专利名称：：治疗剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及木瓜凝乳蛋白酶，改进的含有木瓜凝乳蛋白酶的药物组合物，以及治疗脊椎动物椎间的损伤的，突出的或异常的椎间盘的方法。该方法包括将一种改进的组合物溶液注入所说的椎间盘。本发明还涉及制备本发明木瓜凝乳蛋白酶的方法，和用于这些方法中的肽和亲合色谱法的基质，以及抗木瓜凝乳蛋白酶培养的单一特异抗体制剂。木瓜凝乳蛋白酶是一种存在于巴婆(paw-paw)[番木瓜(caricapapava)]植物胶乳中的一种半胱氨酸蛋白酶。已知它可用于临床，特别是在周知的“化学核溶解(chemonucleolysis)”中治疗椎间盘的脱垂或突出或坐骨神经痛，(smith，L.(1964)，J，Amer.Med.Assoc.187，137-140)。Jansen和Balls(1941)首先尝试将木瓜凝乳蛋白酶纯化和表征它(J.Biol.chem.，137，405-417)。它们采用酸沉淀和盐析方法制备酶。近来，都使用离子交换色谱法进行纯化。例如，GB2098997(SmithLaboratoriesInc.)和GB2156821(Simmons)都描述了采用阳离子交换树脂从其它已知的半胱氨酸蛋白酶中分离木瓜凝乳蛋白酶，这些方法都已用于工业规模生产木瓜凝乳蛋白酶。但是所得产物与Buttle和Barrett(1984.Biochem.J.223，81～88)所制备的相比较，其比活度相当低，该方法使用小规模的多步法，中间结合阳离子交换色谱步骤。这种高比活度的产物，其产率极低，而且方法不宜用于工业规模。Buttle等人(Biochem.J.(1989.7月)261，469-476)发现，这种产物由一种新近分离和表征的蛋白酶，番木瓜蛋白酶Ⅳ所污染，这种酶和木瓜凝乳蛋白酶一起从阳率子交换树脂上共洗脱。阳离子交换色谱法不能从番木瓜蛋白酶中分离木瓜凝乳蛋白酶达到这样的程度以致能用于制备木瓜凝乳蛋白酶而基本上没有番木瓜蛋白酶Ⅳ的污染。文献中也有涉及到使用亲合色谱步骤的方法。Polgar(1981，Biochim，Biophys，Acta，658，262～269)描述了纯化木瓜凝乳蛋白酶的方法，在许多其它技术中，采用了在琼脂糖-汞化合物柱上的亲合色谱法，Dubois等人(Biol.Chem.Hoppe-Seyler(1988)，369，733-740)报导了采用类似的技术由番木瓜胶乳中分离半胱氨酸蛋白酶。这种亲合色谱法是基于键合到惰性基质的汞配位体和蛋白酶的暴露的硫醇基团之间的相互作用。因此，除了木瓜凝乳蛋白酶之外的蛋白质，尤其是其它半胱氨酸蛋白酶，如番木瓜蛋白酶Ⅳ，能结合到这种柱上并接着能和木瓜凝乳蛋白酶一起共洗脱。最近，科学论文报导了采用固定肽衍生物通过亲合色谱法来纯化特异蛋白酶，例如，人体组织蛋白酶(Rich等人，1986，Biochem.J.235，731-4)和由溶组织内阿来巴(Entamoebahistolytica)分离组织溶解酶(Luaces和Barrett，1988，Biochem.J.250，903-909)。然而，至今这种方法还没有用于纯化木瓜凝乳蛋白酶。因此，很明显，需要一种适用于工业规模的，纯化木瓜凝乳蛋白酶的改进方法。本发明人发现了一种新的纯化和分离高活性木瓜凝乳蛋白酶而没有污染的方法，特别是，没有番木瓜胶乳中的其它半胱氨酸蛋白酶(包括番木瓜蛋白酶Ⅳ)的污染。本发明提供了一种木瓜凝乳蛋白酶，它基本是纯的并含有高比率的活性酶。本发明的木瓜凝乳蛋白酶基本上不含存在于番木瓜胶乳中的免疫学上特殊的蛋白酶，即木瓜蛋白酶和番木瓜蛋白酶Ⅲ(PPIII)，这两种酶都由Buttle和Barrett((1984)，Biochem.J.，223，81～88.)描述，尤其近来发现的番木瓜蛋白酶Ⅳ(PPIV)。本文所用的“基本上纯”可以进一步定义为“基本上免疫学纯”是指本发明的木瓜凝乳蛋白酶与抗纯的PPIV所产生的特异抗体(由Buttle等人分离和表征的，见Biochem.J.(1989.7月)261，469～476而且在下文有简述)之间基本上没有任何交叉反应，以及与对木瓜蛋白酶和PPⅢ而培养的特异抗体(如上文Buttle和Barrett(1984)所述，同上文)基本上没有任何交叉反应。需要特别注意的是，发现按Buttle和Barrett方法制备的所谓“纯”木瓜凝乳蛋白酶含有明显量的PPⅣ(约14%)，因此最初由它们制备的抗木瓜凝乳蛋白酶抗体制剂对本发明纯化的木瓜凝乳蛋白酶和纯化的PPⅣ两者都具有特异性。优选的本发明木瓜凝乳蛋白酶中的各种PPⅣ、PPⅢ和木瓜蛋白酶的含量低于1%(重量)、更好的低于0.2%(重量)，最好的低于0.1%(重量)。抗本发明木瓜凝乳蛋白酶的单一特异抗体制剂是本发明的另一方面。在抗原和抗体之间的交叉反应可以用通常技术检测。这些技术包括如熔融火箭(fusedrocket)免疫电泳法和双向免疫扩散法(doubleimmunodiffusion)(由Buttle和Barrett描述，(1984)，同上文)，单一散射免疫测试法，放射免疫测试法(RIA)以及连接酶的免疫吸附剂测定法(ELISA)。任何酶制剂中的所含活性酶的量一般是指，在指定测定条件下，对一种特定的基质的比活性。本文所用的“对BAPNA的比活性”是指在标准测定条件下用合成基质N-α-苯甲酰基-DL-精氨酸对-硝基酰苯胺(BAPNA)测定时，按每毫克干产物每秒所产生的对硝基酰苯胺的皮摩尔数(pmol/sec/mg)表示的蛋白酶活性。对已知木瓜凝乳蛋白酶药物制剂所用的标准测定条件详细描述于下文，如“BAPNA测定方法1”或“Smith测定方法”以及由此得到的比活性是指在37℃pH6时，对BAPNA(1mM)的比活性。本发明的木瓜凝乳蛋白酶定义为，在37℃和pH6.0时，对BAPNA(1mM)的比活性至少为750单位每毫克。一般，本发明的木瓜凝乳蛋白酶，在37℃和pH6时，对BAPNA(mM)的比活性为800～1700单位每毫克，优选的为1000-1700单位每毫克，如1200-1500单位每毫克。在本发明的一个优选方案提供一种在37℃pH6.0时具有至少1300单位每毫克的对BAPNA(1mM)的比活性的木瓜凝乳蛋白酶。在大量涉及木瓜凝乳蛋白酶和其它半胱氨酸蛋白酶的文献中，蛋白酶活性广泛地定义是根据由合成基质BAPNA中所释放的对一硝基苯胺。当在所引用的比活性值之间进行直接比较时仍可遇到问题。要取得精确值决定于许多因数，特别是涉及精确的条件，如在测定中所用的pH值、温度、缓冲剂组份和基质浓度。由Buttle和Barrett(1984，同上文)所制备的木瓜凝乳蛋白酶在其文中所引用的抗BAPNA的比活性为0.154μmol/min/mg，相当于2567pmol/sec/mg。但是Buttle和Barrett所用的测定条件不同于已知的药物级木瓜凝乳蛋白酶所用的测定条件。因此不能直接比较比活性。因为Buttle和Barrett所制备的产物被认为在至今所报导的具有最高比活性的木瓜凝乳蛋白酶制剂，所以本发明的最初工作是按他们文献中所指定的测定条件进行。本文中将该方法以BAPNA测定方法2表示，由此得到的比活性是指在40℃和pH6.8时的抗BAPNA(2.5mM)的比活性。很明显，测定条件不同于木瓜凝乳蛋白酶的药物制剂所用的条件。采用这测定方法测得的结果表明，比采用通常的药物BAPNA测定法1所测得的结果高2-3倍，虽然这也许是科学上的错误，要使用一种简单的转换因素将一种测定方法的结果转换到另一种测定方法的结果。然而，涉及本发明的早期工作表明，本发明的纯木瓜凝乳蛋白酶在40℃和pH6.8时，其抗BAPNA(2.5mM)的比活性确定为至少2500单位/每毫克，优选的为3000-4500单位/每毫克，例如，3500-4500单位/每毫克。在一个优选方案中，本发明提供了在40℃和pH6.8时对BAPNA(2.5mM)具有的比活性至少为3000单位/每毫克的木瓜凝乳蛋白酶。本发明的发明人，在其最近发表的工作(1989，7月，同上文)(在下文中有简述)中，纯化并表征了一种存在于现有技术方法所生产的木瓜凝乳蛋白酶中的，以前未知的污染物，称为番木瓜蛋白酶Ⅳ(PPⅣ)。PPⅣ对BAPNA是失活的，但对偶氮酪蛋白具有蛋白酶活性的。另外，还发现PPⅣ对偶氮酪蛋白的活性基本上不受1μM以下浓度的鸡胱素(chickencystatin)的抑制。本发明的木瓜凝乳蛋白酶对偶氮酶蛋白的活性至少有95%被这些浓度的鸡胱素所抑制。本文所用的词“对偶氮酪蛋白的活性”是指蛋白酶活性，它根据在下文所述的标准条件下，使用衍生的蛋白基质偶氮酪蛋白测定时，以每单位干重产物在每单位时间内所产生的三氯乙酸可溶肽的量来表示。根据本发明的优选木瓜凝乳蛋白酶具有对偶氮酪蛋白的活性，该活性至少有97%，特别是有98-100%，被1μM以下浓度的鸡胱素所抑制。申请人确信本发明的木瓜凝乳蛋白酶基本上是纯的木瓜凝乳蛋白酶，是第一次制备出来的没有污染蛋白而含有高比例的活性酶。这一突破的取得仅仅在于发现了有一种污染蛋白至今一直与木瓜凝乳蛋白酶共纯化，如在离子交换和已知的亲合柱上的纯化。进一步的工作就是如PPⅣ污染物的分离和表征。用于制备PPⅣ的方法不宜用于制备纯木瓜凝乳蛋白酶，但是PPⅣ的制备提供了两个重要参数，通过这些参数就可以表征纯的木瓜凝乳蛋白酶，即1)纯木瓜凝乳蛋白酶与PPⅣ-特异抗体之间没有交叉反应作用，2)在有鸡胱素存在下，纯木瓜凝乳蛋白酶和PPⅣ对偶氮酪蛋白的活性有区别的。这两个特征是研究适于纯化木瓜凝乳蛋白酶方法所必要的基本工具。很明显，本发明的木瓜凝乳蛋白酶几乎是具有理想活性的木瓜凝乳蛋白酶。纯酶制剂对于那些企图充分表征酶，例如根据其催化特性和结构，来说是极为重要的。本发明的另一方面是提供一种含有本发明木瓜凝乳蛋白酶的组合物，该组合物基本上是没有PPⅣ。最好木瓜凝乳蛋白酶在37℃和pH6.0时，对BAPNA(1mM)的比活性至少为750单位每毫克。组合物可以是按适当重量的分立单位形式，例如，在无水条件下(如在真空瓶或安瓿中)密封的木瓜凝乳蛋白酶等分立形式。这些组合物也可以含有还原剂如二硫苏糖醇，半胱氨酸自由基或酸的加成盐，以基本上防止因氧化而使酶失活。另外，组合物还可以含有一种具有盐形式的可逆半胱氨酸蛋白酶抑制剂，例如，连四硫酸钠或氯化汞。这些可逆抑制剂屏蔽了酶的活性位点，从而阻止其因氧化而失活，直到有一种能再活化酶的还原剂置换为止。其它的惯用添加剂，例如，诸如亚硫酸氢钠的防腐剂，诸如EDTA的螯合剂，诸如氯化钠的载体，也可以根据需要而加入。使用一种纯酶制剂在木瓜凝乳蛋白酶的临床应用方面极为重要。例如化学核溶解(chemonucleolysis)，据报导，对这种治疗的过敏反应可以达到治疗病人的3%。粉状的番木瓜提取物是广泛地用于食品工业，因此，可以认为，许多对化学核溶解的过敏反应是由于对这些制剂的予敏化引起的。众所周知，对哺乳动物注射外来蛋白酶抗原往往会伴发过敏性反应的休克的危险，需要按照完善的医学实践以使用最纯和最具活性的任何这种蛋白酶，以利于获得最佳的作用效果以及降低变应性反应的危险至最小。因此本发明的一个优选方面是提供一种含有本发明木瓜凝乳蛋白酶的药物组合物，该组合物基本上没有PPⅣ。优选的木瓜凝乳蛋白酶在37℃和pH6.0时对BAPNA(1mM)的比活性至少是750单位每毫克。该药物组合物最好还含有一种药物上允许的无毒还原剂，如半胱氨酸游离碱或其酸的加成盐，如L-半胱氨酸盐酸-水合物。一般，还原剂的用量为每4000单位木瓜凝乳蛋白酶约0.5-3毫克，例如是木瓜凝乳蛋白酶重量的15-90%。然而本发明的药物组合物还可以含有任何惯用的药物上允许的稀释剂、赋形剂或载体，例如，如亚硫酸氢钠的防腐剂、如EDTA的螯合剂和如氯化钠的载体，根据需要，可以加入。含有本发明木瓜凝乳蛋白酶的药物组合物可用于眼科学，如眼损伤的治疗，或焦痂组织的清创术，如烧伤、溃疡、压迫坏死、褥疮和其它有失活组织存在的损伤。该组合物一般适于局部使用，例如无菌溶液、凝胶、悬浮液或软膏，这些可直接用于伤口，也可以通过浸渍有该组合物的材料包裹伤口而施药。本发明的木瓜凝乳蛋白酶最好是制成用于矫形外科学的剂型。这种药物组合物可以很容易地制成非肠道给药的单位剂量形式，如在适宜载体中的无菌、无热原的溶液或悬浮液形式，或用于在用前重新配制的浓缩剂型。适用于通过注射溶解或处置异常或损伤的椎间盘的髓核的药剂量单位可以是500-5000BAPNA单位(在37℃和pH6.0用1mMBAPNA测定)的本发明木瓜凝乳蛋白酶和诸如半胱氨酸钠盐酸的还原剂，并包装在真空瓶中。优选的药剂单位形式是标称2000或4000BAPNA单位(1mMBAPNA，37℃，pH6.0)的木瓜凝乳酶。剂量单位大致可以包括如2-5mg，最好2.5-3.5mg的木瓜凝乳蛋白酶和0.2-3mg，最好是1.0-2.0mg的半胱氨酸钠盐酸，包装在真空容器内，可以任选地混合有适宜的载体，如氯化钠。在下文所述的实验中，发现有26个单独血清样品对商品的木瓜凝乳蛋白酶制剂chymodiactinR(按GB2098997所述方法生产)具有天然获得的IGE抗体。本文实验证明，这些血清含有对本发明木瓜凝乳蛋白酶和对其它三种发现于番木瓜胶乳的半胱氨酸蛋白酶，即木瓜蛋白酶、PPⅢ、PPⅣ，的IgE抗体。然而，对木瓜凝乳蛋白酶、PPⅢ、和PPⅣ的平均IgE强度表明，PPⅢ和PPⅣ的总计约为检出IgE的75%。这些结果清楚地表明，这些蛋白酶具有基本免疫原的特征而且可以代表在至今易于制得的木瓜凝乳蛋白酶中所含抗原决定子的主要部分，而且成为一种极大的潜在抗原危害性。因此本发明的药物组合物具有优于现有技术组合物的实质性优点。本发明还涉及采用化学核溶解法治疗哺乳动物椎间盘的损伤、突出或其它异常，该方法包括向椎间盘注射一种本发明木瓜凝乳蛋白酶的药用溶液，其用量要足以有选择地溶解所述椎间盘部位。本发明还涉及治疗哺乳动物主体的椎间盘异常的方法，该方法包括ⅰ)将针插入椎间盘;ⅱ)用X-射线确定所述针的位置;ⅲ)向椎间盘注入本发明木瓜凝乳蛋白酶的药用溶液，其用量要足以有选择地溶解所述椎间盘部位。本发明还提供了一种纯化木瓜凝乳蛋白酶的方法，该方法包括a)和一种直接亲合色谱基质的活性位点来保温粗制木瓜凝乳蛋白酶的水溶液，该基质含有一种载体基质，任选地通过间隔段(spacerarm)而共价偶合到可逆的木瓜凝乳蛋白酶抑制肽的N-端上，以使所述肽结合到木瓜凝乳蛋白酶分子的活性位点;b)用一种适宜的洗脱液洗脱木瓜凝乳蛋白酶。用作本发明纯化木瓜凝乳蛋白酶的原料的粗制木瓜凝乳蛋白酶，可以是鲜木瓜胶乳的提取物，一种由可商购的喷雾干燥胶乳制剂的溶液，木瓜蛋白酶的浓缩物，或部分纯化的木瓜凝乳蛋白酶，或者可以是一种所谓“纯”的木瓜凝乳蛋白酶的可商购的制剂。然而，专业人没应当明白，番木瓜的相当完全的提取物，如番木瓜胶乳，含有相当量的其它天然存在的组份，这些组份需要去除。在将粗制木瓜凝乳蛋白酶溶液用亲合色谱法基质进行保温之前，最好将这些组份的大部分去除，例如，可通过过滤或离心除去不溶物。然而我们发现在一种酸沉淀过程中大部分杂质都沉淀，这种酸沉淀步骤是特别有利。在酸沉淀过程中，粗制木瓜凝乳蛋白酶的水溶液的pH值降到低达pH2，放置，然后分出木瓜凝乳蛋白酶，用这种方法纯化木瓜凝乳蛋白酶已近50年。申请人惊奇地认为，在这方法中所用pH值的精确性大大地影响所得木瓜凝乳蛋白酶溶液的PPⅣ污染。仔细地监测和控制这步骤(至今一直认为这是木瓜凝乳蛋白酶纯化粗制的基本步骤)可以显著地降低PPⅣ的污染，现在发现PPⅣ蛋白在使用通常方法时与木瓜凝乳蛋白酶共纯化。本发明提供一种纯化木瓜凝乳蛋白酶的方法，包括1、在pH值低于2.0的条件下，沉淀一种含有粗制木瓜凝乳蛋白酶的水溶液混合物;2、从所述混合物中分离粗制木瓜凝乳蛋白酶的水溶液;3、中和并任选地对所述粗制木瓜凝乳蛋白酶溶液进行脱盐。最好从制剂中除去任何残留的蛋白污染物，通过在纯化过程中采用包括至少一个阳离子交换色谱步骤，如Buttle和Barrett所述的(1984，同上文)。最好是使用高性能色谱，例如在如商品称为Monos或S-SepharoseRHP(Pharmacia)的阳离子交换树脂上的FPLCR作为最终步骤。本发明的一个特别优选的方面是提供一个纯化木瓜凝乳蛋白酶的方法，该方法包括ⅰ)最好在pH低于2.0的条件下，酸沉淀一种含有粗制木瓜凝乳蛋白酶的水溶液混合物;ⅱ)从所述混合物中分离粗制木瓜凝乳蛋白酶的水溶液;ⅲ)中和和任选地对所述粗制木瓜凝乳蛋白酶进行脱盐;ⅳ)和一种有直接亲合色谱基质的活性位点保温由ⅲ)得到的溶液，该色谱基质包含一种载体基质，该基质，可任选地通过间隔段，共价偶合到一种可逆的木瓜凝乳蛋白酶抑制肽的N-端，以使所述肽结合到木瓜凝乳蛋白酶分子的活性位点上;ⅴ)用适宜的洗脱剂洗脱木瓜凝乳蛋白酶。对专业人员来说是显然的，优选的阳离子交换色谱步骤可以按要求，在亲合色谱步骤之前或之后，交换地或附加地直接使用。含有粗制木瓜凝乳蛋白酶的混合水溶液可以是例如，鲜番木瓜胶乳、喷雾干燥的番木瓜胶乳或木瓜蛋白酶浓缩物(例如，由英国的Powell&Scholefield，或由美国的Siebels商购的喷雾干燥胶乳)悬浮在水中或在如磷酸盐或乙酸盐缓冲剂的缓冲水溶液中。在混合物酸沉淀之前最好用通常方式，如过滤或离心除去不溶物。通过逐渐加入有机或无机酸可以酸化混合物，最好是使用无机酸水溶液，如盐酸，将混合物的pH值降到1.0-2.0，优选的是1.2-1.8，最好是降到约1.5的pH值。所沉淀的物质可以用通常方式，如过滤或离心，去除。所得的酸性粗制木瓜凝乳蛋白酶溶液中，发现PPⅣ和木瓜蛋白酶已被除尽，而有很少量的PPⅢ。在将酸性粗制木瓜凝乳蛋白酶进行任何进一步的色谱步骤之前，专业人员都知道，需要用碱性试剂如氢氧化钠水溶液中和溶液;并且最好按通常方式，如采用凝胶过滤或渗析，从溶液中除去过量的盐。通过过滤或离心可以除去任何其它沉淀物。众所周知，在半胱氨酸蛋白酶的现有技术中，可以用还原剂，如二硫苏糖醇或半胱氨酸，来活化并用如EDTA的螯合剂或如商品名为chelex(Bio-Rad，英国)的螯合树脂除去痕量重金属，如汞，通过这些途径都可以明显提高酶的活性。这些方法最好要有自由硫醇基存在，这是公知的，它是半胱氨酸蛋白酶活性位点的基本特征，是活性必要的。重金属的去除最好通过对含有EDTA的缓冲液进行渗析来进行。另外，当采用阳离子交换色谱步骤时，重金属可以通过以还原剂活化木瓜凝乳蛋白酶而除去，因为重金属结合在阳离子交换柱上随后洗涤交换柱。最好在中和之后，用还原剂，如半胱氨酸，处理粗制木瓜凝乳蛋白酶溶液，以保证活性位点的最大暴露，并将它稀释到适当的蛋白质含量，如30mg/ml。然后和一种直接亲合色谱基质的活性位点保温中和过的粗制木瓜凝乳蛋白酶溶液，使之通过活性位点将木瓜凝乳蛋白酶特定地结合到与其结合的抑制肽上。木瓜凝乳蛋白酶可以按一定速率，如35-40ml/hr/cm2，加到亲合色谱基质柱上。每升亲合色谱基质可以结合约1-4克木瓜凝乳蛋白酶。亲合色谱基质包括一种载体基质，如凝胶或膜基质，一种抑制肽是共价偶合到基质上而固定。优选的载体基质是琼脂糖凝胶，如商品名为SepharoseR(Pharmacia)的，也可以使用衍生的纤维素质膜基质，如商品名为Zeta(Anachem)的那些，肽的N-端可以直接或通过一种间隔段而间接结合到载体基质上，间隔段是一种例如9个碳原子的间隔段，如商品名为ECHSepharoseR4B(Pharmacia)的一种优选的凝胶基质。这种凝胶基质上的游离羧基和抑制肽的游离氨基之间的偶合，导致肽键的形成，这过种可以按通常方式实现，如通过以一种水溶液的碳化二亚胺溶液促进的酸催化的缩合，碳化二亚胺可以是N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸(EDC)。一般的偶合是通过在EDC存在下，将凝胶基质与抑制肽溶液一起轻轻搅动，例如在室温下搅动24小时。肽与凝胶基质的适当偶合比是，例如，每升凝胶3-4克肽。在使用前，可以将亲合色谱基质先装入色谱柱。然而，当所用的色谱基质是一种凝胶时，也可以采用不连续保温的步骤，然后，如有需要，将基质装入柱中以便以后酶的洗脱。最好在使用前用缓冲水溶液好好洗涤基质以除去痕量的未结合肽和缩合催化剂。为生产使用亲合色谱基质柱，最好要保持现场卫生，如使用乙醇水溶液并因而可重复使用。可逆的木瓜凝乳蛋白酶抑制肽，是指那些当它们固定在载体基质上时，能与木瓜凝乳蛋白酶的活性位点结合，这种结合比对在粗制木瓜凝乳蛋白酶制剂中所存在的其它半胱氨酸蛋白酶(特别是PPⅣ)的活性位点的结合要强得多，但是这些在以后可以置换的。在优选的抑制肽基团中，C-端氨基酸包括醛衍生物，如缩氨基脲，甲氧基亚胺或苯丙氨酸的肟或一种苯丙氨酸的类似物。更具体地说，C-端的氨基酸可以是一种苯丙氨酸的衍生物，如D或L-苯丙氨酸缩氨酸脲(PheSc)，甲氧基亚胺(PheMo)或肟(PheOx)或一种苯丙氨酸的类似衍生物，例如，D或L-丙氨酸缩氨基脲(AlaSc)，D或L-环己基丙氨酸缩氨基脲(ChaSc)或D或L-亮氨酸缩氨基脲(LeuSe)。以下的C-端二肽认为是优良的木瓜凝乳蛋白酶抑制肽，即L-ALa-L-PheSc、L-Ala-D-PheSc、L-Phe-D-PheSc、L-Phe-L-PheSc、L-Phe-L-PheMo、L-Phe-L-PheOx、L-Tyr-L-PheSc、L-Ala-L-ChaSc、和L-Ala-L-LeuSc。二肽L-Phe-L-PheSc已由Luaces和Barrett[(1988)，250，903-909)所描述。特别优选的肽是二肽，尤其是L-Ala-L-PheSc、L-Ala-D-PheSc和L-Phe-D-PheSc。新的抑制肽本身和含有这些肽的新亲合色谱基质构成本发明的另一方面。在将木瓜凝乳蛋白酶从亲合色谱基质上洗脱之前，最好先洗涤基质，以去除非特定结合的物质，例如，用诸如pH4-5的柠檬酸盐或乙酸盐缓冲剂的缓冲水溶液。发现在洗涤缓冲液和洗脱缓冲液中添加试剂是十分有利的，这样可以降低疏水性的相互作用以及基质与粗制木瓜凝乳蛋白酶成份之间的其它非特定结合的反应。这些试剂包括，如EDTA、异丙醇和乙二醇。用适当的洗脱剂将木瓜凝乳蛋白酶由基质上洗脱。适当的洗脱剂能够破坏固定的抑制肽与其结合的木瓜凝乳蛋白酶之间的结合，或者通过降低活性位点对抑制肽的亲合性，或者通过选择地从活性位点置换肽。木瓜凝乳蛋白酶对抑制肽的亲合性可以降低，如，通过用一种改性剂(如异丙醇)或用一种具有高于或低于木瓜凝乳蛋白酶的活性pH值范围的pH值的洗脱剂，以改变活性位点的特性。然而，专业人员很清楚，这些洗脱剂必须是那些不能引起所洗脱的酶产生不可逆的失活。另外，通过洗脱剂，可以将木瓜凝乳蛋白酶从固定抑制肽上选择性地置换出来，该洗脱剂含有一种过量的与抑制肽紧密结合的组份，例如，另一种半胱氨酸蛋白酶。本发明的一个较佳方面中，洗脱剂含有一种可逆的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，它与木瓜凝乳蛋白酶的活性位点优先结合，从而从固定的抑制肽上将它置换出来。常用的抑制剂包括，如，低分子量的二硫化物，如22′-二联吡啶二硫化物，羟乙基二硫化物，甲基-2-吡啶基二硫化物和联四硫酸钠;以及汞化合物试剂，如氯化汞、对一氯汞苯甲酸盐和汞撒利。专业人员都清楚，木瓜凝乳蛋白酶和固定抑制肽之间的亲和性是随着所使用的肽的种类、pH值、离子强度和洗脱缓冲液的组成以及所用的温度而改变的。因此用于洗脱木瓜凝乳蛋白酶必要的蛋白酶抑制剂的确切性质和浓度也有变化。再者，汞化合物试剂与木瓜凝乳蛋白酶之间的平衡比二硫化物试剂更快，而且可以使用这些抑制剂连续进行洗脱。只有与结合的木瓜凝乳蛋白酶慢平衡的那些抑制剂，在木瓜凝乳酶洗脱之前，可以需要用抑制剂保温基质，如1-2小时或更长时间。洗脱馏份的蛋白质含量或蛋白酶活性可以按常规方法监测，离子强度或洗脱剂性质以及基质与抑制剂的保温时间可以变化，以便有效地并有选择地从基质中置换木瓜凝乳蛋白酶。将含有少量蛋白质或少量木瓜凝乳蛋白酶的洗脱馏分排出。洗脱剂的pH值最好要足够的低，以减弱木瓜凝乳蛋白酶与抑制肽之间的相互作用，例如，pH4-5，更具体的是pH4.5。适宜的洗脱剂包括，例如，在pH4.5的含有柠檬酸钠(50mM)和EDTA(1mM)的乙二醇水溶液(33%)中的羟乙基二硫化合物(100mM)，在pH4.5的含有柠檬酸钠(50mM)和EDTA(1mM)的乙二醇水溶液(33%)中的二联吡啶二硫化物(30mM)，在pH4.5的含有柠檬酸钠(50mM)和EDTA(1mM)的乙二醇水溶液(33%)中的甲基吡啶二硫化物(30mM)，在含有氢氧化钠(50mM)和EDTA(25mM)的乙二醇水溶液(33%)中的汞撒利酸(10mM)并用乙酸调节至pH4.5，和在pH4.5的含有乙酸钠(50mM)的乙二醇水溶液(33%)的氯化汞(10mM)。氯化汞是特别优选的可逆半胱氨酸蛋白酶抑制剂。在本发明的优选方法中，亲合色谱步骤明显地增加了所纯化的木瓜凝乳蛋白酶的比活性，正如根据对BAPNA的活性测定或通过用E-64或碘乙酸进行活性位点滴定的结果所示。活性形式的木瓜凝乳蛋白酶优先结合并洗脱，因此不同于失活形式的木瓜凝乳蛋白酶和粗制剂中所存在的一些其它半胱氨酸蛋白酶。按本发明采用亲合色谱纯化的新制备的木瓜凝乳蛋白酶一般至少含有70%、优选的至少80%，最好的至少90%活性酶。一般在储存或使用之前，从洗脱液中回收纯化的木瓜凝乳蛋白酶。最好将洗脱的木瓜凝乳蛋白酶进行进一步的纯化，以便从酶的活性位点置换半胱氨酸蛋白酶抑制剂。可以通过加入过量的还原剂，如半胱氨酸，置换抑制剂，如有必要，可任选地使用常规技术如凝胶过滤或渗析以除去置换的抑制剂。另外，可以通过吸附在特定的树脂上以去除抑制剂，例如，低分子量的二硫化物可以吸附在谷胱甘肽亲合柱上而汞化合物试剂可以吸附在螯合树脂上。当抑制剂结合在阴离子交换柱上时，最好通过用还原剂，如半胱氨酸，活化酶而除去抑制剂，然后再将抑制剂从柱上洗掉。在储存之前最好冻干，例如冷冻-干燥，回收纯化木瓜凝乳蛋白酶。本发明的木瓜凝乳蛋白酶可以通过现有技术的已知方法进一步进行表征。这些方法包括，如N-端氨基酸分析、用E-64或碘乙酸滴定活性位点和同时失活速率，十二烷基硫酸钠或多区域阴极聚丙烯酰胺凝胶电泳以及对不同蛋白酶基质的活性。本发明的新的抑制肽可以按现有技术中公知的类似方法进行制备。例如，二肽衍生物可以按以下系列步骤合成a)可以对要形成抑制肽C-端的氨基酸(第一个氨基酸)的C-端在本发明的优选方法中，亲合色谱步骤明显地增加了所纯化的木瓜凝乳蛋白酶的比活性，正如根据对BAPNA的活性测定或通过用E-64或碘乙酸进行活性位点滴定的结果所示。活性形式的木瓜凝乳蛋白酶优先结合并洗脱，因此不同于失活形式的木瓜凝乳蛋白酶和粗制剂中所存在的一些其它半胱氨酸蛋白酶。按本发明采用亲合色谱纯化的新制备的木瓜凝乳蛋白酶一般至少含有70%、优选的至少80%，最好的至少90%活性酶。一般在储存或使用之前，从洗脱液中回收纯化的木瓜凝乳蛋白酶。最好将洗脱的木瓜凝乳蛋白酶进行进一步的纯化，以便从酶的活性位点置换半胱氨酸蛋白酶抑制剂。可以通过加入过量的还原剂，如半胱氨酸，置换抑制剂，如有必要，可任选地使用常规技术如凝胶过滤或渗析以除去置换的抑制剂。另外，可以通过吸附在特定的树脂上以去除抑制剂，例如，低分子量的二硫化物可以吸附在谷胱甘肽亲合柱上而汞化合物试剂可以吸附在螯合树脂上。当抑制剂结合在阳离子交换柱上时，最好通过用还原剂，如半胱氨酸，活化酶而除去抑制剂，然后再将抑制剂从柱上洗掉。在储存之前最好冻干，例如冷冻-干燥，回收纯化木瓜凝乳蛋白酶。本发明的木瓜凝乳蛋白酶可以通过现有技术的已知方法进一步进行表征。这些方法包括，如N-端氨基酸分析、用E-64或碘乙酸滴定活性位点和同时失活速率，十二烷基硫酸钠或多区域阴极聚丙烯酰胺凝胶电泳以及对不同蛋白酶基质的活性。本发明的新的抑制肽可以按现有技术中公知的类似方法进行制备。例如，二肽衍生物可以按以下系列步骤合成a)可以对要形成抑制肽C-端的氨基酸(第一个氨基酸)的C-端进行保护，例如，在有异丁基氯甲酸盐和N-甲基吗啉存在的条件下与O，N-二甲基羟胺盐酸反应，得到二甲基羟基酰胺衍生物。最好将第一氨基酸的N-端用，例如叔丁氧基羰基，进行最初保护。b)已保护的第一氨基酸，例如二甲基羟基酰胺衍生物可以和强酸，如三氟乙酸，反应而形成季胺盐。c)然后已保护的第一氨基酸的季铵盐可以与第二个氨基酸衍生物，例如N-苄酯基衍生物，反应以生成一种二肽衍生物。d)上面所形成的二肽衍生物可以用一种适度还原剂，如二异丁基铝的氢化物或锂铝氢化物，还原，而在二肽的C-端产生一个游离醛基。e)上面所形成的醛可以衍生，例如，与氨基脲反应得到缩氨基脲，与甲氧基胺盐酸反应得到甲氧基亚胺或与羟胺反应得到一种肟。f)最后，可以将保护的N-端去保护，例如，通过使用活性炭上的10%的钯催化还原可以除去N-苄酯基基团。蛋白质的测定如有可能，通过A280测定蛋白浓度，对番木瓜胶乳制剂使用A280，1%＝20.0，而对纯化或部分纯化的木瓜凝乳蛋白酶制剂使用A280，1%＝18.3(Robinson，1975，Biochemistry14，3695-3700)。某些含硫醇的试剂和二硫化物会在280nm吸收。当有这些物质存在时，使用Bio-Rad染色结合测定法(dye-bindingassay，(Bio-RadLaboratories，U.K.)以测定蛋白浓度。使用过滤的喷雾干燥番木瓜胶乳溶液(A280，1%＝20.0)作为标准。这方法比A280有更少的干扰。在纯化的酶制剂中蛋白质是按产品的总干重量计算的。木瓜凝乳蛋白酶活性的测定a)对BAPNA的活性(测定方法1)-Smith测定法将各样品加到“缓冲液1”，pH6.0含有EDTA(1mM)和半胱氨酸盐酸-水合物(10mM)的磷酸钠缓冲液(0.1M)，使最终体积为1.0ml。在37℃在反应开始之前通过加入予先加热至37℃的4mlN-α-苯甲酰基-DL-精氨酸对-硝基酰苯胺(BAPNA)(1.25mM)的基质溶液，将酶活化5分钟。将300mgBAPNA溶解在温热的二甲基亚砜中，慢慢加到予热到37℃的450ml缓冲液1中，然后再用缓冲液1加到500ml而制成N.B.基质溶液。将基质溶液保持在30℃以防止BAPNA沉淀。在37℃连续保温30分钟后，加入1ml乙酸(4N)以中止反应。通过测量△A410而测定所释放的4-硝基苯胺。在这条件下，一个单位的活性相当于每秒钟释放1皮摩尔4-硝基苯胺(ε＝8800M-1.cm-1)。这些测定条件相当于在以SmithLaboratoriesInc名义申请的GB2098997中所述的条件，并在全世界用于测定销售的木瓜凝乳蛋白酶药物制剂，如英国TheBootsCompanyPLC生产的商品名为Chymodiatin的木瓜凝乳蛋白酶、南朝鲜Sinpoong生产的商品名为Disken的木瓜凝乳蛋白酶。这种活性单位是国际认可的，通常是指SmithBAPNA测定单位”。b)对BAPNA的活性(测定方法2)将各样品加到pH6.8的含有EDTA(1mM)和二硫苏糖醇(2mM)或半胱氨酸(4mM)的磷酸钠缓冲水溶液(0.1M)中，使最终体积为0.975ml。在40℃在反应开始以前，通过加入25μl的N-α-苯甲酰基-DL-精氨酸P-硝基酰苯胺(BAPNA)(100mM)的二甲亚砜溶液将酶(存在于样品中)活化5分钟。在40℃连续保温10分钟，然后加入1mlpH4.3的氯乙酸钠(0.10M)/乙酸钠(0.20M)缓冲液以中止反应。用测量△A410测定释放的4-硝基苯胺。在此条件下一活性单位相当于每秒钟释放1皮摩尔的4-硝基苯胺(ε＝8800M-1.cm-1)。这些测定条件正好与Buttle和Barrett((1984)，同上文)所描述的一样，并用于实施例21、23和26所描述的予备实验中。使用BAPNA测定方法1和2所得到的木瓜凝乳蛋白酶活性的绝对值是不同的，用方法2得到的值比用方法1得到的值高约2至3倍(见实施例31)。c)用碘乙酸滴定活性位点。按照Zucker等人(Biochim.Biophys.Acta828(1985)，196-204)所描述的用E-64滴定活性位点的类似方法，使用碘乙酸进行木瓜凝乳蛋白酶的活性位点滴定。将木瓜凝乳蛋白酶溶液，按上面(a)中所述，稀释到缓冲液1中，得到含60μM蛋白的溶液(由A2801%＝18.3计算ε280＝4.3284×104M-1cm-1，Robinson(1975)，同上文，以及由Jacquet等人的氨基酸顺序计算MW＝23656，(May1989)，Bio.chem.Hoppe-Seyler，370，425-434)将20μl等分的木瓜凝乳蛋白酶溶液加到滴定管中，并在37℃和20μl缓冲液1(对照中为40μl)保温5分钟。在每个滴定管中加入20μl的碘乙酸水溶液(分别为10、20、30、40、50和60μM)并在37℃将混合物予保温10-20分钟。按前面(a)中所述，通过加入4ml予热到37℃的BAPNA基质溶液而开始反应。在37℃连续保温30分钟后，按(a)中所述，中止反应，通过△A410测定所释放的4-硝基苯胺。将这样得到的活性木瓜凝乳蛋白酶的摩尔浓度，与对木瓜凝乳蛋白酶以4.3284×104M-1cm-1摩尔消光系数为基础的蛋白摩尔浓度相比较。然后将活性蛋白的量以总蛋白的百分含量表示。d)对偶氮酪蛋白的活性对偶氮酪蛋白的活性是按上面Rowan等人(1988，Arch.Biochem.Biophys.267∶262-270)所描述的方法测定的，使用少于1μM的酶(基于分子量24000)，并如有需要，使用1μM鸡胱素。所有酶和抑制剂的浓度是指活性分子的浓度。使用单一散射免疫扩散进行免疫测定单一散射免疫扩散测定是基于Mancini等人(1965，Immunochem2，235-254)的方法，方法如下将在pH7.3含NaCl(0.14M)的磷酸钠水溶液(10mM)中的含有单一特异IgG制剂的琼脂糖(1%w/v)倒在GelBondR(FMCCorporation，Maine，美国)上，切割成矩形孔(r＝1mm)并相隔1.5cm。将参照和未知样品任意地分布在孔中以减少由于边缘效应而引起误差。接着在孔中加入抗原，将平板放置24小时以展开沉淀素环。然后洗涤、干燥和染色。使用纯的适度羧甲基化的抗原以产生标准曲线，该曲线是按抗原对环直径的平方绘制。有效的测定范围是每孔25-300ng。PPⅣ及对其抗体的制备a)亲合柱的制备将丁氧基羰基-L-Phe-P-硝基苯酯(10mM)加到α-NH2CH2CN.HCl(20mM)和二异丙基乙胺(20mM)在二甲基甲酰胺(20ml)中的搅拌混合物中。混合物在20℃搅拌2小时，然后用乙酸乙酯(100ml)稀释，用水(2X)，三乙胺水溶液(5X)、水(3X)、硫酸氢钾水溶液(2X)、水(3X)洗涤，干燥并蒸发。将残留物由乙酸乙酯己烷的溶液中结晶，得到Boc-L-Phe-NHCH2CN，熔点为134.5-135℃。将冰冷却的三氟乙酸水溶液(10ml)加到BOC-L-Phe-NHCH2-CN(5mmol)的二氯甲烷(10ml)溶液中。反应混合物在20℃保温30分钟，然后在40℃蒸发除去溶剂。将残留物溶于氯仿，蒸发并将该步骤重复二次。所得粗制三氟乙酸盐溶于二异丙基乙胺(7.5mmol)的二甲基甲酰胺(10ml)溶液中，并加入Boc-Gly-p-硝基苯基酯(6.25mmol)和N-羟基苯并三唑-水合物(6.25mmol)。然后滴加足量的二异丙基乙胺以生成p-硝基苯酚(金黄色)，并将此混合物在室温搅拌2小时。加入N，N-二乙基乙二胺(1.5ml)、15分钟后加入乙酸乙酯，然后将混合物用水、三乙胺水溶液、水、硫酸氢钾水溶液、水洗涤，干燥并蒸发。残留物在硅胶上色谱法用乙酸乙酯∶己烷(20∶1)洗脱纯化而得到泡沫状Boc-Gly-L-Phe-NHCH2CN。将Boc-Gly-L-Phe-NHCH2CN(30mg)溶于三氟乙酸∶二氯甲烷∶茴香醚(25∶65∶10，1ml)中，在0℃保温30分钟。将混合物在34℃旋转蒸发干燥，残余物溶于甲醇(1.5ml)和NaHCO3水溶液(0.1M，pH8.0，1.5ml)而得到配位体溶液。将活化的CH-SepharoseR4B(Pharmacia;3克干重)在4℃在盐酸水溶液(1mM，75ml)中水合过夜，然后用盐酸(1mM，600ml)，接着用NaHCO3水溶液(0.1M，pH8.0，300ml)进行洗涤。凝胶悬浮在NaHCO3水溶液(0.1M，pH8，30ml)中，加入配位体溶液(上述)，在20℃将混合物轻轻搅动过夜。在烧结玻璃滤器上收集凝胶，用甲醇水溶液(50%V/V，180ml)然后水(180ml)洗涤并悬浮在用HCl调至pH9.0的乙醇胺水溶液(0.1M，30ml)中。悬浮液在20℃摇动4小时，然后收集凝胶，并用水(500ml)洗涤而在4℃贮存于“使用”缓冲液(磷酸钠(50mM)，EDTA(1mM)，乙二醇(33%)，pH6.8)中。b)PPⅣ的纯化SepharoseR-AHx-Gly-L-Phe-NHCH2CN柱(柱床体积4ml)用“洗脱”缓冲液(柠檬酸钠(50mM)，乙二醇(33%)，pH4.5;12ml)然后用使用缓冲液(见上述，12ml)洗涤。将喷雾干燥的番木瓜胶乳(0.5克)溶于使用缓冲液(10ml)中并过滤(0.22μm孔径)。使用Bio-Rad染色结合测定法(Bio-RadLaboratories，英国)测定滤液中的蛋白浓度。在混合物中加入二硫苏糖醇，使其最终浓度为2mM，并将混合物在0℃保温20分钟。在20℃下将80mg胶乳蛋白加到柱(38ml/hr/cm2)上，接着加入使用缓冲液(8ml)，然后加入洗脱缓冲液(8ml)。随后加入含有羟乙基二硫化物(50mM)的洗脱缓冲液(4ml)，停止流动并在20℃将柱子放置过夜。然后用含有洗脱缓冲液的羟乙基二硫化物再开始洗脱(10ml)并收集洗脱馏分(1ml)。合并呈现有对BAPNA活性的馏分并直接加到用pH5.0，含EDTA(1mM)的乙酸钠/乙酸(50mM)水溶液予平衡的MonoSHR5/5R(阳离子交换)柱上，然后用相同的缓冲液洗涤交换柱(1ml/min)，直到A280nm回到零。然后将梯度(21.5mMNa+/ml)至1M的乙酸钠加到柱(Buttle和Barrett，1984，同上文)上并收集馏分(1ml)。洗脱两个主要蛋白峰，在约0.17MNa+处洗脱的第二峰相当于木瓜蛋白酶，在约0.38MNa+处洗脱的第二峰相于PPⅣ。合并PPⅣ峰的馏分并对EDTA水溶液(1mM)渗析，冷冻干燥并在-20℃贮存。纯化的PPⅣ中没有可检出量的对BAPNA的活性，但与消化偶氮酪蛋白的活性有关，这种活性是不能被1μM浓度的鸡胱素所抑制。c)PPⅣ特异抗体的制备使用前按zucker等人描述的方法(1985，Biochim，Biophys.Acta，828，196-204)将纯化的PPⅣ抗原适度羧甲基化。然后将对PPⅣ的抗血清在兔体内培养，通过肌肉注射在弗罗因德的完全助剂(Freund′scompleteadjurant)中的360μg羧甲基化的蛋白，二周后接着皮下注射在不完全助剂中的100μg。按Heide和Schnick(1978.HandbookofExperimentalImmunology(Weir，DM，ed)vol1，7.1-7.11.Blackwell，Oxford)所描述的方法，通过硫酸胺分馏，从抗血清中部分纯化IgG，接着渗析到含NaCl(0.14M)的pH7.3的磷酸钠(10mM)水溶液中。可以使用PPⅣ-特异IgG制剂，通过上述单一散射免疫扩散法测定PPⅣ。下面的实施例只是通过实施例更详细地说明本发明的各方面，而不是用以限制本发明的范围。本文所用的缩写包括ABTS，2，2′-连氮基双(3-乙基苯噻唑啉磺酸);Ahx，6-氨基己酰基;Ala，丙氨酸;BAPNA，N-α-苯甲酰基-DL-精氨酸p-硝基苯酰胺;Boc，丁氧基羰基;CBZ，苄酯基;Cha，环己基丙氨酸;DMF，N，N-二甲基甲酰胺;E-64，L-3-羧基-2，3-反-环氧-丙酰基亮氨酰基酰氨基-(4-胍基)丁烷;EDC，N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸;EDTA，乙二胺四乙酸(二钠盐);Gly，甘氨酸;Leu，亮氨酸;Mo，甲氧基亚胺;OBZ，氧苄基;Ox，肟;Phe，苯丙氨酸;Sc，缩氨基脲;THF，四氢呋喃;以及Tyr酪氨酸。Bio-Rad、Chelex、Chymodiactin、CH-Sepharose4B、Chymofast、Disken、ECH-Sepharose、Enzfitter，FPLC、GelBond，Mono.SHR、S-SepharoseHP、Tween、Zeta和Zetaffinity都是商品名。除非另外注明，所有步骤都是在室温下进行的。实施例1L-丙氨酰基-L-苯丙氨酰基缩氨基脲步骤aA)将O，N-二甲基羟胺HCl(10.23g)在室温下搅拌加到无水的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)(100ml)中。在温度保持低于30℃时，用5分钟时间加入N-甲基吗啉(10.6g)。产生白色沉淀并将混合物冷却至0℃。B)将N-t-Boc-L-Phe(26.5g)溶于无水四氢呋喃(THF)(200ml)中并冷却至-10℃。在保持温度-10℃时，用5分钟时间加入异丁基氯甲酸酯(14.38)于溶液中。在保持温度-10℃时，用10分钟时间加入N-甲基吗啉(10.6g)并连续搅拌10分钟。c)在-10℃用15分钟时间将悬浮液A加到悬浮液B中。将混合物温热至室温后搅拌3小时。然后将所得混合物冷却至0℃，并用5分钟时间加入3-二甲基氨基丙胺(10.2g)。加入水(200ml)和乙酸乙酯(200ml)分离出上层有机相并依次用(a)水(200ml)、(b)KHCO3水溶液(5%，200ml)、(c)HCl水溶液(0.5N，200ml)、和(d)水(3×200ml)洗涤。在保持温度低于30℃时，在真空下旋转蒸发去除溶剂，得到N-t-Boc-L-Phe-O，N-二甲基羟肟酸酯。步骤b将N-t-Boc-L-Phe-O，N-二甲基羟肟酸酯(2.9g)与三氟乙酸(8ml)在室温一起搅拌4小时。保持温度低于30℃，在真空下旋转蒸发除去过量的三氟乙酸。在残留物中加入乙醚(30ml)以形成溶液，然后真空除醚。重复用醚处理，直到产生结晶。过滤收集固体，用醚洗涤后在P2O5上真空干燥，得到L-Phe-O，N-二甲基羟肟酸酯的三氟乙酸盐。步骤cA)在室温搅拌下，将L-Phe-O，N-二甲基羟肟酸酯的三氟乙酸盐(7.15g)溶于无水DMF(30ml)中。在温度保持低于30℃时，用5分钟时间加入N-甲基吗啉(2.35g)，并将所得混合物冷却到0℃。B)在搅拌下，将CBZ-L-Ala(4.96g)溶于无水THF(55ml)中，并将混合物冷却至-10℃。在-10℃，用5分钟时间加入异丁基氯甲酸酯(3.05g)，用10分钟时间加入N-甲基吗啉(2.35g)，并将反应混合物在-10℃再搅拌10分钟。C)在-10℃用15分钟时间，将溶液A加到溶液B中，使混合物温度升至室温，并连续搅拌3小时。混合物冷却至0℃，用5分钟时间加入3-二甲基氨基丙胺(2.27g)并再连续搅拌5分钟。然后加入水(50ml)和乙酸乙酯，分出上层有机相，并依次用(a)水(50ml)，和饱和NaCl水溶液(5ml)、(b)KHCO3水溶液(5%、50ml)、(c)HCl水溶液(0.5N，50ml)和(d)水(3×50ml)洗涤。在温度保持30℃以下，在真空下，旋转蒸发除去溶剂。加入新鲜的乙酸乙酯(50ml)，然后蒸发除去，得到CBZ-L-Ala-L-Phe-O，N-二甲基羟肟酸酯。步骤d将CBZ-L-Ala-L-Phe-O，N-二甲基羟肟酸酯(27.8g)溶于无水THF(280ml)中并在N2气下冷却至-70℃。在-70℃，在N2气下用60分钟时间加入二异丁基铝的氢化物的THF(1M，372ml)溶液，并在-70℃再连续搅拌60分钟。在0℃，N2气中，在搅拌下，将反应物在饱和NaCl(400ml)和罗谢尔盐溶液(600ml)中急冷，然后将混合物温热至室温。加入乙酸乙酯(600ml)，过滤混合物并分离水相，用乙酸乙酯(200ml)萃取。合并的有机相用水(600ml)/饱和NaCl水溶液(400ml)(X3)洗涤。保持温度低于30℃，在真空下旋转蒸发去除溶剂。残留物从甲苯中重结晶，将固体在P2O5上真空干燥，得到CBZ-L-Ala-L-Phe醛。步骤eA)将CBZ-L-Ala-L-Phe醛(3g)溶于工业甲基化酒精(20ml)中。溶液加热到50℃，过滤除去不溶物。B)将氨基脲盐酸(1.3g)的水(10mo)溶液加到KHCO3(1.1g)的水(10ml)溶液中。C)将溶液B加到溶液A中，并在50℃将所得混合物搅拌2小时。加入乙酸乙酯(50ml)和水(100ml)，分离出水相并用乙酸乙酯(2×20ml)萃取，合并的有机相依次用(a)KHCO3水溶液(5%，50ml);(b)HCl水溶液(0.5N，50ml)和(c)水/饱和的NaCl水溶液(50ml/20ml×3)洗涤。保持温度低于30℃，在真空下旋转蒸发除去溶剂，得到CBZ-L-Ala-L-PheSc。步骤f将CBZ-L-Ala-L-PheSc(680mg)溶于甲醇(90ml)中，过滤除去不溶物。用N2清洗含有甲醇化的CBZ-L-Ala-L-PheSc溶液的装置，加入催化剂一含10%钯的活性炭(100mg)。将H2通入封闭系统75分钟。过滤除去催化剂并保持温度低于30℃，在真空下旋转蒸发除去甲醇。静止使残留物结晶，将固体在P2O5上真空干燥，得到L-丙氨酰基-L-苯丙氨酰基缩氨基脲(L-Ala-L-PheSc)。实施例2L-苯丙氨酰基-L-苯丙氨酰基缩氨基脲步骤a和b按实施例1的步骤a和b制备L-Phe-O，N-二甲基羟肟酸酯的三氟乙酸盐。步骤CA)在室温搅拌下，将L-Phe-O，N-二甲基羟肟酸酯的三氟乙酸盐(1.932g)溶于无水DMF(8ml)中。保持温度低于30℃，用5分钟时间加入N-甲基-吗啉(0.606g)，所得混合物冷却到0℃。B)在搅拌下将CBZ-L-Phe(1.794g)溶于无水THF(15ml)中并将混合物冷却到-10℃。在-10℃用5分钟时间加入异丁基氯甲酸酯(0.822g)，用10分钟时间加入N-甲基吗啉(0.606g)，在-10℃将反应混合物再搅拌10分钟。C)在-10℃用15分钟时间将溶液A加到溶液B中，然后使混合物的温度升至室温并连续搅拌3小时。将混合物冷却至0℃，用5分钟时间加入3-二甲基氨基丙胺(0.612g)，再连续搅拌5分钟。加入水(20ml)和乙酸乙酯(30ml)，分出有机相并依次用(a)KHCO3水溶液(5%，20ml)、(b)HCl水溶液(0.5N，20ml)和(c)水(2×30ml)洗涤。保持温度低于35℃，在真空下旋转蒸发除去溶剂，残留物从异丙醇中重结晶，得到CBZ-L-Phe-L-Phe-O，N-二甲基羟肟酸酯。步骤d将CBZ-L-Phe-L-Phe-O，N-二甲基羟肟酸酯。(4.89g)溶于无水THF(40ml)中。将氢化锂铝(0.493g)装入一干燥的烧瓶中，在N2气下加入无水THF(20ml)，并在冷却到-50℃以前在室温搅拌10分钟。在-50℃，N2气下，用10分钟时间加入羟肟酸酯的无水THF溶液，在0-5℃再连续搅拌20分钟。将反应混合物冷却到-50℃并在N2气下加入饱和的罗谢尔盐溶液(60ml)。使混合物温热至室温，加入HCl(浓，10ml)使水相pH值为3，过滤除去不溶物。加入乙酸乙酯(50ml)、分出有机相并依次用(a)水(50ml)、(b)KHCO3水溶液(5%，50ml)(c)HCl水溶液(0.5N，50ml)和(d)水(3×50ml)进行洗涤。保持温度低于30℃，在真空下旋转蒸发除去乙酸乙酯。残留物放置过夜，在P2O5上真空干燥，最后由甲苯中结晶而得到CBZ-L-Phe-L-Phe醛。步骤eA)在70℃将CBZ-L-Phe-L-Phe醛。(0.645g)溶于工业甲基化酒精(10ml)。B)将三水乙酸钠(0.224g)加到氨基脲盐酸(0.183g)的水(3ml)溶液中，加入工业甲基化酒精(2ml)并将混合物加温到60℃。C)将溶液A加到溶液B中，再用工业甲基化酒精(3ml)洗涤含A的烧瓶，并将洗液加到混合物中，混合物在60-70℃搅拌30分钟。将混合物慢慢冷却1小时，再在冰浴中放置1小时，最后在4℃放置过夜，过滤收集固体，用工业甲基化酒精∶水(4∶1，3ml)洗涤，在P2O5上真空干燥，得到CBZ-L-Phe-L-PheSc。步骤f在30℃将CBZ-L-Phe-L-PheSc(2.1g)溶于甲醇(315ml)中，过滤除去不溶物。用N2气清洗含有缩氨基脲的甲醇化溶液的容器，加入含10%钯的活性碳催化剂(0.35g)并向封闭体系通入H230分钟。过滤除去催化剂。保持温度低于30℃，在真空下，旋转蒸发去除溶剂。将残留物在P2O5上真空干燥，得到L-苯丙氨酰基-L-苯丙氨酰基缩氨基脲(L-Phe-L-PheSc)。实施例3L-苯基丙氨酰基-L-苯丙氨酰基甲氧基亚胺步骤a-d按实施例2，步骤a-d所述方法制备CBZ-L-phe-L-phe醛。步骤eA)在60-65℃，将CBZ-L-phe-L-phe醛(0.645g)溶于工业甲基化酒精(35ml)中，并过滤除去不溶物。B)在60℃，将三水乙酸钠(0.224g)加到甲氧基胺盐酸(0.138g)的水(25ml)溶液中。C)在60℃，将溶液B加到溶液A中，用水(10ml)洗涤含B的烧瓶，将洗液与混合物合并并在60℃加热半小时，然后在室温冷却2小时。过滤收集固体，用工业甲基化酒精∶水(1∶1，6ml)洗涤，并在P2O5上真空干燥，得到CBZ-L-phe-L-phe-甲氧基亚胺。步骤f将CBZ-L-phe-L-phe-甲氧基亚胺(550mg)溶于甲醇(300ml)，过滤除去不溶物。用N2洗涤含甲醇的甲氧基亚胺容器，然后加入10%钯的活性炭催化剂(100mg)。将H2通入密封容器，如有必要，再通入4.5小时。过滤除去催化剂，保持温度低于30℃，在真空下旋转蒸发除去溶剂，得到L-苯基-丙氨酰基-L-苯丙氨酰基-甲氧基亚胺(L-Phe-L-PheMo)。实施例4L-苯丙氨酰基-D-苯丙氨酰基缩氨基脲步骤aA)在室温将O，N-二甲基羟胺盐酸(3.891g)悬浮在无水DMF(40ml)中。温度保持在30℃以下，用5分钟时间加入N-甲基吗啉(4.032g)，然后将混合物搅拌冷却到0℃。B)将N-t-Boc-D-Phe(10.08克)溶解在无水THF(80ml)中，并冷却到-10℃。保持温度在-10℃，用5分钟时间将异丁基氯甲酸酯(5.47g)加到溶液中。保持温度低于-10℃，用10分钟时间加入N-甲基吗啉(4.032g)，再连续搅拌10分钟。C)在-10℃用15分钟时间将悬浮液A加到悬浮液B，使混合物加温到室温，搅拌3小时。然后将混合物冷却到0℃，用5分钟时间加入3-二甲基氨基丙胺(3.88g)，再连续搅拌5分钟。加入水(60ml)和乙酸乙酯(60ml)，分离有机相，并依次用(a)水(60ml)，(b)KHCO3水溶液(5%，60ml)，(c)HCl水溶液(0.5M，60ml)和(d)水(3×60ml)洗涤。保持温度低于30℃，在真空下，旋转蒸发除去溶剂，得到N-t-Boc-D-Phe-O，N-二甲基羟肟酸酯。步骤b将N-t-Boc-D-Phe-O，N-二甲基羟肟酸酯(11.3g)在冰上冷却，加入三氟乙酸(30ml)并在室温将混合物搅拌3小时。保持温度低于30℃，在真空下，旋转蒸发除去过量的三氟乙酸，在残留物中加入乙醚(100ml)以形成溶液。真空去除溶剂，重复步骤直到产生结晶，过滤收集固体，用乙醚洗涤，在P2O5上真空干燥，得到D-Phe-O，N-二甲基羟肟酸酯的三氟乙酸盐。步骤CA)在室温搅拌下，将D-Phe-O，N-二甲基羟肟酸酯的三氟乙酸盐(10.1g)溶于无水DMF(41ml)中。保持温度低于30℃，用5分钟时间加入N-甲基吗啉(3.155g)并将所得混合物冷却至0℃。B)搅拌下，将CBZ-L-Phe(9.4克)溶于无水THF(80ml)中，并将混合物冷却到-10℃。在-10℃用5分钟时间加入异丁基氯甲酸酯(4.307g)，用10分钟时间加入N-甲基吗啉(3.155g)，在-10℃反应混合物再搅拌10分钟。C)在-10℃用15分钟时间将溶液A加到溶液B中，然后使反应物温度升至室温并连续搅拌3小时。将混合物冷却到0℃，用5分钟时间加入3-二甲基氨基丙胺(3.20g)，再连续搅拌5分钟。然后加入水(60ml)和乙酸乙酯(60ml)，分离有机相，并依次用(a)水(60ml)和饱和NaCl水溶液(60ml)，(b)KHcO3水溶液(5%，60ml)，(c)HCl水溶液(0.5N，60ml)和(d)水(3×60ml)洗涤。保持温度低于30℃，在真空下旋转蒸发除去溶剂。加入新鲜乙酸乙酯，然后蒸发除去。残留物由异丙醇中重结晶，得到CBZ-L-Phe-D-Phe-O，N-二甲基羟肟酸酯。步骤d将二异丁基氢化铝的二氯甲烷溶液(1M，10ml)加到N2-清洗过的烧瓶中。加热烧瓶至50℃直到全部二氯甲烷都蒸发掉，将系统再用N2清洗。加入无水THF(10ml)，混合物冷却到-70℃。将CBZ-L-Phe-D-Phe-O，N-二甲基羟肟酸酯(0.978g)溶于无水THF(10ml)中，并在-70℃，用10分钟时间加到二异丁基氢化铝溶液中，在-70℃再连续搅拌10分钟。将反应混合物在-60℃时急冷至甲醇(30ml)和饱和罗谢尔盐溶液(30ml)中，使混合物加温至室温。加入水(50ml)和乙酸乙酯(50ml)，分离有机相，水相用乙酸乙酯(50ml)萃取。合并的有机相用水(2×200ml)洗涤并过滤。分离有机相，保持温度低于30℃，在真空下旋转蒸发除去溶剂。加入新鲜的乙酸乙酯，然后除去而得到CBZ-L-Phe-D-Phe醛。步骤eA)在60℃将CBZ-L-Phe-D-Phe醛(400mg)溶于工业甲基化酒精(10ml)中。B)在60℃将三水乙酸钠(0.298g)的水(3ml)溶液加到60℃的氨基脲盐酸(0.244g)的水(3ml)溶液中。C)合并溶液A和B，将所得混合物在4℃放置过夜以前在60℃时搅拌5小时。过滤收集固体，并在P2O5上真空干燥而得到CBZ-L-Phe-PheSc。步骤f将CBZ-L-Phe-D-PheSc(600mg)溶于甲醇(90ml)中，过滤除去不溶物。用N2清洗含有甲醇的缩氨基脲溶液的容器，加入10%钯的活性炭催化剂(100mg)，向密闭容器通入H22小时。过滤除去催化剂，保持温度低于30℃，在真空下旋转蒸发除去甲醇，得到L-苯基丙氨酰基-D-苯基丙氨酰基缩氨基脲(L-Phe-D-PheSc)。实施例5L-苯丙氨酰基-L-苯丙氨酰基肟步骤a-d按实施例2的步骤a-d所述方法制备CBZ-L-Phe-L-Phe醛。步骤eA)将上述所制备的CBZ-L-Phe-L-Phe醛(0.645g)在60-65℃下溶于工业甲基化酒精(35ml)中过滤溶液去除不溶物。B)在60℃将三水乙酸钠(0.224g)加到盐酸羟胺(0.114)的水(25ml)溶液中。C)将溶液B加到溶液A中，用水(10ml)洗涤盛B的容器，将洗液加入混合物，然后在60-65℃搅拌3/4小时后在4℃冷却2-3小时。滤去固体，用工业甲基化酒精/水(1∶1，5ml)洗涤，在P2O5上真空干燥，得到顺式和反式异构体CBZ-L-Phe-L-PheOx的混合物。步骤f将CBZ-L-Phe-L-PheOx(500mg)溶解在甲醇(130ml)，过滤除去不溶物。用N2清洗盛有甲醇的肟的容器，加入10%钯的活性炭催化剂(83mg)。向封闭容器通入H230分钟。过滤除去催化剂，保持温度低于30℃，在真空下旋转蒸发除去溶剂。用高真空泵进一步除溶剂，残留物在P2O5上真空干燥得到L-苯丙氨酰基-L-苯丙氨酰基肟(L-Phe-L-Phe-Ox)。实施例6L-丙氨酰基-D-苯丙氨酰基缩氨基脲步骤a和b按实施例4的步骤a和b的方法制备D-Phe-O，N-二甲基羟肟酸酯的三氟乙酸盐。步骤CA)将D-Phe-O，N-二甲基羟肟酸酯的三氟乙酸盐(5，000g)溶于无水THF(20ml)中。保持温度低于30℃慢慢加入N-甲基吗啉(1.578g)，并将所得混合物冷却至0℃。B)在搅拌下，将CBZ-L-Ala(3，463g)溶解在无水THF(40ml)中，混合物冷却至-10℃。在-10℃用5分钟时间，加入异丁基氯甲酸酯(2，158g)，用10分钟时间加N-甲基吗啉(1，578g)，将反应混合物在-10℃再搅拌10分钟。C)将两种溶液A和B，在-10℃，用10分钟时间混合，然后将混合物的温度升至室温，连续搅拌3小时。混合物冷却至0℃，加入3-二甲基氨基丙胺(1，585g)，反应物用水(50ml)急冷。加入乙酸乙酯(50ml)，分离有机相，水相用乙酸乙酯萃取(2×30ml)。合并有机相，依次用(a)水(50ml)和饱和NaCl水溶液(10ml)，(b)KHCO3水溶液(5%，50ml)、(c)HCl水溶液(0.5N，50ml)和(d)水(3×50ml)洗涤。保持温度低于30℃，真空下，旋转蒸发除去溶剂。固体由乙酸乙酯重结晶，得到CBZ-L-Ala-D-Phe-O，N-二甲基羟肟酸酯。步骤d将CBZ-L-Ala-D-Phe-O，N-二甲基羟肟酸酯(2.9克)溶于无水THF(25ml)中。在氮气下将溶液冷却至-70℃。在-70℃，用10分钟时间加入二异丁基氢化铝的THF溶液(1M，37ml)，并再连续搅拌10分钟。在-30℃，N2清洗的条件下，将反应物在搅拌下急冷到饱和的罗谢尔盐溶液(125ml)和THF(125ml)中，然后将混合物加温至室温。加入乙酸乙酯(100ml)，分离有机相。用乙酸乙酯(2×30ml)萃取水相，合并有机相并用水(3×100ml)洗涤。过滤反应混合物，保持温度低于30℃，在真空下，旋转蒸发除去溶剂。加入新鲜乙酸乙酯，然后除去而得到CBZ-L-Ala-D-Phe醛。步骤eA)将CBZ-L-Ala-D-Phe醛(1.2g)溶于THF(20ml)和工业甲基化酒精(20ml)中并加热至50℃。B)将热的氨基脲盐酸(1.8g)的水(15ml)溶液加到热的KHCO3(1.5g)的水(15ml)溶液中。C)将溶液B加到溶液A中，所得混合物在50℃搅拌4小时。保持温度低于30℃，在真空下旋转蒸发除去溶剂。在残留物中加入水(50ml)，过滤收集固体，用水工业甲基化酒精(1∶1)洗涤，在P2O5上真空干燥，得到CBZ-L-Ala-D-PheSc。步骤f将CBZ-L-Ala-D-PheSc(750mg)溶于甲醇(50ml)中，过滤除去不纯物。用N2清洗盛甲醇溶液的容器，加入10%钯的活性炭(100mg)催化剂。向封闭系统通入H290分钟。过滤除去催化剂，保持温度低于30℃，在真空下，旋转蒸发除去溶剂，在P2O5上真空干燥，得到L-丙氨酰基-D-苯丙氨酰基缩氨基脲(L-Ala-D-PheSc)。实施例7L-酪氨酰基-L-苯丙氨酰基缩氨基脲步骤a和b按实施例4的步骤a和b的方法制备L-Phe-O，N-二甲基羟肟酸酯的三氟乙酸盐。步骤cA)在室温搅拌下，将L-Phe-O，N-二甲基羟肟酸酯的三氟乙酸盐(7.95g)溶于无水DMF(30ml)中。保持温度低于30℃，用5分钟时间加入N-甲基吗啉(2.49克)，所得混合物冷却至0℃。B)在搅拌下，将CBZ-OBZ-L-Tyr(10g)溶解在无水DMF(60ml)中，混合物冷却至-10℃。在-10℃，用5分钟时间加入异丁基氯甲酸酯(3.39g)。用10分钟时间加入N-二甲基吗啉(2.49克)，将反应混合物在-10℃再搅拌10分钟。c)在-10℃，用15分钟时间将溶液A加到溶液B中，然后将混合物温度升至室温，并连续搅拌3小时。混合物冷却至0℃，用5分钟时间加入3-二甲基氨基丙胺(2.52g)。然后加入水(50ml)和乙酸乙酯(50ml)，分离上层有机相，并依次用(a)水(50ml)，(b)KHCO3水溶液(5%，50ml)，(c)HCl水溶液(0.5M，50ml)和(d)水(3×50ml)洗涤。保持温度低于30℃，真空下旋转蒸发除去溶剂。残留物由异丙醇中重结晶，得到CBZ-OBZ-L-Tyr-L-Phe-O，N-二甲基羟肟酸酯。步骤d将CBZ-OBZ-L-tyr-L-Phe-O，N二甲基羟肟酸酯(1.012g)溶于无水THF(10ml)中。在-70℃，N2的条件下用10分钟时间加入二异丁基氢化铝的THF溶液(1M，8.5ml)，再连续搅拌10分钟。在-60℃N2下，将反应物搅拌急冷到甲醇(20ml)和罗谢尔盐溶液(30ml)中，然后使混合物加温至室温。加入水(50ml)和乙酸乙酯(50ml)，分离有机相并用水(200ml)洗涤。过滤反应混合物，保持温度低于30℃，在真空下，旋转蒸发除去溶剂，然后加入新鲜乙酸乙酯，旋转蒸发除去，在P2O5上真空干燥所得固体，得到CBZ-OBZ-L-Tyr-L-Phe醛。步骤eA)将CBZ-OBZ-L-Tyr-L-Phe醛(400mg)溶于工业甲基化酒精(20ml)和THF(10ml)中，并加热至60℃。B)将氨基脲盐酸(600mg)在水(5ml)中的热溶液加到KHCO3(500mg)在水(5ml)中的热溶液中。C)将溶液B加到溶液A中，在60℃将所得混合物搅拌2小时。保持温度低于30℃，在真空下旋转蒸发除去溶剂，残渣用水急冷。过滤收集固体，用水和工业甲基化酒精洗涤，在P2O5上真空干燥，得到CBZ-OBZ-L-Tyr-L-PheSc。步骤f将CBZ-OBZ-L-Tyr-L-PheSc(770mg)溶于无水THF(70ml)中，过滤并将甲醇(20ml)加入滤液中。用N2清洗盛缩氨基脲的容器，加入10%钯的活性炭催化剂(100mg)。在封闭系统中通入H2几小时。过滤除去催化剂，蒸发除去溶剂，得到L-酪氨酰基-L-苯丙氨酰基缩氨基脲(L-Tyr-L-PheSc)。实施例8L-丙氨酰基-L-环己基丙氨酰基缩氨基脲步骤aA)搅拌下，将O，N-二甲基羟胺盐酸(8.51g)加到无水DMF(75ml)中，保持温度低于30℃用5分钟时间加入N-甲基吗啉(8.8g)。产生一种白色沉淀，将混合物冷却至0℃。B)将N-t-Boc-L-Cha(22.5g)溶于无水THF(200ml)中并冷却至-10℃。保持温度在-10℃，用5分钟时间加入异丁基氯甲酸酯(11.94g)。保持温度在-10℃，用10分钟时间加入N-甲基吗啉(8.8g)并再连续搅拌10分钟。C)在-10℃用15分钟时间将悬浮液A加到悬浮液B中，使混合物加温至室温并搅拌4小时。将混合物冷却到0℃，用5分钟时间加入3-二甲基氨基丙胺(8.6g)，再连续搅拌5分钟。加入水(200ml)和乙酸乙酯(100ml)，分离水相，用乙酸乙酯(2×100ml)萃取。合并的有机相依次用(a)水(100ml)和饱和NaCl水溶液(20ml)、(b)KHCO3水溶液(5%，100ml)，(c)HCl水溶液(0.5N，100ml)和(d)水(3×100ml)洗涤。保持温度低于30℃，在真空下旋转蒸发除去溶剂，得到N-t-Boc-L-Cha-O，N-二甲基羟肟酸酯。步骤b在0℃下将N-t-Boc-L-Cha-O，N-二甲基羟肟酸酯(26g)和三氟乙酸(65ml)搅拌5分钟，然后使混合物的温度升至室温，连续搅拌3小时。保持温度低于30℃，真空下旋转蒸发除去过量的三氟乙酸。将乙醚加入残留物以生成溶液，真空下除去乙醚。重复用醚处理以得到黄色油状的L-Cha-O，N-二甲基羟肟酸酯的三氟乙酸盐。步骤ca)将L-Cha-O，N-二甲基羟肟酸酯的三氟乙酸盐(17g)溶于无水THF(50ml)中。保持温度低于30℃，用5分钟时间加入N-甲基吗啉(3.95g)，将混合物冷却至0℃。B)搅拌下将CBZ-L-Ala(9.25g)溶于无水THF(100ml)中，将混合物冷却到-10℃。在-10℃，用5分钟时间加入异丁基氯甲酸酯(5.35g)，用10分钟时间加入N-甲基吗啉(3.95g)，反应混合物在-10℃再搅拌10分钟。C)在-10℃用15分钟时间将溶液A加到溶液B，然后使混合物温度升至室温，连续搅拌3小时。将混合物冷却到0℃，用5分钟时间加入3-二甲基氨基丙胺(3.98g)并再连续搅拌5分钟。然后加入水(150ml)和乙酸乙酯(150ml)，分离水相并用乙酸乙酯(2×75ml)萃取。合并的有机相依次用(a)水(125ml)、(b)KHCO3水溶液(5%、125ml)，(c)HCl水溶液(0.5N，125ml)和(d)水(3×125ml)洗涤。保持温度低于30℃，旋转蒸发除去溶剂。加入新鲜乙酸乙酯并蒸发除去，得到CBZ-L-Ala-L-Cha-O，N-二甲基羟肟酸酯。步骤d将CBZ-L-Ala-L-Cha-O，N-二甲基羟肟酸酯(7.22g)溶于无水THF(160ml)中并在N2下冷却到-70℃。在-70℃，N2条件下，用20分钟加入二异丁基氢化铝的THF溶液(1M，86ml)，再连续搅拌20分钟。在0℃，N2条件下将反应物搅拌急冷到罗谢尔盐溶液(400ml)中，然后使混合物加温至室温。加入乙酸乙酯(150ml)，搅拌混合物5分钟。过滤反应混合物，分离有机相并用乙酸乙酯(2×50ml)萃取水相。合并的有机相用水(3×200ml)洗涤，并在最后的洗液中加入饱和NaCl溶液。保持温度低于30℃旋转蒸发除去溶剂，得到油状的CBZ-L-Ala-L-Cha醛。步骤eA)将CBZ-L-Ala-L-Cha醛(8g)溶于工业甲基化酒精(50ml)并加热至50℃。B)将氨基脲盐酸(3.0g)在水(25ml)中的热溶液加到KHCO3(2.67g)在水(25ml)中的热溶液中。C)将溶液B加到溶液A中，在50℃搅拌所得混合物3小时。使混合物冷却并在4℃放置过夜。保持温度低于30℃，旋转蒸发除去大部分工业甲基化酒精，在残留物中加入乙酸乙酯(50ml)。分离有机相，并依次用(a)水(30ml)、(b)KHCO3水溶液(5%，30ml)，(c)HCl水溶液(0.5N，30ml)和(d)水(2×50ml)，如有必要加入饱和NaCl水溶液以助分离。保持温度低于30℃旋转蒸发除去溶剂，固体由异丙醇和乙醚中重结晶，得到CBZ-L-Ala-L-ChaSc。步骤f将CBZ-L-Ala-L-ChaSc(900mg)溶于甲醇(30ml)，在N2条件下，加入10%钯的活性炭催化剂(100mg)。在封闭系统中通入H26小时，过滤除去催化剂。保持温度低于30℃旋转蒸发除去溶剂。固体用乙醚洗涤并在P2O5上真空干燥，得到L-丙氨酰基-L-环己基丙氨酰基缩氨基脲。实施例9L-丙氨酰基-L-亮氨酰基缩氨基脲步骤aA)在室温，搅拌下，将O，N-二甲基羟胺盐酸(9.17克)溶于无水DMF(110ml)中。保持温度低于30℃，用5分钟时间加入N-甲基吗啉(9.51g)。产生沉淀，将混合物冷却至0℃。B)将N-t-Boc-L-Leu(23.3g)溶于无水THF(220ml)并冷却到-10℃。保持温度在-10℃，用5分钟时间加入异丁基氯甲酸酯(12.90g)。保持温度在-10℃，用10分钟时间加入N-甲基吗啉(9.51g)并再连续搅拌10分钟。C)在-10℃用15分钟时间，将悬浮液A加到悬浮液B中。使混合物加温至室温并搅拌3小时。将混合物冷却到0℃，并用5分钟时间加入3-二甲基氨基丙胺(9.13g)，再搅拌5分钟。加入乙酸乙酯(110ml)和水(110ml)，分离有机相并依次用(a)水(2×100ml)、(b)KHCO3水溶液(5%，100ml)、(c)HCl水溶液(0.5N，100ml)和(d)水(3×100ml)洗涤。保持温度低于30℃，旋转蒸发除去溶剂，得到N-t-Boc-L-Leu-O，N-二甲基羟肟酸酯。步骤b将N-t-Boc-L-Leu-O，N-二甲基羟肟酸酯(23.4g)和三氟乙酸(165ml，冷却至0℃)在室温一起搅拌18小时。保持温度低于30℃旋转蒸发除去过量的三氟乙酸。在残留物中加入乙醚以生成溶液，然而真空下除去醚。重复这步骤直到在4℃产生结晶，得到L-Leu-O，N-二甲基羟肟酸酯的三氟乙酸盐。步骤CA)在室温，搅拌下，将L-Leu-O，N-二甲基羟肟酸酯的三氟乙酸盐(1.8g)溶于无水THF(10ml)中。将混合物冷却至0℃并用5分钟时间加入N-甲基吗啉(0.635g)。B)将CBZ-L-Ala(1.40g)溶于无水THF(20ml)中并冷却到-10℃。在-10℃用5分钟时间加入异丁基氯甲酸酯(0.869g)，用10分钟时间加入N-甲基吗啉(0.635g)，在-10℃再搅拌反应混合物10分钟。C)在-10℃用15分钟时间，将溶液A加到溶液B，然后使混合物温度升至室温，并连续搅拌18小时。将混合物冷却至0℃，加入3-二甲基氨基丙胺(0.64g)，然后将反应混合物用水(25ml)和乙酸乙酯(25ml)骤冷。分离水相，用乙酸乙酯(2×25ml)萃取。合并的有机相依次用(a)水(50ml)和饱和NaCl(助分离)、(b)KHCO3水溶液(5%，30ml)，(c)HCl水溶液(0.5N，30ml)和(d)水(3×30ml)洗涤。保持温度低于30℃，旋转蒸发除去溶剂，固体在P2O5上真空干燥，得到CBZ-L-Ala-L-Leu-O，N-二甲基羟肟酸酯。步骤d将CBZ-L-Ala-L-Leu-O，N-二甲基羟肟酸酯(1.9g)溶于无水THF(40ml)并在N2下冷却到-70℃。在-70℃，N2条件下用10分钟时间加入二异丁基氢化铝的THF溶液(1M，29.5ml)，再连续搅拌10分钟。在-60℃N2条件下，将反应混合物搅拌骤冷到甲醇(50ml)和罗谢尔盐溶液(50ml)中，加入水(50ml)和乙酸乙酯(50ml)，过滤混合物，分离水相，并用乙酸乙酯(2×50ml)萃取。合并的有机相用水(3×100ml)和助分离的饱和NaCl水溶液洗涤。保持温度低于30℃，旋转蒸发除去溶剂，加入新鲜的乙酸乙酯，然后旋转蒸发除去，得到CBZ-L-Ala-L-Leu醛。步骤eA)将CBZ-L-Ala-L-Leu醛(6.7g)溶于工业甲基化酒精(50ml)中，并加热至50℃。B)将KHCO3(9g)在水(30ml)中的热溶液加到氨基脲盐酸(10.8g)在水(30ml)中的热溶液中。C)将溶液B加到溶液A中，在50℃将混合物搅拌3小时，并在室温放置过夜。滤出固体，用工业甲基化酒精∶水(1∶1，20ml)洗涤。在P2O5上真空干燥，得到CBZ-L-Ala-L-LeuSc。步骤f将CBZ-L-Ala-L-LeuSc(950mg)溶于甲醇(100ml)中，过滤除去不溶物，再加入甲醇(50ml)并用N2清洗容器。在N2条件下加入10%钯的活性炭催化剂(100mg)，然后在封闭容器中通入H2135分钟。过滤除去催化剂，保持温度低于30℃放置蒸发除去溶剂。在P2O5上真空干燥固体，得到L-丙氨酰基-L-亮氨酰基缩氨基脲(L-Ala-L-LeuSc)。实施例10直接亲合色谱基质-ECH-Sepharose4B-L-Ala-PheSc活性位点的制备将ECH-SepharoseR4B(3g湿重)在烧结玻璃滤器上用NaCl水溶液(0.5M，240ml)洗涤，再用水(120ml)洗涤。将N-乙基-N′-(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸(EDC)溶于水中，得到0.1MEDC溶液，通过加入盐酸或固体乙酸钠将EDC溶液的pH值稳定到pH4.5。将按实施例1制备的L-Ala-L-PheSc(10mg)溶于甲醇(400μl)中，并与EDC水溶液(0.1M，2.4ml)一起加到洗涤过的凝胶中。在20℃慢慢搅动混合物1小时，如有需要，再将pH值调到pH4.5，在20℃连续搅动23小时。然后加入L-甘氨酸使最终浓度为1M，再连续搅动3小时。亲合色谱凝胶依次用甲醇水溶液(50%，60ml)、水(60ml)和使用缓冲液(60ml)洗涤并在4℃贮存到需要时。实施例11-18亲合色谱基质的制备将按实施例2-9所描述的方法而制备的各种二肽衍生物偶合到类似于实施例10所述的凝胶基体上，分别得到实施例11到18的亲合色谱凝胶。实施例19亲合色谱将从英国Powell&Scholefield得到的，在“使用”缓冲液(磷酸钠(50mM);EDTA(1mM);乙二醇(33%)，pH6.8)和二硫苏糖醇(2mM)或半胱氨酸(4mM)(1.5ml)中的喷雾干燥番木瓜胶乳(0.03g蛋白质)加到实施例10-18的亲合色谱基质的每个1ml柱上。至少使用以下五种不同洗脱液中的一种洗脱液A在pH4.5，含有柠檬酸钠(50mM)和EDTA(1mM)，的乙二醇水溶液(33%)中的羟基乙基二硫化物(100mM);洗脱前，将柱平衡过夜。洗脱液B＝在含有柠檬酸钠(50mM)和EDTA(1mM)，pH4.5的乙二醇水溶液(33%)中的2，2′-二吡啶二硫化物(30mM);洗脱前，将柱平衡过夜。洗脱液C＝在含有柠檬酸钠(50mM)和EDTA(1mM)，pH4.5的乙二醇水溶液(33%)中的甲基吡啶二硫化物(30mM);洗脱前，将柱平衡过夜。洗脱液D＝在含有氢氧化钠(50mM)和EDTA(25mM)，用乙酸调到pH4.5的乙二醇水溶液(33%)中的汞撒利酸(10mM);连续洗脱。洗脱液E＝在含有乙酸钠(50mM，pH4.5的乙二醇水溶液(33%)中的HgCl2(10mM)，连续洗脱。通过在标准MonoS(pharmacia)色谱后检测洗脱材料中A280痕量来确定每种洗脱液的洗脱能力。结果综述于下表1表1木瓜凝乳蛋白酶的结合和洗脱+结合并洗脱的木瓜凝乳蛋白酶-不结合和/或不洗脱的木瓜凝乳蛋白酶ND未测定实施例20木瓜凝乳蛋白酶的纯化(ⅰ)将由英国Powell&Scholefield得到的市售番木瓜的喷雾干燥胶乳(1g)与蒸馏水(5ml)搅拌1小时，在4℃以9000xg速率离心30分钟除去不溶物。去掉沉淀，用20分钟时间以盐酸(1M)调节上层清液的pH值到1.8。在4℃连续搅拌60分钟，如有必要，再将pH值调到1.8。(ⅱ)在4℃以9000xg的速率离心混合物30分钟，去掉沉淀。(ⅲ)(a)用10分钟时间滴加NaOH(5M)将上清液的pH值调到6.8。在溶液中呈现红紫-兰色。(b)将所得红紫-兰色溶液对10体积的“使用”缓冲液(磷酸钠(50mM);EDTA(1mM);乙二醇(33%，pH6.8)彻底渗析，更换3次缓冲液。将渗析液以4000xg的速率离心10分钟，将含木瓜凝乳蛋白酶滗析的上层清液中的蛋白含量调到约30mg/ml。通过加入半胱氨酸至最终浓度为4mM以活化木瓜凝乳蛋白酶溶液，并在0℃放置15分钟。(ⅳ)将活化的木瓜凝乳蛋白酶溶液，加到偶合到L-Ala-L-PheSc的ECH-SepharoseR的8ml柱(按实施例10所述制备)上，该柱予先以使用缓冲液，按36ml/cm2/hr的流速平衡过。柱依次用使用缓冲液(2柱床体积)、柠檬酸钠(50mM)的乙二醇(33%)水溶液pH4.5(2-柱床体积)和乙酸钠水溶液(50mM)、EDTA(25mM)、汞撒利(10mM)的乙二醇(33%)水溶液，pH4.5(2柱床体积)洗涤，然后在室温保温2小时。(ⅴ)用含汞撒利(10mM)的乙酸钠(50mM)水溶液(3柱床体积)洗脱木瓜凝乳蛋白酶，并收集馏分(4ml)。对洗脱馏份中的酶活性按上述测定其对BAPNA的比活性。合并活性馏份，并通过在Mono-SHRR10/10(Pharmacia)柱上的阳离子交换色谱，使用“起始”磷酸盐缓冲液(Na+(50mM)、EDTA(1mM)、NaN3(0.01%)、pH7.2)和“极限”磷酸盐缓冲液(Na+(800mM)、EDTA(1mM)NaN3(0.01%)pH7.2)进一步纯化。用2.7mM/ml的盐梯度和2ml/min的流速进行洗脱。收集馏份(4ml)，通过测量在280nm的吸收度而确定蛋白浓度以及通过BAPNA水解测定酶活性。合并含木瓜凝乳蛋白酶的馏份，并对蒸馏水和去离子水或EDTA水溶液(1mM)进行彻底渗析并冷冻干燥以贮存。实施例21木瓜凝乳蛋白酶的纯化-BAPNA测定结果ⅰ)将由英国Powell&Scholefield得到的市售番木瓜喷雾干燥乳胶(1g)在20℃在水(5ml)中搅拌60分钟。在4℃，以9000xg速率离心30分钟除去不溶物。去掉沉淀，用20分钟时间滴加盐酸(1M)将上清液的pH值调到1.8。在4℃搅拌混合物15分钟，5分钟后检测pH值，如有必要，重新调节。ⅱ)在4℃以9000xg的速率离心30分钟以除去沉淀。ⅲ)a)搅拌下滴加氧氢化钠水溶液(5M)将上清液调到pH7.0。在4℃以9000xg的速率离心30分钟以除去沉淀。b)将所得上清液加到MonoSHR10/10(Pharmacia)的阳离子交换柱上，该交换柱已用含EDTA(1mM)，的pH7.2的Na2HPO4/NaHPO4(50mMNa+)水溶液(缓冲液A)予平衡过。样品使用后，用缓冲液A淋洗(2ml/min)交换柱，直到A280回到零。然后将梯度(2.7mMNa+/ml)到Na2HPO4/NaH2PO4(0.80MNa+)的溶液加到柱上，收集4ml馏分。测定馏份中对BAPNA的活性。按免疫法测定，大的木瓜凝乳蛋白酶的峰是在0.17-0.28MNa+之间洗脱。合并在这范围的对BAPNA的活性馏份，并加入乙二醇到33%(v/v)。全部其它的馏份，包括在以后的洗脱(0.47-0.59Na+)的木瓜蛋白酶Ⅲ峰在内的对BAPNA活性的馏份都弃去。(ⅳ)将偶合到L-Ala-L-Phe-Sc的ECH-SepharoseR的柱(按实施例10所述制备)(15ml柱床体积)用pH6.8，含EDTA(1mM)的NaH2PO4/Na2HPO4(50mMNa+)的乙二醇(33%v/v)水溶液(使用缓冲液)洗涤(39ml/hr/cm2)。通过加入半胱氨酸基(最终浓度4mM)活化木瓜凝乳蛋白酶(如上)，在0℃放置15分钟。然后加到柱上接着加入60ml使用缓冲液。ⅴ.然后加入pH4.5，含HgCl(10mM)的乙酸钠(50mM)缓冲液(45ml)。收集全部5ml的馏份。分析馏份中对BAPNA的活性。合并被柱滞留并通过含HgCl2缓冲液洗脱的含活性峰的馏份并再加到MonoS柱上。用缓冲液A洗涤柱，然后用7柱床体积的含半胱氨酸基(4mM)的缓冲液A加到柱上。停止流动30公钟以使汞由酶中置换。然后再开始流动，在使用上述达NaH2PO4/Na2HPO4(0.80MNa+)的梯度以前，柱子再用缓冲液A洗涤。合并对BAPNA活性的馏份，加入半胱氨酸基(最终浓度为4mM)，合并液在0℃放置15分钟。将Chelex树脂(BioRad，UK0.5g)装入柱中，用缓冲液A洗涤。含木瓜凝乳蛋白酶的合并液流经Chelex柱，然后彻底渗析入EDTA(1mM)水溶液中并冷冻干燥。木瓜凝乳蛋白酶的纯化过程综述于表2表2木瓜凝乳蛋白酶的纯化表2木瓜凝乳蛋白酶的纯化<蛋白(mg)BAPNA活性＊(单位)BAPNA比活性＊(单位mg-1)产额x(%)纯化(倍数)喷雾干燥胶乳酸处理阳离子交换色谱Sepharose-L-Ala-L-PheSc阳离子交换色谱Chelex4413615827.51110.5493,712238,636133,748112,47544,68743,3011,1206612,3064,0904,0624,1241004827239910.592.063.653.633.68</table></tables>x产率是按对BAPNA的活性(也是对木瓜蛋白酶和番木瓜蛋白酶Ⅲ的基质)＊BAPNA测定方法2实施例22木瓜凝乳蛋白酶的制备-在免体内培养的特异IgG抗体按实施例21所述制备的纯木瓜凝乳蛋白酶，在用前，按Zucker等(1985，同上文)所述方法慢慢地进行羧甲基化。在兔体内培养对木瓜凝乳蛋白酶的抗血清，通过肌肉注射360μ完全助剂中的羧甲基化蛋白，二周后，皮下注射在不完全助100μg蛋白。按Heide和Schwick(1978，同上文)所述的酸铵分馏将IgG由血清中部分纯化。接着渗析到含NaCl(0.14M)，pH7.3的磷酸钠水溶液(10mM)中。实施例23木瓜凝乳蛋白酶的纯化和木瓜凝乳蛋白酶和PPⅣ的免疫定量(ⅰ-ⅲ)按实施例21(ⅰ-ⅲa)中所述，将由英国Powell&Scholefield得到的市售番木瓜喷雾干燥胶乳进行制备并将pH值调到1.8。(ⅳ)将偶合到L-Ala-L-PheSc的ECH-SepharoseR的柱(15ml柱床体积)(按实施例10所述制备)按实施例21(ⅳ)进行洗涤。由pH1.8处理的最后上清液渗析入含有EDTA(1mM)的在乙二醇(33%v/v)中的NaH2PO4/Na2HPO4(50mMNa+)的水溶液(pH＝6.8)(使用缓冲液)中，以4000xg的速率离心10分钟，加入二硫苏糖醇(最终浓度为2mM)在20℃下活化上层清液20分钟。然后加到亲合柱(39ml/hr/cm2)，接着加入60ml使用缓冲液。将含有EDTA(1mM)和甲基吡啶二硫化物(30mM)的，pH4.5的柠檬酸钠缓冲液(50mM，15ml)(按Salih等人在BiochemJ.(1987)，247，181-193所述制备)加到柱上。停止流动，将含有二硫化物的缓冲液在20°下在柱上放置过夜(18小时)。(ⅴ)随着加入45ml的含甲基吡啶二硫化物的相同缓冲液，再开始流动，接着加入30ml使用缓冲液。收集全部馏份(5ml)。测定馏份中对BAPNA的活性。合并被柱滞留并在含甲基吡啶二硫化物的缓冲液洗脱的含活性峰的馏份，并将它加到(40ml/hr/cm2)SephadexRLH-20(Pharmacia)柱(80ml柱床体积)上，该柱已用EDTA(1mM)在乙二醇(33%v/v)中的水溶液平衡过。使用300ml这种缓冲液继续进行色谱分析。通过△A271监测馏份(8ml)并测定对BAPNA的活性。合并含有对BAPNA的活性峰的馏份(接着有另一个A271峰)并加到MonoSHR10/10阳离子交换柱上，并按实施例21中的ⅲb所述进行。合并对BAPNA的活性馏份。将喷雾干燥胶乳和从pH1.8处理，亲合色谱和阳离子交换色谱中回收的材料，通过上文所述的单一散射免疫扩散法分析存在的PPⅣ量。使用同样的方法定量木瓜凝乳蛋白酶，它是使用实施例22所述的方法制备的在兔体内培养的木瓜凝乳蛋白酶的单一特异抗体。使用本文所述方法纯化，并通过单一散射免疫扩散表明没有PPⅣ和PPⅢ的木瓜凝乳蛋白酶绘制木瓜凝乳蛋白酶的标准曲线。结果示于表3中。表3木瓜凝乳蛋白酶的纯化和木瓜凝乳蛋白酶和PPⅣ的定量表3木瓜凝乳蛋白酶的纯化和木瓜凝乳蛋白酶和PPⅣ的定量蛋白(mg)BAPNA比活性＊(单位mg-1)木瓜凝乳蛋白酶(mg)PPIV(总蛋白量的％)喷雾干燥胶乳酸处理Sepharose-L-Ala-L-PheSC阳离子交换色层柱46815724151,0001,4334,0003,53314492281418.7<0.1++</table></tables>+＝未检出＊BAPNA测定方法2实施例24木瓜凝乳蛋白酶的变应性研究由美国3MDiagnosticSystems购得40个人体血清样品。这些样品已经过公知称为Chymofast的商用测试，测定其对商用木瓜凝乳蛋白酶，ChymodiactinR的IgE。其中20个样品定为Chymofast阳性而另外20个为阴性。40个样品是“盲目”取来的，利用生物素-抗生素蛋白体系，采用改性固相连接酶的免疫吸着测定法(ELISA)，进一步测试其对ChymodiactinR、PPⅢ、PPⅣ和对纯化木瓜凝乳蛋白酶(按本文所述方法纯化并通过单一免疫扩散表明没有PPⅣ和PPⅢ)的天然获得的IgE抗体，过程综述如下微滴定板用以下涂层试验抗原↓试验血清↓单克隆抗人体的IgE↓生物素化的兔的抗-鼠Ig，↓抗生物素蛋白-过氧化酶络合物↓培养基(ABTS)↓停止并测量A410在有效期(expiry)内使用ChymodiactinR，PPⅣ是按本文所述纯化而PPⅢ是按Buttle和Barrett(1984，同上文)纯化的。全部抗原在使用前，按Buttle和Barrett(1984，同上文)所述用碘乙酸(10mM)适度羧甲基化而使之失活。通过用100μl在碳酸钠缓冲液(0.05M，pH9.6)中的试验抗原(10μg/ml)保温微滴板中的每个孔而使微滴板的孔以试验抗原涂层。然后在其后的步骤中使用马血清供体(Donorhorseserum)(4%)以降低非特定的结合。将试验血清(稀释至1/20)在PBS(0.1%Tween，2%马血清，10mMEDTA，50μg/ml肝素;pH7.2)(100μl/孔)中，在37℃保温4小时，接着用单克隆抗人体的IgE(按Kemeny&Richards在J.Immunol.Methods(1988)，108，105中所述制备的-1μg/ml，100μl/孔)在37℃下保温3小时;然后和生物素化的兔抗鼠免疫球蛋白(由丹麦Dakopatts得到，1μg/ml，100μl/孔)在室温，保温过夜。和抗生物素蛋白-过氧化酶(10μl/ml，100μl/孔)在37℃将孔保温30分钟，加入在缓冲液(100mM柠檬酸，200mMNa2HPO4，pH4.2，用1μl/mlH2O2活化)中的基质[2，2′-连氮基双(3-乙基苯噻唑磺酸)〕并将孔在室温保温30分钟。通过加入100μl/孔的100mM柠檬酸0.01%NaN3而停止反应，使用MicroELISA读数机(Dynatech)测定每个孔在410nm的吸收度。在0.075-4.8ng/ml(2.4ngIgE＝1国际单位IgE)IgE范围内测定IgE标准。使用Enzfitter程序(Leatherbarrow，R.J.1985，EnzfitterforIBM.PC，Elsevier-Biosoft，68HillsRoad，CambridgeCB21LA，英国)计算直接对四种抗原制剂中每一种的IgE浓度，这四种抗原是ChymodiactinR、PPⅢ、PPⅣ和按实施例23所述制备的木瓜凝乳蛋白酶。所测试的40个血清样品中有26个含有抗ChymodiactinR的IgE抗体，由对ChymodiactinR最活性的12个样品，得到的对PPⅢ、PPⅣ和木瓜蛋白酶的值示于下面表4中。平均值和标准误差值都是由9个测定中得到的。可以看到，含抗Chymodiactin抗体的12个血清样品中，只有2个抗木瓜蛋白酶有主要的IgE响应，而对PPⅢ和PPⅣ的抗体估计约为检出的有关IgE的75%。表4在含有对chymodiactinR的IgE抗体的血清样品中的特异IgE浓度(IU/ml)实施例25木瓜凝乳蛋白酶和PPⅣ的混合物对鸡胱素的抑制按实施例23所述纯化木瓜凝乳蛋白酶并用BAPNA作基质，通过以E-64的活性位点滴定而进行标定(Zucker等人，1985，Biochem.Biophys.Acta，828，196-204)按上述提纯的PPⅣ也用E-64滴定，为适应这方法而使用偶氮酪蛋白作基质。按Anastasi等人所述(1983，Biochem.J.211，129-138)纯化鸡胱素型2并且用木瓜蛋白酶滴定来标定，该木瓜蛋白酶已先用E-64滴定过。按Rowan等人(1988，同上文)的方法进行偶氮酪蛋白水解的测定，除了在加入基质以前，在40℃予保温酶15分钟并加入抑制剂以外，其它都相同。取两套9个试管，在每个试管中加入125μl含有4mMEDTA和16mM半胱氨基，pH6.8的0.4M磷酸钠缓冲液。加入木瓜凝乳蛋白酶和PPⅣ，改变其比率，使其最后的蛋白酶浓度为100nM。在一套试管中加入鸡胱素到1μM最终浓度，而在另一套中加入同样体积的水。然后予保温试管并测定偶氮酪蛋白的水解活性。酶混合物对鸡胱素在偶氮酪蛋白水解的影响是通过在没有鸡胱素存在时，同样酶混合物所产生的活性抑制百分数来表示，结果示于表5。表5木瓜凝乳蛋白酶和PPⅣ混合物对鸡胱素的抑制百分率可以看出，鸡胱素的抑制程度与PPⅣ的浓度成反比。实施例26在pH2.2-1.2的酸沉淀纯化木瓜凝乳蛋白酶(ⅰ)将从英国Powell&Scholefield得到的市售喷雾干燥胶乳，用蒸馏水稀释到20%(w/v)并搅拌1小时。在4℃，以9000xg的速率离心30分钟除去不溶物。弃去沉淀，通过在4℃搅拌下以40μl/min/ml速度，滴加盐酸1M以降低上清液的pH值。使用一种连接电极的辐射计(Radiometer)(TypeGK2401C)连续监测混合物的pH值，该电极是用pH4.01和pH1.09的标准缓冲液(Radiometer，25℃)校正过的。在pH2.2处，以0.2pH单元的间隔滴加酸，使之降到pH1.2时停止滴加，在4℃继续搅拌时，pH保持恒定。然后取出等分部分(相当于原始溶液的10ml)并贮存。对余下的溶液中继续加酸，直到达到下一个pH间隔。ⅱ)全部样品在4℃，以9000xg的速率离心30分钟并除去沉淀。ⅲ)通过滴加(400μl/min)NaOH(1M)而将每个上清液的pH值调到pH6.8。每个样品再次以9000xg的速率离心30分钟以除去任何另外的沉淀。在另一个酸沉淀实验中，是在pH1.8，25℃条件下进行的。按上述通过单一散射免疫扩散，测定每个最后上清液中的对BAPNA的活性以及PPⅣ和本发明的木瓜凝乳蛋白酶的存在量。结果示于表6，表明在4℃，pH1.8和1.8以下时，由酸沉淀得到的PPⅣ去除量达到＜0.1%的总蛋白量。在25℃pH1.8时的沉淀，达到＜0.5%。表6续表6＊BAPNA测定方法2实施例27在羊体内培养单一特异IgG抗体的制备按实施例21制备的纯木瓜凝乳蛋白酶，在使用前，按Zucker等人((1985)，同上)所述方法，缓慢地进行羧甲基化，并将它渗析到含NaCl(0.14M)，pH7.3的磷酸钠水溶液(10mM)中。通过肌肉注射100μg的在Freund的完全助剂中的羧甲基化蛋白，在羊体内培养对木瓜凝乳蛋白酶的抗血清，一个月后，以同样方式注射50μg。按Heide和Schwick(1978，同上文)所述，用硫酸铵分馏从抗血清中部分纯化IgG。接着渗析到含NaCl(0.14M)pH7.3的磷酸钠水溶液(10mM)中。用类似方法制备对木瓜蛋白酶，番木瓜蛋白酶Ⅲ和番木瓜蛋白酶Ⅳ的抗体IgG制剂。将单个羧甲基化的抗原，按照制造厂的指南，分别偶合到商品名为Zetaffinity(Anachem)的柱上，该柱用pH7.3，含有NaCl(0.14M)的磷酸钠水溶液(10mM)平衡过。可能污染或交叉反应的抗体通过流经这些柱子都由IgG制剂中吸收掉，因此最终的IgG制剂与其各自的抗原进行沉淀素反应，但与不同的抗原没有交叉反应。使用pH11.5的二乙胺水溶液(0.05M)并迅速在磷酸盐缓冲液中再平衡，可以再生连结抗原的柱以便再次使用。以这种方法制备对木瓜凝乳蛋白酶、PPⅢ、PPⅣ和木瓜蛋白酶的IgG抗体的单一特异制剂，它可以通过上文所述的单一散射免疫扩散而用于定量测定每一种抗原。实施例28木瓜凝乳蛋白酶的纯化-在pH1.5时的酸沉淀ⅰ)由美国Siebels得到的市售番木瓜喷雾干燥胶乳(20g)在去离子水和蒸馏水(予先冷却到4℃，250ml)中，在0℃搅拌60分钟。在用pH4.01和1.09的标准缓冲液(Radiometer，25℃)校正的带电极的辐射计(TypeGK2401C)连续监测pH值期间，以10μl/min/ml的速度滴加HCl(1N)，将混合物的pH值调到pH1.5。当达到pH1.5时，使pH值稳定10分钟，在这期间，如有必要可再调节pH值。ⅱ)将混合物在4℃，以12000xg的速率离心30分钟，并弃去沉淀。ⅲ)(a)用pH7.01的标准缓冲液(Radiometer，25℃)校正的辐射计电极连续监测pH值期间，通过以10μl/min/ml的速度滴加NaOH(1M)，将上清液的pH值调到7.0。当pH值达到7.0时，使pH值稳定10分钟，在这期间如有必要可再调节。在4℃，将该混合物以12000xg的速率离心30分钟，弃去沉淀。(b)上清液在4℃对30体积的去离子水和蒸馏水进行彻底渗析，在12小时期间更换二次。将渗析的溶液在S-Sepharose高性能35/100柱(Pharmacia)上通过阳离子交换色谱再纯化。对每一个实验使用的最大量为3g蛋白质(由A280测定)。交换柱在4℃用EDTA水溶液(1mM)予平衡。在样品用过后，柱用EDTA水溶液(1mM)按10ml/min流速洗涤交换柱直到A280回到零。将到0.5MK+的梯度液(0.175mMK+/ml)加到柱上，收集全部的馏分(25ml)。测定峰馏分中对BAPNA的活性。合并具有对BAPNA最高比活性(在0.17和0.22MK+之间洗脱)的木瓜凝乳蛋白酶的馏份。合并的木瓜凝乳蛋白酶在4℃对30体积的去离子水和蒸馏水进行彻底的渗析，在12小时间隔内更换5次。渗析液冷冻干燥并在-20℃贮存。在许多情况下，要重复整个纯化过程。使用上述单一散射免疫扩散和例27中所述的在羊体内培养的抗体测定本发明的木瓜凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、PPⅢ和PPⅣ的存在量。使用上述的BAPNA方法1确定对BAPNA的活性和用碘乙酸滴定活性位点。纯化进程由表7所示的平均值来总结。实施例29木瓜凝乳蛋白酶的纯化-在pH1.5时酸沉淀以及亲合色谱ⅰ-ⅲ)将由美国Siebels得到的市售番木瓜喷雾干燥的胶乳(50g)，按实施例28(ⅰ-ⅲa)中所述进行制备并调节到pH1.5。上清液在4℃，对30体积的去离子水和蒸馏水彻底渗析，在12小时期间，更换2次。ⅳ)将偶合到L-Ala-L-PheSc(按实施例10中所述制备)的ECH-SepharoseR的柱(350ml柱床体积)用pH4.5的含乙酸钠(50mM)的乙二醇(33%v/v)水溶液平衡过夜，然后用含EDTA(1mM)，pH6.8的在乙二醇(33%v/v)中的NaH2PO4/Na2HPO4(50mMNa+)水溶液(使用缓冲液)平衡。使用0.2μm孔径的滤器过滤渗析的上清液(上面的)，并加入乙二醇到33%(v/v)。检测溶液的pH值，如有必要，调到pH7.0。加入新制备的L-半胱氨酸水溶液(200mM)到4mM的浓度。将溶液很好地混合并在4℃放置15分钟。然后将溶液在4℃，以最高达40ml/hr/cm2的流速加到亲合柱。用10个柱床体积的使用缓冲溶液洗涤该柱。ⅴ)用3个柱床体积的pH4.5的在含有乙酸钠(50mM)的乙二醇(33%v/v)的HgCl2(10mM)水溶液洗脱木瓜凝乳蛋白酶，并收集25ml的馏分。合并含有对BAPNA的活性的馏分并在-S-Sepharose的高性能的35/100柱(Pharmacia)上的阳离子交换色谱进一步纯化。柱在4℃用EDTA水溶液(1mM)予平衡。在样品使用后，将柱用EDTA水溶液(1mM)以10ml/min的流速洗涤直到A280回到零。将3个柱床体积的pH7.2的含EDTA(1mM)和L-半胱氨酸(500mM)的K2HPO4/KH2PO4水溶液(50mMK+)加到柱上，停止流动30分钟。再将3个柱床体积的新制备的半胱氨酸缓冲液加到柱上并停止流动30分钟。再用6个柱床体积的半胱氨酸缓冲液洗涤该柱，然后将柱用pH7.2的含EDTA(1mM)的K2HPO4/KH2PO4水溶液(50mMK+)再平衡。将梯度(0.175mMK+/ml)到0.5MK+的溶液加到柱上，并收集全部25ml的馏分。测定峰馏分的对BAPNA的活性。在0.2-0.25MK+之间洗脱的第一峰是木瓜凝乳蛋白酶。在约0.45MK+洗脱的第二峰是是番木瓜蛋白酶Ⅲ。合并具有对BAPNA的最高比活性的木瓜凝乳蛋白酶的馏份。合并的木瓜凝乳蛋白酶在4℃，对30体积的去离子水和蒸馏水彻底渗析，在12小时期间更换5次。由阳离子交换柱上洗脱的木瓜凝乳蛋白酶用半胱氨酸缓冲液活化，因而对因氧化而失活是敏感的。为了基本上防止或减少因氧化而造成活性酶的失活，将馏份收集在含有连四硫酸钠(200mM)的试管中，使得在每份馏份中最后的NaS4O6的浓度为5mM。另外，将合并的木瓜凝乳蛋白酶在氮气的条件下对水渗析，该水已通过在氮气条件下以0.1l/min流速向密封的容器鼓泡通入氮气30分钟而去除氧气。最后将渗析液冷冻干燥而在-20℃贮存。许多情况下要重复整个纯化步骤，纯化的进程(如实施例28中所述测定)由表8所示的平均值来总结。实施例30木瓜凝乳蛋白酶的纯化-在pH1.5酸沉淀和亲合色谱ⅰ-ⅲ)将由美国，Siebels得到的市售番木瓜喷雾干燥的胶乳按实施例28中所述制备并调到pH1.5的处理、渗析和在S-SepharoseR上的阳离子交换色谱。ⅳ)合并具有对BAPNA的最高比活性的木瓜凝乳蛋白酶的馏分加入乙二醇到33%(v/v)。加入新鲜制备的L-半胱氨酸水溶液(200mM)到浓度为4mM，按实施例29(ⅳ)中所述，将溶液加到偶合到L-Ala-L-PheSc的ECH-SepharoseR柱上。ⅴ)用3个柱床体积的在pH4.5含有乙酸钠(50mM)的乙二醇(33%v/v)中的HgCl2(10mM)水溶液洗脱木瓜凝乳蛋白酶，并收集25ml馏份。合并含有对BAPNA活性的馏份，并在4℃对30体积的去离子水和蒸馏水进行彻底渗析，在12小时期间更换5次。将渗析液冷冻干燥并在-20℃贮存。纯化进程(按实施例28中所述测定)概述于表9。实施例31在同一天使用BAPNA测定方法1和2分析两个本发明的木瓜凝乳蛋白酶制剂。按总干重量计算蛋白。木瓜凝乳蛋白酶制剂A是按实施例28所述的纯化方法制备的。木瓜凝乳蛋白酶制剂B是按实施例29所述的纯化方法制备的。(最后的馏份收集在连四硫酸钠中)。重复三次的测定结果示于表10。实施例32按实施例29所述纯化木瓜凝乳蛋白酶，并按该例所述在氮气下渗析的木瓜凝乳蛋白酶冷冻干燥并在-20℃贮存。冷冻干燥的木瓜凝乳蛋白酶在37℃和pH6.0时对BAPNA(1mM)的比活性为每毫克1345单位。按下所述，制备43.75g本体溶液，以制备100小玻璃瓶的含有纯化的木瓜凝乳蛋白酶的组合物。将本体溶液在整个过程中保持在4-12℃。将L-(+)的半胱氨酸盐酸的一水合物(166mg)加到约30g水中以便注射时在最后体积中具有22mM的浓度。用NaOH(1M)或HCl(0.1M)调节溶液的pH调到pH5.0-5.5。将半胱氨酸溶液加到纯化的木瓜凝乳蛋白酶(358mg)中，使得在最后体积中具有11000单位/ml的浓度。用NaOH(1M)或HCl(0.1M)调节搅拌溶液的pH值到pH5.9-6.1，并用水配到43.75g用于注射。将溶液通过二个串联的0.2微米孔径的滤器以进行消毒。将0.4g等分的溶液装入100×5ml的小玻瓶中。塞紧玻璃瓶，在减压下冷冻干燥除去水，将装有冻干产品的小瓶在真空下密封。每个小瓶装有含3.27mg木瓜凝乳蛋白酶和1.52mg半胱氨酸钠盐酸的白色非晶形粉末(分别标定为4000单位和8微摩尔，允许过量10%)。组合物在使用前一般通过加入2ml水而直接重新配制便于注射的注射溶液，该溶液标称含有4000单位的木瓜凝乳蛋白酶和4mM的L-半胱氨酸。权利要求1.一种纯化木瓜凝乳蛋白酶的方法，包括A.a)和一种直接亲合色谱基质的活性位点保温粗制木瓜凝乳蛋白酶的水溶液，该基质含有一种载体基质，任选地通过间隔段而共价偶合到可逆的木瓜凝乳蛋白酶抑制肽的N-端上，以使所述肽结合到木瓜凝乳蛋白酶分子的活性位点上；b)用适宜的洗脱液洗脱木瓜凝乳蛋白酶；B.1、在pH值低于2.0的条件下沉淀一种含有粗制木瓜凝乳蛋白酶的水溶液混合物；2、从所述混合物中分离粗制的木瓜蛋白酶的水溶液；3、中和并任选地对所述粗制木瓜凝乳蛋白酶的溶液进行脱盐；C.i)酸沉淀一种含有粗制木瓜凝乳蛋白酶的水溶液混合物；ii)从所述混合物中分离粗制木瓜凝乳蛋白酶的水溶液；iii)中和并任选地对所述粗制木瓜凝乳蛋白酶进行脱盐；iv)和一种直接亲合色谱基质的活性位点保温由iii)步骤得到的溶液，该色谱基质含有一种载体基质，该基质，可任选地通过间隔段，共价偶合到一种可逆的木瓜凝乳蛋白酶抑制肽的N-端，以使所述肽结合到木瓜凝乳蛋白酶分子的活性位点上。v)用适宜的洗脱液洗脱木瓜凝乳蛋白酶。2.根据权利要求1的方法，其中酸沉淀是在pH1.2-1.8范围内进行。3.根据权利要求1或2的方法，其中至少结合有一个阳离子交换色谱步骤。全文摘要本发明涉及制备一种用于治疗损伤，突出或其它异常的哺乳动物椎间盘中所用的改良药物组合物制剂的木瓜凝乳蛋白酶的方法。该方法包括一个酸沉淀步骤，并且最好有一个使用直接基质的活性位点的亲合色谱方法。文档编号C07K5/065GK1047340SQ9010390公开日1990年11月28日申请日期1990年4月27日优先权日1989年4月28日发明者阿伦·约翰·巴列特,戴维·约翰·巴特尔,丹尼尔·胡伯特·里奇申请人:布茨公司