一种测定细胞色素p450代谢活性的探针药物组合物的制备、检测方法及其应用的制作方法

专利名称：一种测定细胞色素p450代谢活性的探针药物组合物的制备、检测方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药领域，更具体的是涉及一种新的测定细胞色素P450代谢活性的“cocktail”探针药物组合物，通过其药代动力学参数的变化来评价药物对大鼠CYP450亚型 CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1 和 CYP3A4 体内、体外代谢活性的影响。
背景技术：
细胞色素P450氧化酶(cytochrome P450，CYP450)是药物在人体内氧化代谢最主要的酶，其中CYP1A2，CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1和CYP3A4是最主要的亚型，含量约占肝内CYP450总量的80%以上，且经肝脏代谢的药物中90%以上是由这6种亚型代谢的。许多因素如遗传因素、年龄、性别、疾病和环境等都可以影响CYP450的活性，CYP450的活性可影响药物的代谢过程，从而影响药物的疗效；而且药物对CYP450可以产生诱导或者抑制作用，从而影响其他经此酶代谢的药物而发生药物相互作用和不良反应。目前临床上绝大多数患者都在多药并用，尤其是老年人，每天同时服用4 5种药物的情况极为普遍，随之而来的药物相互作用所致的不良反应也日趋严重，这已成为处方医师和患者必须认真考虑的一个重要而又现实的问题。药物相互作用一般分为药动学相互作用和药效学相互作用两大类。药动学相互作用可发生在吸收、分布、代谢、排泄4个阶段，其中代谢性相互作用发生率最高，约占药动学相互作用的40%，临床意义也最为重要，而代谢性相互作用的96%是由CYP450酶系介导的。目前欧美各国已经把对CYP450的活性测定用于新药筛选及代谢研究，并把它列为新药申报必须进行的一项实验。我国颁布的《化学药物非临床药代动力学研究技术指导原则》中也已积极倡导对CYP450的活性进行研究。在新药筛选和发现阶段,对新化学实体(new chemical entities, NCE)进行药代动力学的综合评价，预测和完善化合物的最佳结构，已经成为新药研究中的一个非常重要的内容。良好的药动学参数和代谢特征是具有发展前景的先导化合物所必备的。因此，在新药研发过程中常通过评估NCE对CYP450特异性探针底物在体外代谢体系中代谢的影响程度，判断NCE对CYP450的抑制作用，从而预测它在体内可能引起的药物相互作用，为进一步的药物临床试验提供有价值的信息。但是体外与体内真实的生理环境有很大不同，可能造成药物代谢的差异。因此预测药物相互作用应该体内、体外研究相结合。面对大量组合化学技术产生的大量化合物和传统制备分离技术得到的天然产物中的成分，需要采用快速、简便并且结果可靠的体内外实验方法和技术进行筛选以供进一步的结构优化。目前，用于研究CYP450活性的方法主要分为体内和体外研究两大类。体外研究常用的方法有肝微粒体孵化、基因重组P450酶系、肝细胞培养和肝脏组织切片法。研究报道，使用特异性底物与肝微粒体共同孵化的方法测定的结果与临床表现具有较好的一致性，故体外研究方法中肝微粒体孵化法更加可靠。体外研究简单快速，适合高通量筛选。还可以作为确定体内试验研究方向的预试验而应用。但是体外与体内真实的生理环境有很大不同，使药物代谢可能会有所差异，因此需要进一步进行体内研究。体内研究方法主要有基因分型法和探针药物法。基因分型法是直接测定特定的DNA的变异来评价药物代谢酶的活性。但是个体代谢酶基因变异发生频率较低，有很多还未被认定而且是非特征性，再加上基因型检测费用高，并不是所有的基因型变异都导致表现型改变等都限制了该方法的实际应用。最常使用的是直接测定体内酶的活性(表现型)的方法即探针药物法，探针药物法目前主要分为两种。一种是单独使用一种探针药物，即选用只被一种特定的酶亚型催化或者即使被几种亚型催化但已确知其代谢途径及其产物的物质，通过测定其体内的代谢速率，来评价该酶的活性的指标。然而外源物质的代谢往往需要多种酶共同参与，而且酶多具有底物特异性，单一的探针药物只能反映一个或部分CYP450亚型的活性，没有一种药物可以同时评价几种亚型的活性。实践中又常需要了解多个CYP450亚型的活性，于是发展出了同时给予多个探针药物的方法，即“cocktail”探针药物法。该方法可以明显减少分析周期，提高分析效率，更重要的是这种方法可以减少个体内的差异对实验结果的影响。近年来这 种方法得到了广泛的研究，然而对其在药物开发过程中的适应性还存在一定的质疑，其中主要关注于各探针药物之间的代谢性相互作用以及探针药物的药效学作用。同时cocktail探针药物法对分析方法的敏感性和特异性要求较高，这样就会提高分析成本。但有研究指出在满足分析方法的各种要求前提下，潜在的相互作用可以通过控制药物的剂量来降低，而且随着现在许多高特异性和高灵敏度方法的使用，目前检测检测大多数药物血浆浓度的常用方法有气相色谱法(GC)、液相色谱法(LC)和色谱-质谱联用法(LC-MS、LC-MS/MS、GC-MS, GC-MS/MS)等，但这些精密仪器仍然受到试验室现有条件及方法应用的普及性的限制。Cocktail探针药物法是由Breimer和Schellens等人在80年代末提出来的,研究最多的是用3 5种探针药物组成的cocktail溶液，使用LC/MS/MS的方法同时测定药物对3 5种主要CYP450亚型活性的影响，所用的特异性探针药物各不相同。最近，FDA、EUFEPS和美国内外科医师协会认为在体内药物代谢/相互作用的研究中，CYP450各亚型相对应的理想探针药物分别为CYP1A2为胆茶碱、咖啡因；CYP2C9为华法林和甲苯磺丁脲；CYP2D6为地昔帕明和美托洛尔；CYP3A4为咪达唑仑和司伐他汀；CYP2C19为奥美拉唑；CYP2E1为氯唑沙宗。CYP1A2，CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1 和 CYP3A4 是 CYP450 最主要的六种亚型，含量约占肝内CYP450总量的80%以上，且90%以上的上市药物是由这6种亚型代谢的。因此对于药物的评价应该涵盖这六种主要的CYP450亚型。本课题组在前期工作中曾制备了包含咖啡因、甲苯磺丁脲、美托洛尔、氯唑沙宗和咪达唑仑的5种探针药物的cocktail溶液，并用其评价了肝缺血再灌与缺血预适应对大鼠CYP450五种亚型CYP1A2，CYP2C9，CYP2D6, CYP2E1和CYP3A4活性的影响(专利申请号:200810110435. 6)。该方法中缺少了CYP2C19这一重要的CYP450亚型，而且检测方法采用了单一波长的HPLC法，其回收率较低，无法准确测定低浓度的药物。CYP2C19与CYP2C9同属CYP2C家族，是重要的CYP450酶，能催化许多临床药物，如奥美拉唑、安定、环己巴比妥、普萘洛尔等，同时具有明显的遗传多态性。本研究在前期工作的基础上，制备了一种新的细胞色素P450探针药物组合物，进一步优化探针溶液的配伍条件，增加其稳定性；使用HPLC梯度洗脱法使得各探针药物的分离度更好、提高了测定方法的准确度和精密度。为研究药物对CYP450六种主要亚型活性的影响提供了一种新的方法。

发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种新的测定CYP450代谢活性的探针药物组合物，研究了药物对大鼠CYP450六个主要亚型功能酶CYPlA2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4体内药物代谢活性，旨在建立评价药物对CYP450活性影响的药物筛选模型，为新药研发、评价药物相互作用、预测药物不良反应、指导临床合理用药提供理论指导和实验室依据。本发明的一个目的是提供一种新的同时测定CYP450六种主要亚型代谢活性的“ cocktai I ”探针药物组合物及其制备方法。本发明的另一个目的是提供同时测定该探针药物组合物的高效液相色谱(HPLC) 方法。本发明还有一个目的是提供该探针药物组合物在评价药物对细胞色素P450不同亚型体内、体外代谢活性的影响上的应用。本发明所提供的测定CYP450代谢活性的探针药物组合物，是由含有CYP450的主要亚型CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4的特异性探针为活性成分制备而成的制剂。其中，所述的特异性探针是咖啡因、茶碱、华法林、甲苯磺丁脲、奥美拉唑、美芬妥因、美托洛尔、右美沙芬、氯唑沙宗、氨苯砜、咪达唑仑或地昔帕明。优选所述的特异性探针是咖啡因、甲苯磺丁脲、奥美拉唑、美托洛尔、氯唑沙宗和咪达唑仑。本发明所述的测定CYP450代谢活性的探针药物组合物的重量配比及制备方法，包括以下步骤(I)称取氯唑沙宗10 20份和甲苯磺丁脲3 10份溶于无水乙醇,备用；(2)称取探针药物咖啡因3 12份、美托洛尔18 35份、奥美拉唑18 35份溶于生理盐水,将(I)加入此溶液中；(3)再准确吸取咪达唑仑10 20份加入上述混合液，配制成“cocktail”探针药液，使各探针药物的浓度分别为咖啡因0. 3 I. 2mg/ml，美托洛尔I. 8 3. 5mg/ml，奥美拉唑I. 8 3. 5mg/ml,氯唑沙宗I 2mg/ml,甲苯横丁服0. 3 lmg/ml,咪达唑仑I 2mg/ml o上述所述的咖啡因原料药(caffeine)、氯唑沙宗原料药(chlorzoxazone)、美托洛尔原料药(metoprolol)、甲苯磺丁脲原料药(tolbutamide)、奥美拉唑原料药(omeprazole)、咪达唑仑原料药优选为咪达唑仑注射剂(midazolam injection),均为市售。氯唑沙宗和甲苯磺丁脲不溶于水，因此先溶于无水乙醇中，再加入生理盐水溶液中，以保持良好的溶解性。本发明所述的测定CYP450代谢活性的探针药物组合物制剂优选溶液剂，特别是在给药前要新鲜配置，配好后立即使用。 本发明还提供了同时测定该六种探针药物组合物的检测方法。本发明所述的检测方法是测定血浆中或微粒体中该六种CYP450探针药物浓度的方法，包括样本的预处理和同时测定该六种探针药物的高效液相色谱(HPLC)方法。
其中所述的样本的预处理有两种，一种是含有CYP450六种探针药物的血浆样本的预处理，一种是含有CYP450六种探针药物的肝微粒体样本的预处理。其中所述的血浆样本的预处理具体方法为取含有CYP450六种探针药物的血浆I份，加入0. 5份I IOy g/ml地西泮内标溶液，涡旋振荡后，加入10份氯仿提取，涡旋，离心，取下层有机相置离心管中，然后再加入10份体积比为6 8 2 4的正己烷-氯仿混合液提取，涡旋，离心，取下层有机相置离心管中，合并两次所取有机相，置于40°C水浴中以氮气吹干，残渣用流动相溶解即可。其中所述的肝微粒体样本的预处理具体方法为取含有CYP450六种探针药物的肝微粒体I份，加入0. 5份经4°C冷却的I 10 ii g/ml地西泮内标溶液，涡旋振荡,加入2份体积比为I : I的经4°C冷却的甲醇-乙腈混合液，旋润，离心，取上清液进样。
本发明所述的同时测定CYP450六种探针药物浓度的HPLC法的色谱条件是使用碳十八反相烷基键合硅胶柱，采用梯度洗脱法，流动相为甲醇、乙腈、0. 05mol/L磷酸氢二铵缓冲液PH3. 4的混合溶液，该混合溶液中三者体积比随时间而变化，运行开始到5min为 30 : 10 60，5 8min 为 35 13 52，8 IOmin 为 35 14 51，10 15min*40 15 45，15 35min 为 45 15 40，35 40min 为 30 10 60。流速 I. Oml/min，检测波长230nm，柱温35°C。肝脏微粒体混合功能氧化酶系统，又称为依赖于细胞色素P450的单氧化酶系统，是一种多酶电子传递系统，是体内重要的氧化-还原酶系，可以催化众多的内源性物质如脂肪酸、胆固醇、胆汁酸及类固醇激素和外源性物质如药物的代谢。其中涉及体内大多数药物代谢的主要有 3 个基因家族(CYP1、CYP2、CYP3)。其中 CYP1A2，CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6，CYP2E1和CYP3A4是最主要的亚型，含量约占肝内CYP450酶总量的80%以上，且经肝脏代谢的药物中90%以上是由这6种亚型代谢的。CYP1A2 :人类CYPl家族中被发现的P450氧化酶有CYPlAl、CYP1A2和CYPlBl。其中CYP1A2与药物代谢关系最为密切，它占肝脏总P450氧化酶含量的13%，参与许多药物、类固醇激素及前致癌物的代谢。人体内咖啡因90%的消除是由CYP1A2介导的，CYP1A2在咖啡因的代谢过程中占绝对主导作用，所以咖啡因是首选的安全用于测定体内CYP1A2活性的最理想的探针药物。CYP2C9 CYP2C9约占P450含量的20%，仅次于CYP3A。它能代谢许多不同性质的药物，并在前致癌物、前毒物和致突变剂的活化中也起一定作用。CYP2C9代谢的药物包括但不限于，甲苯磺丁脲、苯妥英、华法林、托拉赛米、阿米替林、氟西汀、磺胺甲基异恶唑、睾酮和洛沙坦等。优选苯妥英、华法林、甲苯磺丁脲作为CYP2C9代谢的药物。最佳为甲苯磺丁脲，因为甲苯磺丁脲在人体内几乎仅以单一途径代谢，甲基羟基化形成羟基甲苯磺丁脲，随后由醇和醛脱氢酶氧化羟基甲苯磺丁脲为羧基甲苯磺丁脲，其中第一步反应是限速步骤。此途径能清除多达人体内多达80 % 100 %的甲苯磺丁脲，尿中甲苯磺丁脲主要以羧基化产物的形式存在。CYP2D19 :CYP2C19参与一些重要药物的代谢，包括P受体阻滞剂、抗抑郁药、质子泵抑制剂等。其代谢药物包括但不限于美芬妥英、苯妥英、氯喹、奥美拉唑。优选奥美拉唑作为CYP2C19的探针药物。奥美拉唑经CYP2C19代谢生成5-羟基奥美拉唑。CYP2D6 :CYP2D6参与临床百余种重要药物的代谢，包括多种抗心律失常药、P受体阻滞剂、抗高血压药、抗抑郁药以及抗精神病药等。代谢药物包括但不限于异喹胍、司巴丁、右美沙芬和美托洛尔等，优选美托洛尔作为CYP2D6的探针药物。美托洛尔主要经两条途径代谢0_去甲基代谢和a-羟化代谢。其中a-羟化代谢生成a-羟基美托洛尔，几乎由CYP2D6单一途径代谢而成，因此美托洛尔是CYP2D6的特异性底物，可以用作研究该酶活性的探针药物。CYP2E1 :在CYP2E亚家族中，CYP2E1相对重要，它的底物较多，其中大部分为前致癌物和前毒物，少部分为药物。氯唑沙宗在体内经CYP2E1代谢为6-羟氯唑沙宗，再与葡萄糖醛酸结合由尿排出体外。优选氯唑沙宗作为CYP2E1的探针药物。CYP3A CYP3A参与50 60%临床常用药物的氧化代谢。CYP3A的底物广泛性及其活性的高度差异直接关系其底物的临床合理应用和疗效评价。咪达唑仑是短效镇静催眠 药，CYP3A4和CYP3A5都参与其体内代谢反应，主要代谢产物为I’ -羟基咪达唑仑，其次为4-羟基咪达唑仑和I，4-二羟基咪达唑仑。咪达唑仑的肝脏萃取率较低(约为34% )。因此，优选咪达唑仑作为CYP3A代谢药物。本发明的六种探针药物可以作为一个新的组合来同时检测六种CYP450亚型酶的活性，且不会发生探针药物间代谢过程中的相互作用。本发明还提供了该探针药物组合物在研究药物对CYP450不同亚型体内、体外代谢活性的影响方面的用途。许多因素如遗传因素、年龄、性别、疾病和环境等都可以影响CYP450的活性，CYP450的活性可影响药物的代谢过程，从而影响药物的疗效；而且药物对CYP450可以产生诱导或者抑制作用，从而影响其他经此酶代谢的药物而发生药物相互作用和不良反应。在新药研发的初级，可以应用该探针药物组合物进行肝微粒体孵育实验，高通量地获取药物对体外肝CYP450活性的影响，也可以应用该探针药物组合物进行动物实验，获取药物对动物肝CYP450体内代谢活性的影响，以便在综合考虑药理活性和对代谢酶抑制和诱导等基础上筛选出药理活性高而又不易引起代谢性相互作用的新化合物。在临床研究阶段，可以应用该探针药物组合物进行体内探针法试验，考察药物对人肝CYP450不同亚型体内代谢活性的影响。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式
，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。


图I :六种探针药物与内标混合标准溶液色谱图。各探针药物的保留时间分别为咖啡因4. 123min,氯唑沙宗6. 352min,甲苯磺丁脲15. 148min,奥美拉唑18. 087min,咪达唑仑 21. 606min，地西泮 26. 413min。图2 :大鼠空白血浆色谱图。图3 :大鼠空白血浆加样提取色谱图。各探针药物的保留时间分别为咖啡因4. 303min,氯唑沙宗6. 838min,甲苯磺丁脲15. 616min,奥美拉唑18. 710min,咪达唑仑21.710min，地西泮 28. 780min。图4:大鼠给药后血浆样本提取色谱图。各探针药物的保留时间分别为咖啡因
4.252min，氯唑沙宗6. 751min,甲苯磺丁脲15. 589min,奥美拉唑18. 407min,咪达唑仑
22.008min，地西泮 25. 365min。图5 :咖啡因血药浓度均值-时间曲线图。图6 :甲苯磺丁脲血药浓度均值-时间曲线图。图7 :奥美拉唑血药浓度均值-时间曲线图。 图8 :美托洛尔血药浓度均值-时间曲线图。图9 :氯唑沙宗血药浓度均值-时间曲线图。图10 :咪达唑仑血药浓度均值-时间曲线图。
具体实施例下面将结合本发明的实施例进一步详细说明本发明的实质内容，该实施例仅用于说明本发明而对本发明并没有限制。实施例I本发明探针药物组合物的制备准确称取氯唑沙宗IOmg和甲苯磺丁脲5mg溶于2ml无水乙醇，备用；准确称取咖啡因5mg、美托洛尔20mg、奥美拉唑35mg溶于6ml生理盐水，将上述无水乙醇溶液加入该生理盐水溶液中，再准确吸取咪达唑仑注射液2ml (IOmg)加入上述混合液，配制成“cocktaiI”探针药液。各探针药物的浓度分别为咖啡因0. 5mg/ml，美托洛尔2mg/ml，奥美拉唑3. 5mg/ml,氯唑沙宗lmg/ml,甲苯磺丁脲0. 5mg/ml,咪达唑仑lmg/ml。溶液于给药前新鲜配制，配好后立即使用。实施例2本发明探针药物组合物的制备准确称取氯唑沙宗IOmg和甲苯磺丁脲3mg溶于2ml无水乙醇，备用；准确称取咖啡因12mg、美托洛尔35mg、奥美拉唑18mg溶于6ml生理盐水,将上述无水乙醇溶液加入该生理盐水溶液中，再准确吸取咪达唑仑注射液2ml (IOmg)加入上述混合液，配制成“cocktaiI”探针药液。各探针药物的浓度分别为咖啡因I. 2mg/ml，美托洛尔3. 5mg/ml，奥美拉唑I. 8mg/ml,氯唑沙宗lmg/ml,甲苯磺丁脲0. 3mg/ml,咪达唑仑lmg/ml。溶液于给药前新鲜配制，配好后立即使用。实施例3本发明探针药物组合物的制备准确称取氯唑沙宗20mg和甲苯磺丁脲IOmg溶于2ml无水乙醇，备用；准确称取咖啡因3mg、美托洛尔18mg、奥美拉唑18mg溶于5ml生理盐水,将上述无水乙醇溶液加入该生理盐水溶液中，再准确吸取咪达唑仑注射液3ml(15mg)加入上述混合液，配制成“cocktaiI”探针药液。各探针药物的浓度分别为咖啡因0. 3mg/ml，美托洛尔I. 8mg/ml，奥美拉唑I. 8mg/ml,氯唑沙宗2mg/ml,甲苯磺丁脲lmg/ml,咪达唑仑I. 5mg/ml。溶液于给药前新鲜配制，配好后立即使用。实施例4
本发明探针药物组合物的制备准确称取氯唑沙宗12mg和甲苯磺丁脲5mg溶于1.5ml无水乙醇，备用；准确称取咖啡因8mg、美托洛尔25mg、奥美拉唑25mg溶于4. 5ml生理盐水,将上述无水乙醇溶液加入该生理盐水溶液中，再准确吸取咪达唑仑注射液4ml (20mg)加入上述混合液，配制成“cocktaiI”探针药液。各探针药物的浓度分别为咖啡因0. 8mg/ml，美托洛尔2. 5mg/ml，奥美拉唑2. 5mg/ml,氯唑沙宗I. 2mg/ml,甲苯磺丁脲0. 5mg/ml,咪达唑仑2mg/ml。溶液于给药前新鲜配制，配好后立即使用。实施例5本发明探针药物组合物的制备
准确称取氯唑沙宗IOmg和甲苯磺丁脲6mg溶于I. 5ml无水乙醇,备用；准确称取咖啡因5mg、美托洛尔20mg、奥美拉唑25mg溶于5ml生理盐水,将上述无水乙醇溶液加入该生理盐水溶液中，再准确吸取咪达唑仑注射液3. 5ml (17. 5mg)mg入上述混合液，配制成“cocktail ”探针药液。各探针药物的浓度分别为咖啡因0. 5mg/ml，美托洛尔2mg/ml，奥美拉唑2. 5mg/ml,氯唑沙宗lmg/ml,甲苯磺丁脲0. 6mg/ml,咪达唑仑I. 75mg/ml。溶液于给药前新鲜配制，配好后立即使用。实施例6本发明血浆样本的预处理方法准确吸取血浆样本200 U L，加入4 ii g ml/1的地西泮内标溶液100 U L，涡旋振荡30s,加入2mL提取溶剂三氯甲烧，润旋5min后，3500r mirT1离心IOmin0取下层有机相置离心管中，然后再加入体积比为7 3的正己烷-氯仿混合液2ml提取，涡旋5min后，3500r min—1离心lOmin。取下层有机相置离心管中，合并两次所取有机相，置于40°C水浴中以氮气吹干，残渣用100 u L流动相复溶。实施例I本发明血浆样本的预处理方法准确吸取血浆样本200 U L，加入10 ii g mL—1的地西泮内标溶液100 U L，涡旋振荡30s,加入2mL提取溶剂三氯甲烧，润旋5min后，3500r mirT1离心lOmin。取下层有机相置离心管中，然后再加入体积比为6 4的正己烷-氯仿混合液2ml提取，涡旋5min后，3500r min—1离心lOmin。取下层有机相置离心管中，合并两次所取有机相，置于40°C水浴中以氮气吹干，残渣用100 u L流动相复溶。实施例8本发明血浆样本的预处理方法准确吸取血浆样本200 U L，加入I ii g ml/1的地西泮内标溶液100 U L，涡旋振荡30s,加入2mL提取溶剂三氯甲烧，润旋5min后，3500r mirT1离心IOmin0取下层有机相置离心管中，然后再加入体积比为8 2的正己烷-氯仿混合液2ml提取，涡旋5min后，3500r min—1离心lOmin。取下层有机相置离心管中，合并两次所取有机相，置于40°C水浴中以氮气吹干，残渣用100 u L流动相复溶。实施例9本发明肝微粒体样本的预处理方法取200 ill样品，加入经4 °C冷却的5 ii g mL—1地西泮内标溶液100 ii L，涡旋振荡30s，加入经4°C冷却的体积比为I : I的甲醇-乙腈溶液400 u I沉淀蛋白，旋涡lmin，12000r/min离心IOmin,取上清液20 U I进样。实施例10本发明肝微粒体样本的预处理方法取200 ill样品加入经4°C冷却的I U g mL—1地西泮内标溶液100 U L，涡旋振荡30s，加入经4°C冷却的体积比为I : I的甲醇-乙腈溶液400 ill沉淀蛋白，旋涡lmin，12000r/min离心IOmin,取上清液20 U I进样。 实施例11本发明肝微粒体样本的预处理方法取200 ill样品加入经4 °C冷却的10 ii g ml/1地西泮内标溶液100 ii L，涡旋振荡30s，加入经4°C冷却的体积比为I : I的甲醇-乙腈溶液400 u I沉淀蛋白，旋涡lmin，12000r/min离心IOmin,取上清液20 U I进样。实施例12测定CYP450六种探针药物浓度的HPLC法的色谱条件使用碳十八反相烷基键合硅胶柱，采用梯度洗脱法，流动相为甲醇、乙腈、0. 05mol/L磷酸氢二铵缓冲液pH3. 4的混合溶液，该混合溶液中三者体积比随时间而变化，运行开始到 5min 为 30 10 60，5 8minS35 13 52，8 IOmin 为 35 : 14 : 51，10 15min 为 40 15 45，15 35min 为 45 15 40，35 40min 为 30 10 60。流速I. Oml/min,检测波长230nm,柱温35°C。为了更好地描述本发明公开的内容，以下列举了一些实例来进一步说明。试验例I丹参酮IIA磺酸钠对CYP450六种亚型体内代谢活性的影响I药品与试剂咪达唑仑注射剂(10mg/2ml/支，江苏恩华药业股份有限公司生产)、氯唑沙宗、美托洛尔、甲苯磺丁脲、咖啡因、地西泮均为市售原料药。丹参酮IIA磺酸钠注射液(10mg/2ml/支，上海生化第一药业有限公司生产)。无水乙醇、磷酸氢二铵、磷酸、氯仿、正己烷均为市售分析纯；甲醇、乙腈均为市售色谱纯。水为双蒸水。2实验动物Wistar大鼠，雌雄各半，体重200±20g，由中国人民解放军军事医学科学院放射研究所实验动物中心提供，动物生产合格证=ASCSK(津)2005-0001。3色谱柱Agilent zorbax SB-C18 (250mmX 4. 6mm，5 u m), Agilent 公司，美国。4实验仪器Agilent 1100 HPLC工作系统(美国Agilent公司)、CAY-1型液体快速混合器(北京长安仪器厂)、B600型低速自动平衡离心机(白洋离心机厂)K-550-GE漩涡混合器(Scientificlndustries Inc，美国),CSF-IB超声波发生器(上海超声波仪器厂)、PB153_S精密分析天平(METTLER TOLEDO，瑞士)、eppendorf移液器(德国)。5实验方法5. I探针药物溶液的配制
准确称取探针药物咖啡因5mg、美托洛尔20mg、奥美拉唑20mg溶于6ml生理盐水，称取氯唑沙宗IOmg和甲苯磺丁脲5mg溶于2ml无水乙醇，将无水乙醇缓缓加入生理盐水中，再准确吸取咪达唑仑注射液2ml (IOmg)加入上述混合液，配制成“cocktail”探针药液。溶液于给药前新鲜配制，配好后立即使用。5. 2给药方法及样本采集5. 2. I实验分组将Wistar大鼠分为三组对照组、低剂量组和高剂量组，每组18只。5. 2. 2给药方法5. 2. 2. I 对照组 对照组大鼠每日于尾静脉注射生理盐水0. 5ml/100g，每日I次，共14d ;第15d于尾静脉缓慢注射“cocktail”探针药物溶液0. 5ml/100g。剂量分别为咖啡因、甲苯磺丁脲
2.5mg/kg,氯唑沙宗、咪达唑仑5mg/kg,美托洛尔、奥美拉唑10mg/kg。5. 2. 2. 2 低剂量组:低剂量组大鼠每日于尾静脉注射丹参酮II A磺酸钠注射液3.6mg/Kg，每日I次，共14d ’第15d于尾静脉缓慢注射“cocktaiI”探针药物溶液0. 5ml/100g。剂量分别为咖啡因、甲苯磺丁脲2. 5mg/kg,氯唑沙宗、咪达唑仑5mg/kg,美托洛尔、奥美拉唑10mg/kg。5. 2. 2. 3 高剂量组:高剂量组大鼠每日于尾静脉注射丹参酮II A磺酸钠注射液10.8mg/Kg，每日I次，共14d ’第15d于尾静脉缓慢注射“cocktaiI”探针药物溶液0. 5ml/100g。剂量分别为咖啡因、甲苯磺丁脲2. 5mg/kg,氯唑沙宗、咪达唑仑5mg/kg,美托洛尔、奥美拉唑10mg/kg。5. 2. 3血浆样品采集分别于注射cocktail探针药物溶液前及给药后5、10、15、20、30min和1、2、4、8、12、24h眼内眦静脉取血0. 8ml至肝素化离心管中，3500rpm离心lOmin，分离血浆，于_20°C冰箱保存待测。5. 3样品预处理准确吸取血浆样本200ii L，加入g ml/1的地西泮内标溶液100 y L，涡旋振荡30s,加入2mL提取溶剂三氯甲烧,于快速液体混合器混勻5min后，3500r .mirT1离心lOmin。取下层有机相置离心管中，然后再加入正己烷-氯仿(7 3) 2ml提取，于快速液体混合器混匀5min后，3500r mirT1离心lOmin。取下层有机相置离心管中，合并两次所取有机相，置于40°C水浴中以氮气吹干，残渣用100 u L流动相复溶，取20 y L进样，记录色谱图。5. 4HPLC检测方法的建立5. 4. I色谱条件流动相甲醇乙腈0. 05mol/L磷酸氢二铵缓冲液(pH = 3. 4 ；30 10 60(0-5min),35 13 52(5_8min)，35 14 51(8-10min),40 : 15 : 45(10-15min) ,45 15 40 (15_35min)，30 10 60 (35_40min) ；v/v);检测波长230nm ;流速:1. Oml/min ;柱温35°C ;进样量:20 yl。5. 4. 2溶液配制5. 4. 2. I磷酸氢二铵缓冲液的配制称取磷酸氢二铵2. 64g，以400ml双蒸水溶解，加85%磷酸I. 4ml，调节pH值为3.4。
5. 4. 2. 2地西泮内标溶液的配制精密称取地西泮IOmg,以无水乙醇溶解并定容至IOml容量瓶中，得lmg/ml内标储备液，置4°C冰箱中保存。用时加无水乙醇稀释至适宜浓度。5. 4. 2. 3各探针药溶液配置分别制备浓度为lmg/ml的咖啡因、甲苯磺丁脲、奥美拉唑、美托洛尔、氯唑沙宗和咪达唑仑的储备溶液，除咪达唑仑用水溶解外其余的全部以甲醇作为溶剂，4°C冷藏，用时加水稀释至适宜浓度。5. 4. 3血浆标准曲线制备分别取不同浓度的咖啡因、甲苯磺丁脲、奥美拉唑、美托洛尔、氯唑沙宗和咪达唑 仑工作液各40iil混匀，氮气下吹干，加入大鼠空白血浆200 iil，制备成浓度为50、20、10、
5、2、1、0. 5,0. 2,0. I u g/ml的混合探针药物血浆标准液，每个浓度平行配制三份。按“样品预处理”项下操作，记录峰面积。以咖啡因、甲苯磺丁脲、奥美拉唑、美托洛尔、氯唑沙宗和咪达唑仑样品与内标峰面积比值为横坐标，药物浓度为纵坐标，绘制标准曲线，求得直线回归方程。5. 5数据处理方法及药代动力学分析使用DAS2. 0软件的非房室模型计算咖啡因、甲苯磺丁脲、奥美拉唑、美托洛尔、氯唑沙宗和咪达唑仑的主要药代动力学参数。5. 6统计学处理结果以“均值土标准差”(Mean values土SD)表示，应用SPSS13. 0软件进行统计分析，采用方差分析进行组间比较，Dunnetf s检验进行两两比较。P < 0. 05表示有显著差异。6 结果6. IHPLC检测方法的专一性在上述色谱条件下，六种探针药物的吸收峰峰形良好，分离完全，符合生物样本的检测要求。六种探针药物标准溶液加入内标的色谱图见附图1，大鼠空白血浆色谱图见附图2，大鼠空白血浆加六种探针药物标准品的色谱图见附图3，大鼠血浆样本色谱图见附图4。6. 2六种探针药物的标准曲线表I血浆中咖啡因、甲苯磺丁脲、奥美拉唑、美托洛尔、氯唑沙宗和咪达唑仑的标准曲线方程(n = 3)
_回归方程_R_
咖啡因Y=4.9948X-0.06350.9994
甲苯磺丁脲Y=3.4856X-0.03290.9995
奥美拉唑Y=3.2381X+0.08520.9995
美托洛尔Y=5.8312X+0.02510.9997
氯唑沙宗Y=4.6279X+0.04370.9990咪达唑仑Y=1.3316X+0.01230.99976. 3各组六种探针药物血浆浓度测定结果对照组、低剂量组和高剂量组给予cocktail探针溶液后，咖啡因、甲苯磺丁脲、奥美拉唑、美托洛尔、氯唑沙宗和咪达唑仑的血药浓度测定结果见表2-表7，其血药浓度均值-时间曲线见附图5 10。
表2各组大鼠咖啡因血药浓度(^±SD，n = 6)
权利要求
1.一种测定细胞色素P450代谢活性的探针药物组合物，其特征是由含有CYP450的主要亚型CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4的特异性探针为活性成分制备而成的制剂。
2.如权利要求I的组合物，其特征是所述的 CYP1A2特异性探针为活性成分的是咖啡因或茶碱； CYP2C9特异性探针为活性成分的是甲苯磺丁脲或华法林； CYP2C19特异性探针为活性成分的是奥美拉唑或美芬妥因； CYP2D6特异性探针为活性成分的是美托洛尔或右美沙芬； CYP2E1特异性探针为活性成分的是氯唑沙宗或氨苯砜； CYP3A4特异性探针为活性成分的是咪达唑仑或地昔帕明。
3.如权利要求2的组合物，其特征是所述的组合物的组分和质量份数如下 咖啡因3 12份， 美托洛尔18 35份， 奥美拉唑18 35份， 氯唑沙宗10 20份， 甲苯磺丁脲3 10份， 咪达唑仑10 20份。
4.如权利要求I 3的任何一项权利要求所述的组合物的制备方法，其特征是步骤如下 (1)称取氯唑沙宗10 20份和甲苯磺丁脲3 10份溶于无水乙醇，备用； (2)称取探针药物咖啡因3 12份、美托洛尔18 35份、奥美拉唑18 35份溶于生理盐水,将(I)加入此溶液中； (3)再准确吸取咪达唑仑10 20份加入上述混合液，配制成“cocktail”探针药液，使各探针药物的浓度分别为咖啡因0. 3 I. 2mg/ml，美托洛尔I. 8 3. 5mg/ml，奥美拉唑I.8 3. 5mg/ml,氯唑沙宗I 2mg/ml,甲苯横丁服0. 3 lmg/ml,咪达唑仑I 2mg/ml。
5.权利要求I的测定细胞色素P450代谢活性的探针药物组合物的应用，将该探针药物组合物给予动物或者与肝微粒体体外共孵育，通过测定各探针药物的浓度而评价CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4的代谢活性；在新药研发初期，高通量筛选药物对于细胞色素P450各亚型活性的影响，从而预测药物相互作用。
6.权利要求5的测定该六种探针药物组合物的检测方法，其特征是测定血浆中或肝微粒体中六种CYP450探针药物浓度的方法，包括样本的预处理和同时测定该六种探针药物的高效液相色谱方法。
7.如权利要求6所述的方法，其特征是所述的样本的预处理为含有CYP450六种探针药物的血浆样本的预处理；或是含有CYP450六种探针药物的肝微粒体样本的预处理。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征是所述的血浆样本的预处理具体方法为取含有CYP450六种探针药物的血浆，加入内标地西泮溶液I IOy g/ml，涡旋振荡后，用氯仿提取，涡旋，离心，取下层有机相置离心管中，然后再加入体积比为6 8 2 4的正己烷-氯仿混合液提取，涡旋，离心，取下层有机相置离心管中，合并两次所取有机相，置于40°C水浴中以氮气吹干，残渣用流动相溶解即可。
9.如权利要求6所述的方法，其特征是所述的肝微粒体样本的预处理具体方法为取含有CYP450六种探针药物的肝微粒体，加入内标地西泮溶液I 10 ii g/ml，涡旋振荡，加入两倍体积的体积比为I : I的甲醇-乙腈混合液，旋涡，离心，取上清液进样。
10.如权利要求6所述的方法，其特征是所述的同时测定CYP450六种探针药物浓度的HPLC法的色谱条件是使用碳十八反相烷基键合硅胶柱，采用梯度洗脱法，流动相为甲醇、乙腈、0. 05mol/L磷酸氢二铵缓冲液pH3. 4的混合溶液，该混合溶液中三者体积比随时间而变化，运行开始到5min为30 10 60，5 8min为35 13 52，8 IOmin为35 14 51，10 15min 为 40 15 45，15 35min 为 45 15 40，35 40min*30 10 60 ;流速 l.Oml/min，检测波长 230nm，柱温 35°C。
全文摘要
本发明涉及一种测定细胞色素P450代谢活性的探针药物组合物的制备、检测方法及其应用；组合物含有CYP450的主要亚型CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4的特异性探针为活性成分制备而成的制剂。配制成“cocktail”探针药液，将该探针药物组合物给予动物或者与肝微粒体体外共孵育，通过测定各探针药物的浓度而评价CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4的代谢活性；在新药研发初期，高通量筛选药物对于细胞色素P450各亚型活性的影响，从而预测药物相互作用。在临床研究阶段，可以应用该探针药物组合物进行体内探针法试验，考察药物对人肝CYP450不同亚型体内代谢活性的影响。
文档编号A61K49/00GK102650620SQ20121006859
公开日2012年8月29日 申请日期2012年3月15日 优先权日2012年3月15日
发明者刘洁, 娄建石, 张才丽, 李芹, 汪云, 焦建杰 申请人:天津医科大学