胆汁酸系列衍生物在抗肿瘤转移药中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于化合物医药用途发明领域，公开了胆汁酸系列衍生物在抑制肿瘤细胞生长中的作用。本发明筛选出胆汁酸系列衍生物中活性最高的为4｀-羟基胆酸丁酯，并在此基础上通过各种检测方法进一步确定4｀-羟基胆酸丁酯的抗肿瘤转移作用。
【专利说明】胆汁酸系列衍生物在抗肿瘤转移药中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于化合物医药用途发明领域，具体涉及胆汁酸系列衍生物的抗肿瘤转移作用及其可作为药物中间体的功能。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤是严重危害人类健康的重大疾病之一，肿瘤患者死亡原因大多为恶性肿瘤晚期转移所致，如何克服肿瘤细胞的复发和转移成为医药工作者研究开发抗肿瘤药物的重要任务。肿瘤转移是指恶性肿瘤细胞从原发部位，经淋巴道、血管或体腔等途径，到达其他部位继续生长的过程。肿瘤侵袭是指恶性肿瘤离开原发生长部位，突破基底膜和细胞外基质构成的屏障，侵犯毗邻的正常组织，并使之发生变性和坏死。肿瘤发生侵袭和转移是一个多步骤的复杂过程，包括以下几步:1.肿瘤细胞从原发瘤病灶脱离；2.肿瘤细胞穿过细胞外基质(ECM)浸润；3.迁移与血管内皮细胞、肿瘤细胞进入循环系统，随着血流到达并停留于远处位点的血管壁；4.肿瘤细胞穿出血管，通过细胞外基质(ECM)，最后在特定的组织或器官形成转移灶。
[0003]目前临床使用抗肿瘤药物绝大数为化疗药物，这些药物能作用在肿瘤细胞生长繁殖的不同环节上，抑制或杀死肿瘤细胞。化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时，又杀伤正常组织的细胞，尤其是杀伤人体中生长发育旺盛的血液、淋巴组织细胞等，而这些细胞与组织是人体重要的免疫防御系统，破坏了人体的免疫系统，癌症就可能迅速发展，造成严重后果。化疗药物大多缺乏选择性，体内分布广泛，易引发毒副作用，导致患者不能耐受，降低药物疗效。因此，近年来人们一直致力于新型抗肿瘤药物的研究，其中有效抑制肿瘤细胞转移的药物是一个新的药物开发方向。
[0004]近年来，胆汁酸因其独特的生物和化学性质而在生物医药、高分子材料及仿生等领域显示出广阔的应用前景。胆汁酸在生物体内的作用为促进脂类物质的消化吸收，调节胆固醇代谢，此外，胆汁酸还可直接作为药物或与其他药物联合治疗肝病、胆结石以及炎症等疾病。胆汁酸价廉易得，其衍生化合物通常仍能保留肝肠循环特性、良好生物相容性、甾环的高稳定性、分子的两亲性等特征，故可将胆汁酸用于前药的设计。目前的一些体内、外实验表明:胆汁酸衍生物有抗肿瘤活性，该活性表现在通过各种信号途径诱导肿瘤细胞凋亡。
【发明内容】
[0005]为了充分利用胆汁酸衍生物良好的生物相容性，留环的高稳定性等优势，研究及开发胆汁酸衍生物的抗肿瘤活性是本发明的研究目的。通过初步药物筛选，在众多胆汁酸衍生物中选择一种抗肿瘤活性最强的化合物，随后由体内外实验深入研究其抗肿瘤的机理、体内作用最佳浓度范围以及如何成为优良的药物中间体。
[0006]本发明的技术手段包括:MTT比色法筛选抑制肿瘤细胞生长效果最佳的胆酸衍生物为4、-羟基胆酸丁酯，分别通过划痕试验、黏附实验、transwell侵袭实验测定4 ' -羟基胆酸丁酯对人乳腺癌细胞的迁移、黏附、侵袭能力有明显抑制和削弱。为了进一步说明4 ' -羟基胆酸丁酯对肿瘤细胞的抗转移作用，分别从RNA水平和蛋白水平上对肿瘤转移标志基因进行检测，为4 ^ -羟基胆酸丁酯的抗肿瘤转移作用提供了更加坚实的实验证据。
[0007]本发明的有益效果:目前，胆汁酸衍生物的抗肿瘤活性集中在诱导肿瘤细胞的凋亡，而本发明将胆汁酸衍生物的抗肿瘤活性拓展到抑制肿瘤细胞的转移活性，并从中确定了 4 ' -羟基胆酸丁酯的最佳活性浓度范围。这一发明有助于开阔以胆汁酸为前药设计的思路，也助于将4 ' -羟基胆酸丁酯这一化合物继续开发为良好的抗肿瘤转移药物。
【具体实施方式】:
[0008]实施例1:胆汁酸衍生物的体外抗肿瘤实验
[0009]1.细胞株:!fepG-2(人肝癌细胞)、MCF_7(人乳腺癌细胞)、SW480(人结肠癌细胞)
[0010]2.培养基:低糖DMEM培养基
[0011]3.方法
[0012]3.1收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入lOOul，铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，(边缘孔用无菌PBS填充)。
[0013]3.2 5% C02，37°C孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入浓度梯度的药物(I μ M, 5 μ M, 25 μ M, 125 μ M, 625 μ Μ)，设5个复孔，同时设空白组和对照组。
[0014]3.324小时后，每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5% MTT)，继续培养4h，终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入IOOul 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡lOmin，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪0D570nm处测量各孔的吸光值。
[0015]3.4利用公式:抑制率=(对照孔OD-加药孔OD)/对照孔ODX 100%求出各衍生物的肿瘤细胞抑制率，并分别计算各衍生物的半抑制浓度IC5(I。
[0016]4.结果:筛选出半抑制浓度IC5tl最低即抗肿瘤效果最好的胆汁酸衍生物为4 羟基胆酸丁酯。
[0017]实施例2:测定4 ^ -羟基胆酸丁酯对MCF-7迁移、侵袭、黏附能力的影响
[0018]1.细胞划痕实验:
[0019]直观地确定了 4 ' -羟基胆酸丁酯可以抑制贴壁生长的MCF_7(人乳腺癌细胞)的迁移能力。
[0020]2.Transwell 侵袭实验:
[0021]在模拟细胞外基质环境的前提下，测定经4 ^ -羟基胆酸丁酯处理之后可以穿膜的MCF-7(人乳腺癌细胞)数量，并与空白实验组相对比，从而确定4 ^ -羟基胆酸丁酯可以明显降低肿瘤细胞的侵袭能力。
[0022]3.黏附实验:
[0023]通过测定MCF-7 (人乳腺癌细胞)经4 ' -羟基胆酸丁酯处理后分别与HUVEC (人脐静脉内皮细胞)、胶原蛋白的黏附率，确定4 ' -羟基胆酸丁酯可以抑制肿瘤细胞的黏附能力。
[0024] 实施例3:从RNA和蛋白水平上检测肿瘤细胞转移的标志基因表达情况
[0025]1.半定量逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR):
[0026]对经4 ^ -羟基胆酸丁酯处理过的MCF-7人乳腺癌细胞提取RNA并检测各肿瘤转移标志基因的表达水平，从RNA水平上确定4 ' -羟基胆酸丁酯可以抑制肿瘤细胞的转移能力。
[0027]2.Western Blot 实验:
[0028]对经4 ' 平，从蛋白水平上确定了 4 '-羟基胆酸丁酯可以抑制肿瘤细胞的转移能力。
【权利要求】
1.胆汁酸系列衍生物(式I)在制备抗肿瘤药物中的应用。
2.根据权利要求1中所述的应用，其特征为胆汁酸系列衍生物有降低肿瘤细胞转移能力的作用。
3.胆汁酸系列衍生物在制备抗`肝癌、乳腺癌、结肠癌等转移的药物中的应用。
【文档编号】A61K31/575GK103655581SQ201210317129
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年8月31日 优先权日:2012年8月31日
【发明者】胡祥正, 张同存, 王晶, 罗学刚, 王楠, 周宏建, 宋光珍, 许卫卫 申请人:天津纽伟仕生物医药技术有限公司