500、更适合120至1200、优选200 至1000的分子量且通常具有小于约1000的分子量的有机化合物、无机化合物或有机金属化合物。本发明的小分子细胞毒性剂包括具有小于约1000分子量的寡肽和其他生物分子。 小分子细胞毒性剂在本领域被良好表征，例如在W005058367A2、欧洲专利申请号85901495 和8590319中，以及在美国专利号4，956，303及其他中，其通过引用整体并入。优选的小分子细胞毒性剂是允许连接至细胞结合剂的那些。本发明包括已知的细胞毒性剂以及可以变成已知的那些。特别优选的小分子细胞毒性剂包括细胞毒性剂。细胞毒性剂可以是导致细胞死亡或诱导细胞死亡或以某种方式降低细胞存活的任何化合物，其中每种细胞毒性剂包括硫醇部分。优选的细胞毒性剂是美登木素生物碱化合物、紫杉烷化合物、CC-1065化合物、道诺红霉素化合物和阿霉素化合物、吡咯并苯并二氮卓二聚体、加利车霉素、auristatin及其类似物和衍生物，其中的一些在下文描述。不一定是小分子的其他细胞毒性剂例如siRNA也包括在本发明范围内。例如， siRNA可以通过常用于修饰寡核苷酸的方法连接至本发明的交联剂(参见例如美国专利公开20050107325和20070213^2)。因此，以其3'或5'-亚磷酰胺形式的siRNA与带有羟基官能团的交联剂的一端反应而在siRNA和交联剂之间产生酯键。类似地，siRNA亚磷酰胺与带有末端氨基的交联剂反应导致交联剂与siRNA通过胺连接。siRNA详细描述于美国专利公开号:20070275465,20070213292,20070185050,20070161595,20070054279, 20060287260、20060035254、20060008822、20050288244、20050176667，其在此通过引用整体并入。美登木素生物碱可用于本发明的美登木素生物碱是本领域公知的，并且可以根据已知方法从天然来源分离或根据已知方法合成制备。适合的关登木素生物碱的实例包括美登醇和美登醇类似物。适合的美登醇类似物的实例包括具有修饰的芳族环的那些和具有其他位置修饰的那些。
具有修饰的芳族环的适合的美登醇类似物的具体实例包括(1)C-19-脱氯(美国专利号4，256，746)(通过LAH还原美登木素P2来制备)；(2)C-20_羟基(或C-20-脱甲基)+/-C_19-脱氯(美国专利号4，361，650和 4，307，016)(通过使用链霉菌或放线菌脱甲基或者使用LAH脱氯来制备)；和(3)C-20-脱甲氧基、C-20-酰氧基(-0C0R)、+/-脱氯(美国专利号4，294, 757) (通过使用酰基氯酰化来制备)。具有其他位置修饰的适合的美登醇类似物的具体实例包括(l)C-9-SH(美国专利号4，424，219)(通过美登醇与H2S或P2S5反应来制备)；(2)C-14_烷氧基甲基(脱甲氧基/CH20R)(美国专利号4，331，598)；(3)C-14-羟基甲基或酰氧基甲基(CH20H或CH20Ac)(美国专利号4，450，254)(从诺卡菌制备)；(4)C-15-羟基/酰氧基(美国专利号4，364，866)(通过链霉菌转化美登醇来制(5)C-15-甲氧基(美国专利号4，313，946和4，315，929)(从滑桃树分离)；(6)C-18-N-脱甲基(美国专利号4，362，663和4，322，348)(通过链霉菌对美登醇脱甲基来制备)；和(7)4，5-脱氧(美国专利号4，371，53 (通过三氯化钛/LAH还原美登醇来制备)。用于本发明的含硫醇美登木素生物碱的合成完全公开于美国专利号5，208，020、 5，416，064和美国专利申请号20040235840。预期在C-3位置、C-14位置、C-15位置或C_20位置具有硫醇部分的美登木素生物碱都是有用的。C-3位置是优选的，并且美登醇的C-3位置是特别优选的。N-甲基-丙氨酸-含C-3硫醇部分的美登木素生物碱和N-甲基-半胱氨酸-含C-3硫醇部分的美登木素生物碱和每一种的类似物也是优选的。用于本发明的N-甲基-丙氨酸-含C-3硫醇部分的美登木素生物碱衍生物的具体实例由式M1、M2、M3、M6和M7表示。
权利要求
1.一种在溶液中制备纯化的轭合物的方法，其中所述轭合物包括与细胞结合剂连接的效应分子或报道分子，所述方法包括以下步骤(a)使所述效应分子或报道分子与双官能连接体试剂接触以共价连接所述连接体与所述效应分子或报道分子并由此制备包含具有与之连接的连接体的所述效应分子或报道分子的未纯化的第一混合物，(b)通过所述未纯化的第一混合物与细胞结合剂反应而使所述细胞结合剂与具有与之连接的连接体的所述效应分子或报道分子轭合以制备第二混合物，和(c)使所述第二混合物经受正切流动过滤、透析、凝胶过滤、吸附色谱、选择性沉淀或其组合以由此制备纯化的轭合物。
2.权利要求1所述的方法，其中步骤(b)在pH约4至约9的溶液中进行。
3.权利要求1所述的方法，其中步骤(b)的第二混合物基本上不含由于分子内或分子间反应而生成的不期望的交联的、水解的物类。
4.权利要求1所述的方法，其中所述效应分子是细胞毒性剂。
5.权利要求4所述的方法，其中所述细胞毒性剂是美登木素生物碱、紫杉烷、CC1065或其类似物。
6.权利要求4所述的方法，其中所述细胞毒性剂是美登木素生物碱。
7.权利要求6所述的方法，其中所述美登木素生物碱包含硫醇基。
8.权利要求6所述的方法，其中所述美登木素生物碱是DMl。
9.权利要求6所述的方法，其中所述美登木素生物碱是DM4。
10.权利要求1所述的方法，其中所述细胞结合剂是干扰素、白介素2(IL-2)、白介素 3 (IL-3)、白介素 4 (IL-4)、白介素 6 (IL-6)、胰岛素、EGF、TGF- α、FGF、G-CSF, VEGF、MCSF、 GM-CSF、运铁蛋白或抗体。
11.权利要求10所述的方法，其中所述细胞结合剂是抗体。
12.权利要求11所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
13.权利要求11所述的方法，其中所述抗体是人或人源化单克隆抗体。
14.权利要求10所述的方法，其中所述抗体是ΜΥ9、抗Β4、EpCAM,⑶2、⑶3、⑶4、⑶5、 CD6、CD11、CD19、CD20、CD22、CD26、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD44、CD56、CD79、CD105、 CD138、EphA 受体、EphB 受体、EGFR、EGFRvIII、HER2、HER3、间皮素、cripto、α ν β 3、α ν β 5、 ανβ6整联蛋白或C242。
15.权利要求13所述的方法，其中所述人或人源化抗体是My9-6、B4、CM2、N901、DS6、 EphA2受体、CD38、IGF-IR、CNTO 95、B-B4、曲司珠单抗、帕妥株单抗、比伐珠单抗、西罗珠单抗或利妥昔单抗。
16.权利要求1所述的方法，其中所述连接体是可裂解或不可裂解的连接体。
17.权利要求1所述的方法，其中所述报道分子是放射性同位素。
全文摘要
本发明描述了使细胞结合剂例如抗体与效应基团(例如，细胞毒性剂)或报道基团(例如，放射性标记)轭合的方法，由此报道基团或效应基团首先与双官能连接体反应，然后混合物无需纯化而用于与细胞结合剂的轭合反应。本发明描述的方法有利于制备细胞结合剂例如抗体与效应基团或报道基团的稳定连接的轭合物。该轭合方法以高产率提供了高纯度和均一性的轭合物，该轭合物没有链间交联和失活的连接体残基。
文档编号A61K51/00GK102448500SQ201080024325
公开日2012年5月9日 申请日期2010年6月2日 优先权日2009年6月3日
发明者B·A·克洛格, R·V·J·查理, R·辛 申请人:免疫基因公司