专利名称：一种含有海洋深层水的保健饮用液在制备预防或治疗代谢综合症的药物或保健品中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于海洋生物技术领域，涉及到海洋深层水的综合利用，具体涉及ー种含有海洋深层水的保健饮用液在制备预防或治疗代谢综合症的药物或保健品中的应用。
背景技术：
代谢综合症是ー组以中心性肥胖、高血糖(糖尿病或糖调节受损)、高血脂以及高血压等聚集发病，严重影响机体健康的临床症候群，以多种代谢性疾病合井出现为临床特点，是ー组在代谢上相互关联的危险因素的组合。近年来，随着经济迅速发展、生活和饮食方式西化，代谢综合症的患病率升高。代谢综合症日渐成为我国，尤其是大中城市重要的公 共卫生问题。研究表明，胰岛素抵抗(IR)是代谢综合症的发病基础，胰岛素抵抗已成为近年来医学领域的ー个研究热点。胰岛素抵抗是指一定量的胰岛素与其特异性受体结合后生物效应低于正常，即生理浓度的胰岛素没有达到预期的效应，主要表现为胰岛素抑制肝脏释放葡萄糖的能力及促进周围组织(主要是骨骼肌和脂肪)摄取和利用葡萄糖的能力下降。肝脏是胰岛素抵抗的关键器官。肝脏胰岛素抵抗主要是指胰岛素抑制肝脏葡萄糖输出的能力下降。肝糖输出主要是由糖异生和糖原分解两部分組成。糖异生是指非糖物质如乳酸、烯丙醇、生糖氨基酸、甘油等合成葡萄糖；糖原分解是指动用储存在肝脏中的糖原提供葡萄糖。肝脏作为胰岛素作用的主要靶器官，維持空腹状态下的内生性糖的产生和输出及进食后糖的吸收、利用和存储。近年来对肝脏胰岛素抵抗机制的研究已成为热点。IRS-2/PI3K信号是胰岛素在肝脏发挥生理效应的主要信号转导通路。在动物或人类进食后，由胰岛P细胞分泌产生的胰岛素入血作用于肝细胞膜表面的胰岛素受体(InsR)，使其位于胞浆内的P亚基的酪氨酸位点自磷酸化激活。激活的胰岛素受体使胰岛素受体底物(IRS-2)酪氨酸位点磷酸化后激活，进而激活磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)，激活后的PI3K可以催化4，5- ニ磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)生成三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)，其作为第二信使激活蛋白激酶B(Akt)，活化的Akt通过以下几个途径參与发挥胰岛素的代谢调节作用(1)通过对细胞内葡萄糖运载体GLUT4囊泡的易位有重要作用。在胰岛素刺激下，GLUT4囊泡从细胞内池移动到细胞膜，然后与膜融合，将GLUT4分子固定在细胞膜上，从而发挥转运葡萄糖的作用；(2)通过糖原合成酶激酶-3(GSK-3)促进糖原合成。GSK-3是第一个被发现的PKB/Akt的生理底物，PI3K、PDK, Akt和GSK3形成了胰岛素调节糖原合成的信号级联系统中的ー个重要支路。两种形式的GSK3的异构体GSK3a和GSK3 P的氨基端都含有Akt的磷酸化位点，胰岛素通过磷酸化和失活GSK3促进糖原合成；(3)抑制糖异生基因葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)及磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)的表达及糖异生，最終降低血糖。胰岛素受体信号转导缺陷是IR发生的主要原因，正常胰岛素信号传导的关键是各种激酶蛋白上的酪氨酸磷酸化过程。在绝大多数胰岛素抵抗中，胰岛素受体的酪氨酸磷酸化基本正常，发生胰岛素抵抗的关键部位是IRS，其中IRS-1、IRS-2作为InsR后的主要信号蛋白，其基因表达的降低、蛋白表达的减少及磷酸化障碍都会造成其对PI3K的激活作用明显下降，由此妨碍了胰岛素信号传导通路下游信号的传导而导致IR。能量代谢平衡失调是IR发生的重要原因。磷酸腺苷(AMP)激活的蛋白激酶(AMPK)信号通路是调节细胞能量状态的中心环节，能感知细胞能量代谢状态的改变，并通过影响细胞物质代谢的多个环节維持细胞能量供求平衡。AMPK磷酸化后激活，活性AMPK激活其下游的多种靶分子，从而达到关闭合成代谢途径，开启分解代谢途径的效果。在骨骼肌，使葡萄糖摄取和脂肪酸氧化增加，并促进线粒体的生物合成；在肝脏，抑制葡萄糖和脂质的合成，促进脂质氧化；在脂肪组织，減少了脂质分解和脂质生成。反之，当AMPK去磷酸化失活时，机体合成代谢占主导地位，细胞内脂质、糖原合成増加。正常生理状态下，激活的AMPK调控其下游信号传导通路，一方面増加GLUT4的转位而增强骨骼肌对胰岛素的反应，运动 和ニ甲双胍就是通过这条途径改善2型糖尿病患者；另一方面，活性AMPK可以抑制羟甲基戊ニ酸单酰辅酶A还原酶(HMGCR)、こ酰辅酶A羧化酶(ACC)等脂质合成酶活性，降低固醇调节元件结合蛋白(SREBP)-Ic和脂肪酸合酶(FAS)的表达，从而抑制脂肪合成，同时增加脂肪酸氧化途径，減少肝脏内脂质含量。此外，AMPK途径激活后，下游可以通过增强线粒体功能、促进线粒体増殖而促进能量利用。因此，AMPK途径损坏会导致机体IR和脂质异位沉积。氧化应激是胰岛素抵抗发生与发展的ー个重要原因。长期的高血糖、高血脂可导致线粒体产生大量活性氧簇(R0S)，大量ROS的产生和积聚在组织，如不能被组织内的抗氧化系统清除，就会通过IKK、NF-k B、P38MAKP、JNK/SAPK等系统的活化，干扰细胞胰岛素受体信号转导以及下游的信号通路如Akt，胰岛素受体及受体底物磷酸化，最終导致胰岛素抵抗。矿物元素在IR的发生、发展过程中发挥重要作用。如Sudres等通过实验发现镁缺乏与胰岛素受体酪氨酸激酶的活性降低有关；铬可以通过调节胰岛素基因表达影响胰岛素的含量、增加胰岛素受体数量、提高胰岛P细胞敏感性、增强胰岛素的结合力、增强胰岛素内摄和激活胰岛素受体酪氨酸激酶来增加胰岛素敏感性；锌、硒则可以通过提高机体的抗氧化能力而加快自由基的清除而抑制氧化应激，从而改善胰岛素抵抗。海洋深层水通常是指阳光照射不到，不能进行光合作用，约200m深度以下的海水。海洋深层水处于无阳光进入的海洋无光层，而且远离来自人类、陆地以及大气的化学物质的影响和污染。研究表明，海洋深层水具有以下几个主要特点(I)低温恒定性-不受阳光照射，不像海洋表层水温度变化无常，海洋深层水终年温度不变，恒定于5°C左右；(2)矿物元素丰富且稳定性-与海洋表层水相比，海洋深层水富含人体所必需的钙、镁、钾、钠、铁、铜、锂、钥、锰、锌、锗、碘、磷、氟、硒、三价铬、硅酸根离子等92种矿物元素，涵盖了人体新陈代谢所需的元素种类。除了其含量丰富外，由于这些水以漫长的时光流动于“无光层”的海洋深层，无光合作用发生、不受外界影响，因此所含矿物元素的成分十分稳定，完美地解决了人体平衡摄取各种所需矿物元素的要求；(3)无菌清洁性-处于海洋“无光层”的深层水，除了远离人类现代文明的影响以及不受陆地、大气化学物质、病菌的污染外，本身也无生成病原菌等细菌的条件。因此，海洋深层水是非常清洁的无菌自然之水；(4)海洋深层水水质呈弱碱性。
由于具有以上特点，海洋深层水作为ー种新的天然资源正在受到世人的瞩目。海洋深层水富含各种矿物质和微量元素，理论上它对胰岛素抵抗及代谢综合症具有很好的改善作用。我国海域宽广，海岸线漫长，海洋资源丰富，但尚无海洋深层水开发应用方面的研究；而且我国水资源紧缺，水污染严重，开发我国的海洋深层水资源具有十分重要的意义。我国海域宽广，海岸线漫长，海洋资源丰富，但尚无海洋深层水开发应用方面的研究；而且我国水资源紧缺，水污染严重，开发我国的海洋深层水资源具有十分重要的意义。
发明内容
针对目前我国水资源日益紧缺、水污染日趋严重且代谢综合症发病率急剧升高等热点问题，本发明提供了ー种含有海洋深层水的保健饮用液在制备预防或治疗代谢综合症的药物或保健品中的应用。为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现ー种含有海洋深层水的保健饮用液在制备预防或治疗代谢综合症的药物或保健品中的应用，所述保健饮用液包括A液和B液，所述A液为淡水，所述B液经以下步骤制得海洋深层水经反滲透装置后分离出的浓水部分，将浓水部分进行减压浓縮，使其体积浓缩至原来体积的0. 67-3. 33%，然后过滤除去析出的氯化钠，得到的高度浓缩液即为B液，所述保健饮用液的硬度在200-1000ppm，所述海洋深层水为海平面500m以下且经脱盐处理后的海水。对上述技术方案的进ー步改进所述保健饮用液中镁钙钾钠元素的浓度比值为2. 5-3. 5 0.45-1 0.3-1 0. 3-1. 5，不含有机物，且水质呈弱碱性。对上述技术方案的进ー步改进所述镁钙钾的浓度最优比为3 : I : I。对上述技术方案的进ー步改进所述保健饮用液的水质呈弱碱性，25°C測定的pH值 I. 5±0. 3。对上述技术方案的进ー步改进所述保健饮用液中的有益元素含量为锌0. 0325-16. 4 u g/L ;硒 0. 0395-0. 712 y g/L ;铬 0. 104-4. 54 u g/L ;锰 0. 156-5. 52 u g/L。对上述技术方案的进ー步改进所述保健饮用液中的有害元素含量为铅
<5 u g/L ;萊< 0. 5 y g/L ;砷< 5 u g/L ;镉< I u g/L。对上述技术方案的进ー步改进所述海洋深层水取自于距离海岸线20km以外。对上述技术方案的进ー步改进所述淡水来源于海洋深层水经反滲透装置循环后分尚出的淡水。对上述技术方案的进ー步改进日常饮食对矿物质的摄取较少的代谢综合症患者选用硬度为600-1000ppm的保健饮用液，反之选择硬度为200-400ppm的保健饮用液。与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是本发明提供的含有海洋深层水的保健饮用液富含有益微量元素镁、钙、钒、铬、锰、锌、硒，而有毒微量元素汞和铅的含量很低，本发明通过生物实验表明，该保健饮用液在细胞水平上没有毒性，安全性高，而且可以促进糖原的合成，从而減少肝糖输出；可以通过激活AMPK抑制肝脏内的脂质合成途径而改善胰岛素抵抗；还可以通过增强机体的抗氧化能カ而改善胰岛素抵抗。通过这些途径显著调节胰岛素信号通路，对代谢综合症等代谢性疾病具有较好的预防和治疗作用。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明的技术方案作进ー步详细的说明。实施例I一、保健饮用液的制备本发明所述保健饮用液的制备方法如下
I)海洋深层水预处理将取自距离海岸线20km以外，海平面500m以深的海洋深层水放入储水罐中，采用滤器过滤，除去海水中的浮游植物及微生物，并通过活性炭过滤器过滤，进ー步除去有机物。2)淡水和浓水分离将预处理后得到的海洋深层水通过高压泵进入反滲透装置将海洋深层水分为淡水部分和浓水部分(淡水部分水质与纯浄水相同，或水质接近纯净水；浓水部分中各种阴阳离子的浓度接近原海水中各种离子浓度的2倍)，分离出的淡水部分即A液进入淡水储水罐，分离出的浓水部分进入浓水储水罐。反滲透装置的エ艺參数为运转压4MPa，功率I. 5KW，产水量IT/d。3)浓水脱钠处理将浓水储水罐中的浓水部分进行减压浓縮，使其体积浓缩至原来体积的0. 67-3. 33%，然后过滤除去析出的氯化钠，得到高度浓缩的浓缩液即为B液，所述浓缩液中镁钙钾钠元素的浓度比值为2. 5-3. 5 0. 45-1 0. 3-1 0. 3-1. 5，所述镁、钙、钾、钠元素在浓缩液中的含量浓度单位为mg/L。其中微量元素铬，锌，硒，锰等的浓度与浓缩倍数呈倍比关系。或者，也可以采用选择性电渗析对反渗透后分离出的浓水部分进行脱钠处理，电渗析装置采用I价阳离子选择性透过膜，阴膜采用普通离子交換膜。在电渗析过程中所有阴离子都可透过阴膜，仅单价阳离子透过阳膜，脱钠之后的浓水中的多价阳离子与原浓水中的浓度相近。4)保健饮用液灌装将经过步骤I)反滲透装置出来的淡水A液和步骤3)所得到的B液可以按照需求混合制得不同硬度的保健饮用液，所述硬度以CaCO3的含量计算(GB5749-2006生活饮用水卫生标准)，其计算公式为硬度=Ca (ppm)) X2. 5+Mg(ppm) X 4. 1，经过高温灭菌，分装即可。采用电感耦合等离子质谱(ICP-MS)对保健饮用液中的无机元素含量进行测定以硬度为1000的保健饮用液为例，其中几种主要矿物质及微量元素含量为镁200-224mg/L ;钙33-67mg/L ;钾20-67mg/L ;钠:20_100mg/L(钠的含量越低越好);锌
0.0325-16. 4 u g/L ；硒:0. 0395-0. 712 y g/L ;铬:0. 104-4. 54 u g/L ；锰 0. 156-5. 52 u g/L,铅< 5 u g/L ;汞< 0. 5 u g/L ;砷< 5 u g/L ;镉< I y g/L。本发明所述200-1000硬度下的保健饮用液中矿物质及微量元素含量与其硬度成正比。所述保健饮用液中镁I丐钾钠元素的浓度比值为
2.5-3.5 0. 45-1 0.3-1 0. 3-1. 5，富含有益微量元素锌，硒，铬，锰，有毒微量元素铅，汞，神，镉含量较低，不含有机物，且水质呈弱碱性。所述有益微量元素含量如下锌:0.0325-16. 4 U g/L； :0. 0395-0. 712 U g/L ；铬0. 104-4. 54 u g/L M 0. 156-5. 52 u g/L。所述有毒微量兀素含量如下铅< g/L ;萊< 0. 5 u g/L ;砷< 5 ii g/L ；镉<1 U g/L。使用pH计对其pH值进行測定(25°C )，结果表明保健饮用液pH值在7. 5±0. 3范围内，水质呈弱碱性。ニ、保健饮用液对胰岛素信号通路及胰岛素抵抗的改善作用及机制I、实验方法I)细胞培养人肝癌细胞H印G2细胞，细胞培养基为含10%胎牛血清的低糖DMEM(5. 5mmol/L)培养基，培养环境为37°C、5% CO2，每3天按I : 3比例传代一次。2)保健饮用液对H印G2细胞的细胞毒性收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度接种于96孔板，每孔10000个细胞。37°C、5% CO2培养，待细胞汇合度达70%吋，换为不含血清的DMEM，饥饿过夜，然后加入如表I所示不同硬度的保健饮用液，每个浓度设6个平行孔。继续培养24h，每孔加入新鲜配制的20 ii L MTT (5mg/mL)，继续培养4h。然后吸掉上清，每孔加入150 ii L DMS0，低速振荡lOmin，充分溶解结晶物，用酶联免疫检测仪在570-630nm测OD值，记录結果，计算细胞的抑制率。3)胰岛素抵抗H印G2(IR_H印G2)细胞模型的建立及给药处理取对数生长期的HepG2细胞，用含10% FBS的DMEM培养液配成单个细胞悬液，根据实验要求，按细胞密度为1.0父106(^11/111し接种于不同孔径培养板中，培养箱37で，5(%ニ氧化碳条件下孵育。待细胞汇合度至70%，换为不含血清的DMEM培养液饥饿过夜，然后换为低糖(5. 5mmol/L)或高糖(30mmol/L)的无血清培养基继续孵育24h。在低糖培养基中孵育的H印G2细胞为空白对照细胞，在高糖培养基中孵育的H印G2细胞为IR-HepG2细胞。在建立胰岛素抵抗模型的同时给予不同硬度的保健饮用液，观察保健饮用液对胰岛素抵抗的预防作用。检测胰岛素信号通路相关蛋白表达时，收获细胞前，IOOnM胰岛素刺激lOmin。4)保健饮用液对IR_HepG2细胞糖输出量的影响药物孵育24h后，用无糖DMEM培养基洗涤细胞3次，然后加入葡萄糖输出培养基(含有2mM丙酮酸钠和20mM乳酸钠的无糖无酚红DMEM)继续孵育16h，其中最后3h加入InM胰岛素。孵育结束后，取上清測定葡萄糖含量，板中下层细胞裂解后BCA法測定蛋白含量。5)保健饮用液对IR-H印G2细胞糖原含量的影响药物孵育24h后，PBS洗涤细胞，加入含有In M胰岛素的培养基继续孵育3h，弃去培养液，预冷PBS洗2次，细胞刮刮取，12000r/min，4°C离心15min，弃上清，细胞沉淀中加入0. 5mL 30% KOH，置100°C水浴20min，取出IOii L用BCA法测定蛋白含量，其余加入1.5mL无水こ醇，过夜，4000r/min离心15min,弃上清,沉淀中加入蒸懼水0. 5mL,随后加入ImL 0.2%蒽酮(0. 2g蒽酮溶于IOOmL98%硫酸)，100°C水浴20min。酶标仪检测620nm波长处OD值，同时配制100、50、25、12. 5、6. 25,3. 125及I. 56 u g/mL的葡萄糖溶液，做糖浓度标准曲线。6)保健饮用液对IR_HepG2细胞脂质含量的影响药物孵育24h后，吸除剰余培养液，冰PBS洗2遍，加入100 ii L细胞裂解液，吹打均匀，冰水中孵30分钟，期间不断用细胞刮涂抹，使裂解液和细胞充分接触；将裂解液转移至I. 5mL ep管中，低温超声破碎IOs ；12000rpm，15min，4°C离心，_20°C冷冻保存，取少量细胞溶解液用BCA法测定蛋白质含量，其余用于检测细胞内的脂质含量。分别测定细胞内胆固醇和甘油三酯的含量単位以每毫克蛋白质含量O g/mg protein)计算。7)保健饮用液对IR_HepG2细胞胞内ROS含量的影响使用活性氧检测试剂盒测定胞内ROS含量。依据说明书操作，药物作用24h后，胰酶消化收获细胞，PBS洗3次，重悬于 10 y M 2, 7-dichlorodihydrof luorescein diacetate (DCFH-DA),然后 37°C孵育 30min,荧光分光光度计测定胞内ROS含量，激发波长488nm，发射波长525nm。8) western blot检测保健饮用液对胰岛素信号通路、AMPK信号通路及JNK信号通路等相关蛋白的表达及磷酸化程度的影响细胞裂解液用BCA法測定蛋白浓度，等量上样，10%分离胶 SDS-PAGE，转膜 lh, 5% BSA 封闭 2h 后加入 IRS-2、pIRS-2 (Tyr612)、Akt、pAkt(Ser473)、GSK-3、G6Pase、AMPK、pAMPK、pHMGCR、pACC、SREBP-1、1 JNK、pJNK、actin 等ー抗工作液，4°C摇动过夜。ー抗孵育之后，TBST洗膜，加入I 5000稀释的辣根过氧化物酶标记的ニ抗工作液，室温摇动lh，ECL显色。9)统计学处理数据均以均数土标准差表示(),组间差异采用t检验方法进行。2、实验结果 I)保健饮用液对H印G2细胞增殖的影响由表I可以看出，不同硬度的保健饮用液对HepG2细胞的増殖基本无影响，因此可用于下一歩实验。表I :保健饮用液对H印G2细胞増殖的影响
权利要求
1.ー种含有海洋深层水的保健饮用液在制备预防或治疗代谢综合症的药物或保健品中的应用，所述保健饮用液包括A液和B液，所述A液为淡水，所述B液经以下步骤制得 海洋深层水经反渗透装置后分离出的浓水部分，将浓水部分进行减压浓縮，使其体积浓缩至原来体积的0. 67-3. 33%，然后过滤除去析出的氯化钠，得到的高度浓缩液即为B液，所述保健饮用液的硬度在200-1000 ppm，所述海洋深层水为海平面500m以下且经脱盐处理后的海水。
2.根据权利要求I所述的ー种含有海洋深层水的保健饮用液在制备预防或治疗代谢综合症的药物或保健品中的应用，其特征在于所述保健饮用液中镁钙钾钠元素的浓度比值为2. 5-3. 5 :0. 45-1 :0. 3-1 :0. 3-1. 5，不含有机物，且水质呈弱碱性。
3.根据权利要求2所述的ー种含有海洋深层水的保健饮用液在制备预防或治疗代谢综合症的药物或保健品中的应用，其特征在于所述镁钙钾的浓度最优比为3:1:1。
4.根据权利要求2所述的ー种含有海洋深层水的保健饮用液在制备预防或治疗代谢综合症的药物或保健品中的应用，其特征在于所述保健饮用液的水质呈弱碱性，25°C測定的 pH 值 7.5±0.3。
5.根据权利要求I所述的ー种含有海洋深层水的保健饮用液在制备预防或治疗代谢综合症的药物或保健品中的应用，其特征在于所述保健饮用液中的有益元素含量为锌0. 0325-16. 4 l^g/L ;硒 0. 0395-0. 712Pg/L ;铬 0. 104-4. 54 l^g/L ;锰 0. 156-5. 52吒/し
6.根据权利要求I所述的ー种含有海洋深层水的保健饮用液在制备预防或治疗代谢综合症的药物或保健品中的应用，其特征在于所述保健饮用液中的有害元素含量为铅〈5/L ;萊 < 0. 5I^g /L ;砷 < 5Mg/L ;镉 < IMg /し
7.根据权利要求I所述的ー种含有海洋深层水的保健饮用液在制备预防或治疗代谢综合症的药物或保健品中的应用，其特征在于所述海洋深层水取自于距离海岸线20km以外。
8.根据权利要求I所述的ー种含有海洋深层水的保健饮用液在制备预防或治疗代谢综合症的药物或保健品中的应用，其特征在于所述淡水来源于海洋深层水经反滲透装置循环后分尚出的淡水。
9.根据权利要求I所述的ー种含有海洋深层水的保健饮用液在制备预防或治疗代谢综合症的药物或保健品中的应用，其特征在于日常饮食对矿物质的摄取较少的代谢综合征患者选用硬度为600-1000 ppm的保健饮用液，反之选择硬度为200-400 ppm的保健饮用液。
全文摘要
本发明提供了一种含有海洋深层水的保健饮用液在制备预防或治疗高脂血症的药物或保健品中的应用，保健饮用液包括A液和B液，A液为淡水，所述B液为海洋深层水经反渗透装置分离出的浓水部分，再经减压浓缩得到的高浓度浓缩液，硬度范围为200-1000ppm。该保健饮用液可以在体外水平上调节胰岛素信号通路，改善胰岛素抵抗，从而预防代谢综合症。该保健饮用液来源于海洋深层水，具有资源丰富，易于产业化等优点，在代谢综合症的防治方面具有广阔的市场和应用前景。
文档编号A61P3/10GK102652757SQ20121011460
公开日2012年9月5日 申请日期2012年4月18日 优先权日2012年4月18日
发明者何珊, 刘红兵, 李春霞, 李海花, 管华诗, 郝杰杰 申请人:中国海洋大学