专利名称：一种通过白蛋白纳米粒吸附灯盏花素制备的灯盏花素白蛋白纳米粒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种载有灯盏花素的白蛋白纳米粒及通过白蛋白纳米粒吸附灯盏花素的制备方法，属于制剂技术领域。
背景技术：
灯盏花素是从天然植物灯盏花中提取的黄酮类化合物，其主要成分为灯盏花乙素。现代药理研究证明，灯盏花素扩张微细动脉，提高心脏功能及心脑供血；降低血液粘度，抗血小板、红细胞聚集，提高红细胞变形能力。增加组织灌注量，改善微循环及代谢； 清除自由基防止组织再灌注性损伤，降低白细胞自发活率。临床适应证为脑血栓、脑出血恢复期，冠心病心绞痛、心肌梗死、高粘血症，一切缺血性及伴有严重循环障碍性疾病。近年研究发现灯盏花素在糖尿病肾病、肺间质纤维化及抗肿瘤药增效等方面也有较好的应用前景。据文献研究，灯盏花素有溶解度低(水中溶解度为20.47士0.沈48/!111)、口服生物利用度低(犬口服生物利用度为0.40士0. 19%)、半衰期短(犬口服消除半衰期为 79. 98 士44. 50min，犬静注消除半衰期为55. 70 士 19. 09min)等缺点。白蛋白纳米粒是以白蛋白为载体的一类纳米制剂。因具有良好的稳定性，在病变组织优先摄取性，易得性，生物降解性，毒性和免疫原性小的特点，而成为药物的理想载体。 此外，白蛋白一个重要特性是它独特的空间结构使其具有结合其他物质的能力，有万能载体之誉。白蛋白多肽链上带有较多的极性基团，对很多成分具有高度的亲和力，能和70%小分子药物发生可逆结合。白蛋白二级结构中含有药48%的α-螺旋结构，15%的β-折叠片结构，其余为无规线团结构，因此具有很多的网状空隙，为携带药物创造了有利的空间条件。近年来，国内外以白蛋白作为载体载药的方法大都以“内加法”，即在白蛋白制备形成白蛋白纳米粒的过程中将药物加入，最后制备成载药的白蛋白纳米粒。本发明借鉴大孔吸附树脂的原理，是通过将药物吸附在已制备好的空白白蛋白纳米粒上，以形成稳定的载药白蛋白纳米粒的一种方法。本方法不仅解决了灯盏花素水溶解度低的问题，并且其产物具有明显的缓释特征。本法，先通过去溶剂-化学交联法制备得到空白白蛋白纳米粒，接着将所得的空白白蛋白纳米粒冻干，然后将药物加入至复溶的空白白蛋白纳米粒充分混合吸附，最后得到载药的白蛋白纳米粒，冻干储备。
发明内容
本发明的目的是提供一种通过白蛋白纳米粒吸附灯盏花素制备的灯盏花素白蛋白纳米粒。本发明的另一个目的是提供制备上述灯盏花素白蛋白纳米粒的方法。因此，本发明提供了一种通过白蛋白纳米粒吸附灯盏花素制备的灯盏花素白蛋白纳米粒，它包括
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100体积份的白蛋白纳米粒混悬液；10-500体积份的灯盏花素溶液；其中白蛋白纳米粒混悬液为不同乙醇浓度的混悬液，灯盏花素溶液为乙醇溶液。在本发明的一个优选实例中，所述灯盏花素白蛋白纳米粒包括100体积份的白蛋白纳米粒混悬液；10-500体积份的灯盏花素溶液；在本发明的这个优选实例中，所述的白蛋白纳米粒为浓度50 % 80 %乙醇溶液，白蛋白纳米粒浓度为0. 1 5%，所述的灯盏花素为乙醇溶液，灯盏花素浓度为0. 1 5. 0mg/mLo本发明另一个方面，提供了所述组合物的灯盏花素白蛋白纳米粒制备方法，它包括以下步骤(a)将冻干后的空白白纳米粒用蒸馏水超声复溶，离心去上清，洗去冻干保护剂 (三次及以上)；(b)将a中纯化后的空白白蛋白纳米粒用蒸馏水稀释至要求浓度，搅拌条件下滴加要求倍数体积量乙醇溶液，至白蛋白纳米粒浓度为要求浓度，乙醇浓度为要求浓度；(c)将灯盏花素用乙醇溶解至要求浓度；(d)在25°C、500r/min搅拌状态中，将b中滴加要求倍数量体积量c，持续搅拌Ih ；(e)将d离心，除去上清液游离的灯盏花素，离心所得下部沉淀用0. 01mol/L柠檬酸溶液重分散，既得灯盏花素白蛋白纳米粒混悬液，加入冻干保护剂冷冻干燥；上述步骤d中所述的25°C、500r/min、lh均为优化后所得，并不代表唯一条件。
图1为灯盏花素、图2为白蛋白纳米粒冻干粉、图3为灯盏花素和白蛋白纳米粒冻干粉的物理混合物、图4为灯盏花素白蛋白纳米粒冻干粉的差示扫描量热分析图。图5为灯盏花素纳米粒混悬液和灯盏花素溶液的体外释药曲线。
具体实施例方式经过大量的研究发现，通过白蛋白纳米粒吸附灯盏花素，能够制备成载有灯盏花素的白蛋白纳米粒，可以改进灯盏花素水溶解度低的问题，并且使其具有缓释特性。本发明一方面提供了一种通过白蛋白纳米粒吸附灯盏花素制备载有灯盏花素的白蛋白纳米粒，它包括100体积份的白蛋白纳米粒混悬液；10-500体积份的灯盏花素溶液；在本发明中，所述的空白白蛋白纳米粒是通过去溶剂-化学交联法制备而成，并且经过冻干，蒸馏水复溶离心清洗掉冻干保护剂后加乙醇所得的混悬液，白蛋白纳米粒为浓度50% 80%乙醇溶液，白蛋白纳米粒浓度为0. 1 5 %，所述的灯盏花素为乙醇溶液， 灯盏花素浓度为0. 1 5. Omg/mL。实施例1100体积份的白蛋白纳米粒混悬液(白蛋白纳米粒为浓度80%乙醇溶液，白蛋白纳米粒浓度为3% )；250体积份的灯盏花素溶液(灯盏花素浓度为1. 45mg/mL)；(a)取牛血清白蛋白(BSA)用蒸馏水配成10%的浓度，在25°C、600r/min的搅拌条件下，以lmL/min的速度加入4倍体积95%乙醇，形成胶体溶液，再加入5%戊二醛水溶液(每Img BSA用0. 95 μ L，理论上能交联100%的BSA氨基)，在25°C摇床交联固化12小时。(b)将a中固化后的牛血清白蛋白纳米粒(BSA-NPs)，在15000r/min的转速下离心15min，去除其中的有机溶剂，分别进行3次，每次离心后弃其上清液，沉淀用蒸馏水加至原来体积，超声5min以上至其完全分散。第三次纯化后，将其在3000r/min的转速下离心 5min，取其上部胶体溶液，并测定粒径(用蒸馏水稀释100倍)。(c)将b中纯化后的BSA-NPs用蒸馏水稀释，加入冻干保护剂乳糖，用蒸馏水配成 BSA-M3s浓度约为1%，乳糖浓度为2%的溶液，最后进行冻干。(d)将c中冻干后的BSA-NI3s全部称量，计算冻干后BSA-NPs的含量。取含有0. 45g BSA-NPs的冻干产物用20mL蒸馏水超声复溶，在15000r/min的转速下离心15min，去除其中的冻干保护剂，分别进行3次，每次离心后弃其上清液，沉淀用蒸馏水加至原来体积，超声5min以上至其完全分散。(e)将d中纯化后的BSA-NPs最后用3mL蒸馏水重分散，搅拌条件下滴加12mL乙醇溶液，此时白蛋白纳米粒浓度为3%，溶液的乙醇浓度为80% ；(f)将灯盏花素用乙醇溶解，至浓度为1. 45mg/mL ；(g)在25°C、500r/min搅拌状态中，在e溶液中滴37. 5mL的f溶液，持续搅拌Ih ；(h)将上述g溶液离心，除去上清液游离的灯盏花素，离心所得下部沉淀用 0. 01mol/L柠檬酸溶液5mL重分散，既得灯盏花素白蛋白纳米粒混悬液，加入冻干保护剂乳糖Ig (用0. 01mol/L柠檬酸溶液溶解)，用0. 01mol/L柠檬酸溶液稀释至50mL，最后进行冻
干即得。将h中的上清液游离的灯盏花素用液相进行含量测定，通过计算得出结合的灯盏花素的量，计算灯盏花素白蛋白纳米粒的载药量和包封率。冻干后的灯盏花素白蛋白纳米粒用蒸馏水稀释至0. lmg/mL左右进行粒径及kta电位的测定。本例所得的灯盏花素白蛋白纳米粒粒径较空白白蛋白纳米粒粒径增大 22. 7士 1. 6nm，载药量为6. 73士0. 02%，包封率为80. 08士0. 29%，多分散系数为0. 117(较空白白蛋白纳米粒无异)Jeta电位为17. 95mV。本例所得的灯盏花素白蛋白纳米粒，经过差示扫描量热分析，结果如图1 4所示，灯盏花素在116.2°C有个熔融峰，空白白蛋白纳米粒冻干粉在114. 7°C有个熔融峰，两者的物理混合物在99. 1°C和116. 1°C有两个熔融峰，而灯盏花素白蛋白纳米粒冻干粉在 117. 9°C只有一个熔融峰，灯盏花素的熔融峰完全消失，说明灯盏花素在灯盏花素白蛋白纳米粒中以无定型存在或者被白蛋白纳米粒包裹。图中，灯盏花素在189.3 °C有一个吸热放热峰，空白白蛋白纳米冻干粉在197. 7°C有一个吸热峰，他们的物理混合物和灯盏花素白蛋白纳米粒中灯盏花素在189. 3°C的峰完全消失。分析原因可能为，在灯盏花素白蛋白纳米粒中灯盏花素其含量只占7%左右，灯盏花素和白蛋白纳米粒冻干粉的物理混合物也按7%混合，由于灯盏花素比例较小，且两者的吸热位置相近，所以在物理混合物和灯盏花素白蛋白纳米粒中灯盏花素在189. 3°C的峰被完全覆盖。 本例所得灯盏花素白蛋白纳米粒进行体外释放研究，取灯盏花素白蛋白纳米粒稀释至IOmL (相当于5mg灯盏花乙素)和灯盏花素溶液(pH 6. 8PBS溶液)10mL(相当于5mg灯盏花乙素)，分别置于透析袋中，采用中国药典2010年版二部附录溶出度测定法桨法来考察其药物体外释放行为。将透析袋放置在250mL pH6. 8PBS释放介质中，在lOOr/min转速和 37. 5°C介质温度下进行体外释放实验。分别在0. 17h、0. 33h、0. 76h、l. Oh、1. 5h、2. Oh,3. Oh、 4. Oh,6. Oh,8. 0h、12. 0h、16. Oh和 24. Oh 取 ImL(同时补充新鲜溶出介质 ImL)，0. 22 μ m微孔滤膜过滤，经液相色谱含量分析，计算累积释放百分率，绘制释药曲线见图5，灯盏花素白蛋白纳米粒较灯盏花素释放缓慢，有较明显的缓释作用。灯盏花素白蛋白纳米粒释放在1 后进入平台期，24h累积释药百分率为79. 19%，灯盏花素溶液释放他后进入平台期，1 累积释放率为83. 83%。
权利要求
1.一种通过白蛋白纳米粒吸附灯盏花素制备的灯盏花素白蛋白纳米粒，其特征在于， 它包括100体积份的白蛋白纳米粒混悬液； 10-500体积份的灯盏花素溶液；其中白蛋白纳米粒混悬液为不同乙醇浓度的混悬液，灯盏花素溶液为乙醇溶液。
2.如权利要求1所述的灯盏花素纳米粒，其特征在于，它包括 100体积份的白蛋白纳米粒混悬液；10-500体积份的灯盏花素溶液；所述的白蛋白纳米粒为浓度50 % 80 %乙醇溶液，白蛋白纳米粒浓度为0. 1 5 %，所述的灯盏花素为乙醇溶液，灯盏花素浓度为0. 1 5. Omg/mL。
3.如权利要求1所述的灯盏花素纳米粒的制备方法，它包括如下步骤(a)将冻干后的空白白纳米粒用蒸馏水超声复溶，离心去上清，洗去冻干保护剂；(b)将a中纯化后的空白白蛋白纳米粒用蒸馏水稀释至要求浓度，搅拌条件下滴加要求倍数体积量乙醇溶液，至白蛋白纳米粒浓度为要求浓度，乙醇浓度为要求浓度；(c)将灯盏花素用乙醇溶解至要求浓度；(d)在25°C、500r/min搅拌状态中，将b中滴加要求倍数量体积量c，持续搅拌Ih；(e)将d离心，除去上清液游离的灯盏花素，离心所得下部沉淀用0.Olmol/L柠檬酸溶液重分散，既得灯盏花素白蛋白纳米粒混悬液，加入冻干保护剂冷冻干燥。
全文摘要
本发明提供了一种载有灯盏花素的白蛋白纳米粒及制备方法，它包括活性成分灯盏花素和白蛋白纳米粒，通过制备利冻干后的白蛋白纳米粒在一定的条件与灯盏花素进行吸附载药而得。本发明通过白蛋白纳米粒吸附灯盏花素制备的灯盏花素白蛋白纳米粒，不仅解决了灯盏花素水溶液溶解度低的问题，并且其具有明显的缓释特征。
文档编号A61K47/42GK102415999SQ20111040264
公开日2012年4月18日 申请日期2011年12月7日 优先权日2011年12月7日
发明者席一峰, 张建军, 李来存, 高缘 申请人:中国药科大学