专利名称：胱氨酸/谷氨酸反向转体xCT抑制剂在肝癌治疗中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及肿瘤学领域。更具体地，本发明涉及胱氨酸/谷氨酸反向转体XCT在肝癌检测和预后方面的应用。本发明还涉及胱氨酸/谷氨酸反向转体XCT抑制剂在肝癌治疗中的应用。
背景技术：
氨基酸转运体系统-Xe (system-xc) 一种异二聚体氨基酸运输载体，由轻链xCT和重链4F2hc两种亚基组成，在介导胱氨酸摄入同时伴随着细胞内谷氨酸排出。 胱氨酸/谷氨酸反向转体xCT是氨基酸转运体系统-Xe (system-xc)的一个功能性亚基。xCT在细胞摄取胱氨酸和维持细胞内谷胱甘(Glutathione，GSH)肽含量及细胞内氧化还原平衡方面起着重要作用。研究显示一些疾病的发生与该基因的异常有关。然而，迄今为止尚没有xCT与肝癌相关的报道。原发性肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是我国最常见恶性肿瘤之一，占居民肿瘤死亡第二位。肝癌出现症状时多属中晚期，切除后复发、转移率高。因此，肝癌的早期诊断以及肝癌的预后判断对采用合理的治疗手段、延长患者的生存时间和降低肝
癌死亡率具有重要意义。因此，本领域迫切需要开发与肝癌诊断和治疗相关的蛋白。
发明内容
本发明的目的就是提供一种与肝癌诊断和治疗相关的蛋白xCT。本发明的另一目的是提供所述蛋白xCT及其拮抗剂在肝癌诊断和治疗方面的应用。在本发明的第一方面，提供了一种胱氨酸/谷氨酸反向转体xCT基因或蛋白的用途，它被用于(a)制备检测肝癌的试剂或试剂盒；或(b)制备进行肝癌预后的试剂或试剂盒。在另一优选例中，所述的试剂盒包括对xCT进行定量检测的试剂以及相应的标签或说明书。在另一优选例中，所述的标签或说明书中记载了以下使用说明对胱氨酸/谷氨酸反向转体XCT进行定量检测，并将检测结果用于表征肝癌几率高低和/或肝癌预后。在另一优选例中，所述的试剂包括xCT特异性抗体，或xCT的特异性引物。在另一优选例中，上述的试剂包括检测用芯片，包括核酸芯片和蛋白质芯片。在另一优选例中，所述的核酸芯片包括基片和点样在基片上的癌症相关基因的特异性寡核苷酸探针，所述的癌症相关基因的特异性寡核苷酸探针包括与xCT的特异性结合的探针。在另一优选例中，所述的蛋白质芯片包括基片和点样在基片上的癌症相关蛋白的特异性抗体，所述的癌症相关蛋白的特异性抗体包括抗xCT的特异性抗体。
在本发明的第二方面，提供了一种胱氨酸/谷氨酸反向转体XCT的用途，它被用作肝癌预后的标志物。在本发明的第三方面，提供了一种用于检测肝癌预后的诊断试剂盒，所述的试剂盒含有一容器，所述容器中含有检测胱氨酸/谷氨酸反向转体xCT的检测试剂；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测或诊断肝癌预后。在另一优选例中，所述的检测试剂包括特异性抗体和/或特异性引物。在另一优选例中，所述的标签或说明书中注明以下内容当检测对象的xCT的mRNA表达量与P -肌动蛋白的mRNA表达量之比^ 0. 0025 (较佳地> 0. 003，更佳地> 0. 004)，则表明该对象的预后差(低于全体或一般肝癌患者的平均预后)；和/或当检测对象的xCT的mRNA表达量与P -肌动蛋白的mRNA表达量之比< 0. 002 (较 佳地< 0. 002，更佳地< 0. 001)，则表明该对象的预后好(高于全体或一般肝癌患者的平均预后)。在另一优选例中，所述的试剂盒用于检测人肝脏样品或血液样品。在本发明的第四方面，提供了一种胱氨酸/谷氨酸反向转体xCT拮抗剂的用途，所述的拮抗剂被用于制备抑制肝癌细胞生长或增殖的药物，或用于制备治疗肝癌的药物。在另一优选例中，所述的拮抗剂包括xCT的抗体、xCT的反义RNA、siRNA、以及xCT的活性抑制剂。在另一优选例中，所述的xCT的活性抑制剂是柳氮磺胺卩比唳(sulfasalazine,SASP)。在本发明的第五方面，提供了一种体外非治疗性的抑制癌细胞生长或增殖的方法，包括步骤在xCT拮抗剂存在下，培养癌细胞，从而抑制癌细胞生长或增殖。在另一优选例中，所述的方法包括向癌细胞的培养体系中添加xCT拮抗剂，从而抑制抑制癌细胞生长或增殖。在另一优选例中，所述的癌细胞是肝癌细胞。在本发明的第六方面，提供了一种筛选治疗肝癌的候选化合物的方法，所述方法包括步骤(a)测试组中，在细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察所述测试组的细胞中胱氨酸/谷氨酸反向转体xCT的表达量和/或活性；在对照组中，在相同细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察对照组的所述细胞中胱氨酸/谷氨酸反向转体xCT的表达量和/或活性；其中，如果测试组中细胞的xCT的表达量和/或活性小于对照组，就表明该测试化合物是对xCT的表达和/或活性有抑制作用的治疗肝癌的候选化合物。在另一优选例中，所述的细胞包括肝癌细胞、肝细胞以及其他非癌细胞。在另一优选例中，所述的xCT活性是通过活性氧(ROS)检测而得出的。在另一优选例中，所述方法还包括步骤(b)对于步骤(a)中获得的候选化合物，进一步测试其对肝癌细胞生长或增殖的抑制作用。在另一优选例中，在步骤(b)中包括步骤测试组中，肝癌细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察肝癌细胞的数量和/或生长情况；在对照组中，在肝癌细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察肝癌细胞的数量和/或生长情况；其中，如果测试组中肝癌细胞的数量或生长速度小于对照组，就表明该测试化合物是对肝癌细胞的生长或增殖有抑制作用的治疗肝癌的候选化合物。在本发明的第七方面，提供了一种抑制或治疗癌症的方法，包括步骤给需要治疗的对象(哺乳动物)施用安全有效量的胱氨酸/谷氨酸反向转体xCT拮抗剂的用途。在另一优选例中，所述的癌症包括肝癌。在另一优选例中，所述的拮抗剂包括xCT的抗体、xCT的反义RNA、siRNA、以及xCT的活性抑制剂。在另一优选例中，所述的xCT的活性抑制剂是柳氮磺胺卩比唳(sulfasalazine,SASP)。 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
图I显示了 xCT在癌组织中的表达水平要明显高于对应的癌旁组织及正常肝组织(图1A)并且低表达xCT的病人的相对于高表达的病人有更好的预后(图1B)。图2显示了 xc的两个亚基(xCT亚基和4F2hc亚基)在多种肝癌细胞系中mRNA相对表达(基于P -肌动蛋白进行归一化处理)(图2A和2B)，以及xCT蛋白在多种肝癌细胞系中的表达(图2C)。图3显示了 xCT的抑制剂SASP能够显著抑制肝癌细胞Huh_7和SK-H印-I的生长。图4显示了针对xCT的拮抗剂siRNAs可以抑制Huh_7和SK-Ifep-I细胞内的xCT表达，并且进而抑制肝癌细胞的生长和增殖。图5显示了 xCT拮抗剂能够抑制肝癌细胞Huh-7和SK-Hep-I的克隆形成能力。图中，"blank"表示空白对照。图6显示了 xCT拮抗剂能够抑制肝癌细胞Huh-7体内移植瘤的生长。
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，xCT在各种肝癌细胞系中均有高表达，可作为肝癌检测的标志物用于检测或辅助性检测肝癌。此外，xCT的表达或活性高低与病人的预后相关，可作为病人预后的判断指标。此外，xCT的拮抗剂可抑制癌细胞的生长。在此基础上完成了本发明。具体地，本发明人通过试验证实，xCT在各种不同肝癌细胞系中有高表达，并且在病人的在肝癌组织中的表达明显高于对应的癌旁组织或正常肝脏组织。此外，高表达或高活性的xCT和病人的预后呈现负相关性。因此，xCT在肝癌细胞或组织中表达情况，可用于辅助性诊断或判断检测对象患肝癌的几率高低、以及肝癌病人的预后。试验还证明，应用xCT的特异抑制剂柳氮磺胺卩比唳(sulfasalazine, SASP)及干扰RNA(siRNA)可以在体外明显抑制肝癌细胞的生长和克隆形成能力；SASP还能在体内抑制肿瘤的生长。因此，使用xCT拮抗剂来抑制xCT的功能，可以抑制体外和体内的肝癌细胞的生长，从而为肝癌的治疗提供了新的途径。xCT蛋白和多核苷酸在本发明中，“本发明蛋白”、“本发明多肽”、“xCT蛋白”可互换使用，指胱氨酸/谷氨酸反向转体xCT。应理解，所述术语还包括xCT的活性片段和衍生物。在本发明中，“本发明基因”、“本发明多核苷酸”指编码xCT蛋白或其活性片段和衍生物的核苷酸序列，包括正义和反义核酸。在本发明中，术语“xCT蛋白”、“xCT多肽”或“肝癌标志物xCT”可互换使用，都指具有人蛋白xCT氨基酸序列的蛋白或多肽。胱氨酸/谷氨酸反向转体xCT的核苷酸和氨基酸序列可参见Primary GenBankAccession :NM—014331，Entrez Gene ID :23657, UniProt ID :Q9UPY5。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。如本文所用，“分离的xCT蛋白或多肽”是指xCT蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化xCT蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码xCT的成熟多肽的多核苷酸包括只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码多肽的功能。本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段，包括正义和反义的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码xCT蛋白的多核苷酸。本发明的人xCT核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或xCT蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的xCT蛋白。一般来说有以下步骤 (I).用本发明的编码人xCT蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人xCT编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CH0、COS、或293细胞的动物细胞等。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结
口 o抗体本发明还包括对人xCT蛋白具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人xCT基因产物或片段。较佳地，指那些能与人xCT基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。
抗人xCT蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人xCT蛋白。拮抗剂和药物组合物利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与xCT蛋白发生相互作用的物质，尤其是抑制剂或拮抗剂等。本发明xCT蛋白的拮抗剂(包括抗体、抑制剂)，当在治疗上进行施用(给药)时，可抑制xCT蛋白的表达和/或活性，进而抑制癌细胞(包括肝癌)的生长或增殖。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)瘤内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明xCT拮抗剂(如抗体、反义序列(如siRNA)、或抑制剂)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约I微克-10毫克/千克体重。检测方法和试剂盒本发明还涉及定量和定位检测人xCT蛋白水平或mRNA水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的。试验中所检测的人xCT蛋白水平，可以用于诊断肿瘤和用于肝
癌预后。一种检测样品中是否存在xCT蛋白的方法是利用xCT蛋白的特异性抗体进行检测，它包括将样品与xCT蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表不样品中存在xCT蛋白。xCT蛋白或其多核苷酸可用于xCT蛋白相关疾病的诊断和治疗。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列或DNA芯片上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。抗xCT的抗体可以固定在蛋白质芯片上，用于检测样品中的xCT蛋白。本发明还提供了一种检测肝癌或肝癌预后的的试剂盒，它含有特异性扩增xCT的引物对和/或xCT特异性抗体。筛选方法本发明还提供了基于胱氨酸/谷氨酸反向转体xCT进行药物筛选的方法。一种方法是先筛选影响(抑制)xCT表达或活性的化合物，然后对筛选出的化合物进一步测试其对癌细胞。其中，代表性的癌细胞包括(但并不限于)肝癌细胞、肺癌细胞、肾癌细胞等。一种筛选方法可基于xCT的mRNA的表达水平。另一种筛选方法可基于活性氧检测。活性氧(ROS)检测是一种常规的检测细胞内活性氧含量的方法，可通过检测ROS可以确定xCT的活性。xCT的活性越高，则ROS越低。活性氧(ROS)检测可用市售的检测试剂盒进行。一种活性氧检测试剂盒 (Reactive Oxygen Species Assay Kit)是利用突光探针DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。DCFHDA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。本发明的主要优点包括(a) xCT的表达水平和活性水平可用作肝癌检测的标志物。(b)xCT的表达水平和活性水平可用作肝癌预后的标志物。(c)xCT拮抗剂可有效抑制肝癌细胞生长。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。实施例材料一、抗体籲Anti-xCT 抗体,购自 LifeSpan BioSciences, Seattle, USA。# Anti-GAPDH 抗体，购自 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO。二、引物引物序列见表I。表I 用于 Real-time PCR 的引物
权利要求
1.一种胱氨酸/谷氨酸反向转体xCT基因或蛋白的用途，其特征在于，用于(a)制备检测肝癌的试剂或试剂盒；或(b)制备进行肝癌预后的试剂或试剂盒。
2.如权利要求I所述的用途，其特征在于，所述的试剂盒包括对xCT进行定量检测的试剂以及相应的标签或说明书。
3.—种胱氨酸/谷氨酸反向转体xCT的用途，其特征在于，被用作肝癌预后的标志物。
4.一种用于检测肝癌预后的诊断试剂盒，所述的试剂盒含有一容器，所述容器中含有检测胱氨酸/谷氨酸反向转体xCT的检测试剂；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测或诊断肝癌预后。
5.一种胱氨酸/谷氨酸反向转体xCT拮抗剂的用途，其特征在于，所述的拮抗剂被用于制备抑制肝癌细胞生长或增殖的药物，或用于制备治疗肝癌的药物。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的拮抗剂包括xCT的抗体、xCT的反义RNA、siRNA,以及xCT的活性抑制剂。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的xCT的活性抑制剂是柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine, SASP)。
8.—种体外非治疗性的抑制癌细胞生长或增殖的方法，其特征在于，包括步骤在xCT拮抗剂存在下，培养癌细胞，从而抑制癌细胞生长或增殖。
9.一种筛选治疗肝癌的候选化合物的方法，其特征在于，所述方法包括步骤 (a)测试组中，在细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察所述测试组的细胞中胱氨酸/谷氨酸反向转体xCT的表达量和/或活性；在对照组中，在相同细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察对照组的所述细胞中胱氨酸/谷氨酸反向转体xCT的表达量和/或活性； 其中，如果测试组中细胞的xCT的表达量和/或活性小于对照组，就表明该测试化合物是对xCT的表达和/或活性有抑制作用的治疗肝癌的候选化合物。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤 (b)对于步骤(a)中获得的候选化合物，进一步测试其对肝癌细胞生长或增殖的抑制作用。
全文摘要
本发明提供了胱氨酸/谷氨酸反向转体xCT抑制剂在肝癌治疗中的应用。具体地，本发明提供了一种肝癌中高表达的标志物xCT。此外，xCT的表达或活性高低与病人的预后相关，因此，xCT在肝癌细胞或组织中表达情况，可用于辅助性诊断或判断检测对象患肝癌的几率高低以及用于肝癌病人的预后。本发明还提供了相应的检测方法、试剂盒和筛选方法。
文档编号A61K31/635GK102719521SQ20111008018
公开日2012年10月10日 申请日期2011年3月31日 优先权日2011年3月31日
发明者何祥火, 张振峰, 郭维杰 申请人:上海市肿瘤研究所