专利名称：骨桥蛋白的功能表位、与其特异性结合的单克隆抗体及其在制备抗肿瘤转移药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了一种蛋白的功能表位、 与这个表位特异性结合的单克隆抗体及其在制备抗肿瘤转移药物中的用途。
技术背景肿瘤是严重危害我国人民生命健康的重大疾病，肿瘤手术切除后5年，生 存率可达40%左右，但仍有一半左右的病人手术后出现转移复发。如何控制肿 瘤切除后很高的转移复发率以提高肿瘤患者的疗效，是国际医学研究的重点攻 关课题。深入研究肿瘤细胞转移的机理有助于阐明肿瘤转移复发的分子机制， 了解促进转移的信号传导通路，寻找抑制转移的有效作用环节，为新药研制和 临床治疗提供更有效的阻断靶点，提高肿瘤病人的生存率。肿癯转移分子机理研究提示多种因素与肿瘤细胞转移密切相关，如Pl6突 变、p53突变,p21、 c erbB-2、 mdm-2、转移生长因f a (TGFct)、表皮生长因 子受体(EGF-R)、基质金属蛋白酶--2 (MMP-2)、尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA) 及其受体与纤溶酶原激活物抑制剂-1 (PM1)、细胞间黏附分子-1 (ICAM-1)、 血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍化内皮生长因子(PD-ECGF)等为肝癌侵 袭性正相关因子(Yamaguchi H, Wyckoff J, Condeelis J- Cell migration in tumors. Curr Opin Cell BioL 2005 ; i7(5):559-64- Huber MA， Kraut N, Beug H. Molecu〗ar requirements for epithelial-mesenchymal transition during tumor progression. Curr Opin Cell BioL 2005 Oct: 17(5):548—58.)。近年来的研究发现骨桥蛋白(Osteopontin, 0PfO在肿瘤细胞转移过程中 发挥了至关重要的作用(Rangasw咖i H， Buibule A, Kundu GC. Osteopontin: role in cell signaling and cancer progression.Trends Cell Biol. 2006 Feb;16(2) :79-87.),在各国研究小组共同努力下，0PN促转移信号通路领域不 断有新的报道，从不同的角度对其促肿瘤细胞转移功能的主要方面进行了解释， 0PN信号通路在促进胂瘤细胞转移方面的重要调控作用已经成为国际肿癯转移 研究领域的研究热点。骨桥蛋白作为一种重要的促肿瘤转移糖蛋白信号分子在骨骼组织、肾脏组 织、大脑组织、腺体表皮细胞、血管平滑肌细胞、活化的巨噬细胞、淋巴细胞 和肿瘤细胞中均有表达(Weber GF， Ashkar S, Glimcher J!J, Cantor H. Receptor-1 igand interaction between CM4 and osteo,tin (Eta-1)-Science (Washington, DC) 19恥:271: 509- 12.)。 0PN在肿瘤组织细胞外基质 中，能够通过激活肿瘤细胞表面的CD44 (Miyauchi A, Alvarez J, Greenfield EM, et al. Recognition of osteoponUn and related peptides by an otvg3 integriii stimulates immediate cel〗signals in osteoclasts. J Biol Ch柳 1991;266:20369-7)和Integrin(Teramoto H, Castelone MD, Malek RL, Letwin N, Frank B, Gutkind JS, Lee朋.Autocrine activation of an osteopontin—C隱-Rac pathway enhances invasion and transformation by H-RasV12. Oncogene. 2005 Jan 13;24(3) :489-501.)两大受体下游的信号通路， 促进肿瘤细胞对细胞外基质的降解、细胞迁移和细胞的抗凋亡能力，包括以下 几个方面0PN信号被受体CM4识别引起肿瘤细胞Rho家族小G蛋白如Rac的 活化(Ter柳otoH, Castellone MD, Ma3ekRL, Letwin N, Frank B, Gutkind JS，Lee亂Autocrine activation of an osteopontin-CD44—Rac pathway enhances invasion and transformation hy H'-RasV 12. Oncogene. 2005 Jan 13;24(3):489 501.),小G蛋白传达细胞外化学趋化信号至下游的效应蛋白如 Wiskott-Aldiich syndrome protein (WASP)家族成员，WASP蛋白结合并活化 Actiri相关蛋白(Arp2/3)复合物，后者催化肌动蛋白Actin的聚合反应，从 而诱导肿瘤细胞骨架重构以及细胞膜突起的形成，增强细胞的迁移能力(Wolf K, Mazo I, Le卿H et al. Compensation mechanism in t咖or cell migration: mesenchymal amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis. J Ce〗l Biol 2003: 160: 267-77.);在迁移细胞被拉伸的前缘， 活化的WASP蛋白促使突出的细胞膜形成Integriri依赖的细胞粘附，诱导基质 金属蛋白酶在局部的积累促进细胞外基质的降解(Nicholson, LM. and Anderson, N.G. (2002) The protein kinase B/Akt signaling pathway in human malignancy. Cell. Signal. 14， 381 -395);此外0PN-CD44下游通路 可以激活PI-3K,而PI-3K的靶分子之-就是Akt激酶，Akt激酶调控细胞周期 的进行，促进细胞存活，细胞锚定非依赖性生长以及细胞迁移等过程，介导了 OPN促进肿瘤抗凋亡和细胞迁移功能(L.in， Y.H. and Yang-Yen, H.F. (2001) The osteopontin. CD44 survival signal involves activation of the phosphaticlylinositol 3. kinase/Akt signaling pathway. _J. Biol. Chem. 276, 46024-46030。 Philip, S. and Kundu, G.C. (2003) Osteopontin induces nuclear factorkB mediated pro腿trix 迈etalloproteinase-2 activation through I kappa B alpha/IKK signaling pathways and curc咖in (diferuloiyi鹏thane) downregulates these pathways. J". Biol. Chem. 278，14487 - 14497) 。 OPN被受体a v g 3识别后激活NIK和MEKK1分别引起下游NF-K B和AP-1的活化入核诱导效应基因uPA和醒Ps表达的上调，促进了对细胞外 基质的降解(Ra,sw柳i, H. et a]. (2004) Nuclear factor inducing kinase plays a crucial roU， in osteoponUn induced MAPK/J k kinase dependent nuclear factor kB mediated promatrixmeta〗JU)proLeinase-9 activation. J. Mol. (:h棚.279, 38921 -38935， Rangasw咖i, H. et al. (2005) JM1 differentially regulates osteopontin induced nuclear factor inducing kinase/MEKKl dependent activating protein 1 - mediated promatrix 鹏tall卯roteinase -9 activation. J. Biol. Ch柳.280, 19381 -19392)。综 上所述，OPN信号通路功能的发挥为肿瘤转移细胞完成对细胞外基质的侵润、通 过血液或者淋巴循环向外周组织器官扩散和形成转移灶的各个阶段中表现出多 方面的重要调控功能。通过抗OPN抗体阻断ora的促转移信号传导通路，就有可能有效阻断肿瘤 细胞的黏附和迁移过程，防止肿瘤细胞向细胞基质的侵润，从而防止肿瘤的转 移。发明内容本发明的目的之一是公开了骨桥蛋白的功能表位NAPS。 本发明的另外一个目的是公开了与上述功能表位特异性结合的抗骨桥蛋 白的单克隆抗体。本发明还公开r上述单抗的重链"了变区氨基酸序列SEQ ID NO. 4，轻链可 变区氦基酸序列SEQ ID NO. 6。更具体地，本发明公开了抗骨桥蚩白的单克隆抗体IA12，其重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO. 4,轻链可变区氮基酸序列为SEQ ID NO. 6,恒定区为小 鼠IgG。本发明还公开了一种DNA分子，编码上述的抗骨桥蛋白的单克隆抗体。 本发明更进一步公开了上述编码抗骨桥蛋白单克隆抗体的DNA分子其包含编码重链可变区的核苷酸序列SEQ ID N'O. 3和编码轻链可变区的核苷酸序列SEQID肌5。本发明的另外--个目的是公开了 i:述抗骨桥蛋白的单克隆抗体在制备抗 肿瘤转移药物中的应用。本发明所述的与本发明中公开的上述骨桥蛋白功能表位特异性结合的抗骨 桥蛋白的单克隆抗体，包括但不限于利用重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO.4 与轻链可变区氨基酸序列SEQ ID M).6通过现有的分子生物学技术得到的单克 隆抗体，还包括与本发明中公开的上述骨桥蛋白功能表位特异性结合的利用现 有的分子生物学技术if以得到的嵌合的单克隆抗体、人源化及全人源的单克隆 抗体。本发明所称的肿瘤,包括但不限于腺癌、白血病、淋巴瘤、黑色素癯、肉瘤， 肿瘤组织的来源包括但.不限于肾.h腺、胆囊、骨、骨髓、脑、乳腺、胆管、胃 肠道、心脏、肾脏、肝脏、肺、肌肉、卵巢、胰腺、甲状旁腺、阴莖、前列腺、 皮肤、唾液腺、脾脏、睾丸、胸腺、甲状腺和子宫。除了上述的肿瘤外，还可 用于中枢神经系统的肿瘤如胶质细胞多样性瘤、星细胞瘤等，此外眼部的肿瘤 包括基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤等，还包括内分泌腺肿瘤、神经内分 泌系统肿瘤、胃肠道胰腺内分泌系统肿瘤，生殖系统肿瘤及头颈部肿瘤等。这 里不再一一列举。本发明所称的抗肿瘤转移药物，包括但不限于预防和/或治疗肿瘤转移的药物。具体地，本发明的申请人首先利用分子生物技术克隆人和鼠OPN基因，利 用真核细胞表达了人和鼠的OPN蛋白，并通过细胞融合杂交瘤的方法制备了鼠 抗人的0PN单克隆抗体yU2，还对此举克隆抗体的基因进行了克隆并测定了其序 列。本发明的申请人利用乳腺癌细胞株MDA-腿-435s进行了一系列实验,来验证 本发明公开的鼠抗人0PN单克隆抗体1AW对肿瘤转移的抑制作用。细胞贴壁实验 结果显示抗0PN抗体lAi2可以有效阻断,A MB-435s细胞和hOPN的结合，细胞侵 袭实验结果表明抗0PN抗体lA12可有效阻断MDA-船435s f hOPN存在时进行的基 底膜侵袭，损伤划痕实验结果显示抗0PN抗体1A12町以有效抑制细胞损伤划痕的 修复，软琼脂克隆形成实验结果显示抗0PN抗体1A12可以抑制MDA-腿-435s细胞在软琼脂上克隆形成的大小，相应地，作为对照的无关抗体则没有上述作用， 从而说明了本发明公开的上述抗hOPN抗体lM2可有效抑制转移肿瘤灶的形成的作用。本发明的申请人还利用噬菌体展示技术鉴定了抗M)PN抗体lAi2作用的OPN 的功能表位，这个功能表位为船PS，进一步阐明了O，分子的作用靶点。更具体 地，本发明的申请人通过单克隆抗体抗原表位的淘选、phage clones ELISA和 western Wot鉴定测序及序列分析推测出OPN的功能表位，进一歩通过Phage克 隆与抗体结合能力分析选择结合力最强的克隆合成了系列短肽，通过这些短肽 与特异性抗体的结合实验对此表位进行了鉴定。
图l.人、鼠OPN真核表达纯化后的SI)S-PAGE电泳图；M代表蛋白质标准图2.抗hOPN单抗1A12的Western blotting结果；图3.执hOPN举-抗1A12阻断肿瘤细胞黏附的结果；图4.抗h(3PN争执1A12抑制肿瘤细胞对基底膜侵裘的结果；图5.抗OPN单抗U12抑制肿瘤细胞对损伤划痕的修复；图6.抗0PN单抗1A12抑制肿瘤细胞在软琼脂上克隆形成的结果；图7.抗0PN单抗IA12淘选三轮后的产出效率比较图；图8.抗0PN单抗]A12阳性噬菌体RISA和呢STKRN鉴定图，图8-1为phageEL:ISA鉴定图，图8 2为W12阳性噬菌体KUSA和WESTERN鉴定图； 图9. Align X软件序列分析抗0PN中—抗1A12的结合表位结果； 图10.各种序列农位与抗(FN单抗U12结合力的比较； 图11抗OPN单抗IM2特异识别表位在OPN分子七的相对部位。
具体实施方式
以下结合实施例、实验例进--歩对本发明进行说明，这些实施例、实验例 不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用 于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法 或将质粒引入宿主细胞的方法以及经典的细胞融合和单克隆抗体筛选及纯化的 方法等。这样的方法对于本领域中具窄j普通技术的人员是众所周知的，并且在 许多出版物中都有所描述，包括S咖brook, J., Fr"sch, E. F. andManiais， T- (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 1 edition. Cold spring Harbor Laboratory Press-实施例抗OPN单克隆抗体的制备实施例1.人0PN cDNA片段的克隆参照Gt:朋MNK提供的人(FN的资料及序列，合成引物0PN引物有义(引 物l) : GGG (MGC'nj ACCATGAGAATTGCA(;TGATTTG (Hind III) (SEQIDNO.8) 和O刚反义(引物2) : GCC|GCTACC|ATrGACCTaGAAGATGCAC (Kpn I) (SEQID N0.9)。扩增人肝癌细胞株L船(购自上海中山医院)，用TRISOL试剂盒 (INVITRO(;隨)提取l職,通过RT PCR (Pl薩GA) 94"(; 5分钟；94"C 45秒， 58。C30秒，72"C45秒，30个循环；7rC10分钟，获得963bp的丽A片段。通 过凝胶回收试剂盒(上海生工)回收片段后，用限制型内切酶Hind III和Kpii I 酶切，凝胶电泳回收后，与经Hirid m和Kpri I双酶t力的质粒载体连接，转化 大肠杆菌Df!10B后，筛选获得有插入片段的阳性克隆。DNA序列测定确认，OPN 基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.l所示。 实施例2.鼠(FN cDNA片段的克隆参照GENEB八NK提供的鼠OPN的资料及序列，合成引物鼠OPN引物有 义( 弓l 物3 ):AT AAGCTTGGATGACGACGACAAGATGAGAATTOCAGTGATT (Hind HI) (SEQ IDNO.10)和鼠OPN反义(引物4): AT fc!TCGAGl TTAATTOACCTCAGAAGACKpnD(SEQ ED NO.l l )。分离鼠脾脏T淋巴细胞,用ConA激活30小时后，用TRISOL 试剂盒(INVITROGEN)提取RNA,通过RT-PCR (PROMEGA) PCR反应采 用热启动，反应条件94。C分钟；94G(:'45秒，55。C 30秒，72。C45秒，30个 循环；72QC W分钟。获得963bp的DNA片段。通过凝胶回收试剂盒(上海生工)回收片段后，用限制型内切酶mndIII和Kpnl酶切，凝胶电泳回收后，与 经Hind III和KpnI双酶切的质粒载体连接，转化大肠杆菌I)HIOB后，筛选获 得有插入片段的阳性克隆。DNA序列测定确认。鼠()PN基因的核苷酸序列如 SEQ1DN().2所示。实施例3.人、鼠OPN的真核细胞表达纯化将实施例2所得的序列正确的人、鼠0PN基因片段用相应的限制性内切酶 酶切回收后，装入pWCZa质粒屮。转染毕式酵母细胞，挑取单个克隆酵母，诱 导表达出人、鼠0PN蛋白，收集酵母细胞表达上清，经阴离子交换、分子筛纯 化，SDS PAGE证实得到人、鼠0州纯蛋白。纯化后经SDSPAGE电泳，结果见附图1。实施例4.鼠抗人01，单克隆抗体的筛选与制备100ug人0PN和等体积弗氏佐剂乳化后，腹腔注射BMJ/C小鼠免疫接种， 每二周后加强免疫一次，剂量均同第一次免疫，共免疫3次后，选取血清中 抗OPN抗体滴度较高小鼠，分离其脾脏淋巴细胞，利ffl经典的PEG法，将小 鼠脾脏淋巴细胞与NS-1细胞进行细胞融合。用10ug/nil 0PN包被96孔板， 采用EIJSA法反复筛选获得可稳定表达抗人0刚抗体的杂交瘤细胞株一~; 1A12。大量扩增舉克隆细胞株lA12，股腔注射BALB/C小鼠5X107只，10天左 右开始收集小鼠腹水，利用Protein A柱，亲和层析纯化抗人0PN的单克隆 抗体。Western blotting试验结果显示，小鼠抗人OPN单克隆抗体1A12不但 与人0PN蛋白特异结合，同时与鼠CFN蛋白也有交叉反应。结果见附图2。 实施例5.鼠抗人OPN无关对照单克隆抗体23C3D3的筛选与制备lOOug人CFN和等体积弗氏佐剂乳化后，腹腔注射BALB/C小鼠免疫接种，每二周后加强免疫一次，剂量均同第一次免疫，共免疫3次后，选取血清中抗 OPN抗体滴度较高小鼠，分离其脾脏淋巴细胞，利用经典的PEG法，将小鼠脾 脏淋巴细胞与NS l细胞进行细胞融合。用10ug/ml KU卜WLVPDP (上海业力公 司合成)包被96孔板，采用EI丄SA法反复筛选获得可稳定表达抗人OPN特异表 位抗体的杂交瘤细胞株一'23C犯3。大量扩增该单克隆细胞株，腹腔注射 BALB/C小鼠5X107只，IO天左右开始收集小鼠腹水，利用Proteiri A柱，亲和 层析纯化抗人OPN特异表位的无关对照单克隆抗体23C3D3。通过测序确定其序列，其审:链町变区的核苷酸和氨基酸序列分别为s閱m no.is和seq idNO. 19，轻链可变区的核苷酸和氣基酸序列分别为SKQ ID N0.20和SEQ ID NO. 21，恒定区为小鼠IgG恒定区。23C3D3单抗也可以利用上述序列通过分子生 物学技术得到。实验例鼠抗人OPN单克隆抗体1A12作用效果实验MDA-細435s (购自中国科学院上海细胞学研究所)无关抗体(23C3D3，制 备方法见实施例5) 实验例l细胞贴壁实验将96孔板(Grei.ner)以10网/ral的hOPN (来自实施例3)或BSA (SIGMA) 包被，4X:过夜；用1MBSA/PBS于37-C封闭1小时，以阻断非特异性结合位点。 MM-鹏-43Fw细胞用0.2^EDTA消化，重悬f 0. 25%BSA/DMEM中，调整细胞浓 度为5X 10'细胞/mi。每孔加入100^1细胞，处理组同时加入25吗/ml的1A12 单抗，对照组加入25 pg/ml的无关抗体。将细胞在37-C细胞培养箱中孵育2 小时后，以PBS洗2遍，洗去未贴壁的细胞。每孔加入100iil 1^甲醛于4-C固 定细胞10分钟 PBS洗涤之后，每孔加入10(^1 0. 5%的结晶紫室温30分钟将细胞染色。每孔加入50pl 2MTriton X 100裂解细胞，在0D 595nm处进行读 数。实验结果见图3,抗MFN的IA12单抗在25网/ml可以有效阻断 MDA-MB'435s细胞和hOPN的结合，而疋关对照抗体则无此作用。 实验例2细胞侵袭实验细胞侵袭实验选用Trans柳l 1小室系统(Cani.i!!g)进行,膜孔径大小为8 ,。 小室的上层包被人工基底膜成分Matr.igel，在通风橱内吹千，用DMEM于37'C, 1小时对其进行水化。MDA-MB 435s细胞用0.2%KDTA进行消化，重悬于0.25 %BSA/DMEM中，调整细胞浓度为5X 1()'细胞/ml 。在小室的上层加入100 jil细 胞悬液(含或不含抗OPN单抗1A1.2),在小室的下层加入0.25MBSA/DMEM (含 或不含0PN),于37r细胞培养箱中孵育24小时。附宵结束，用棉拭子将小室 上层的细胞刮除，穿过基底膜至下层的细胞用PBS洗涤之后，以1M甲醛固定之 后，以0.5^的结晶紫进行染色，200倍显微镜下观察，计数每个视野下细胞的屮/ ,数量。实验结果见图4，抗hOPN单抗在'25吗/ral即町有效阻断MDA-MB-435s 于hOPN存在时进行的基底膜侵袭，而无关对照抗体则无此作用。 实验例3损伤划痕实验将MDA鹏435s细胞在12孔板中培养至接近饱和(>90%),用PBS洗涤之 后，以无血清DMEM对细胞进行过夜血淸饥饿。用10 pi移液器枪头对单层细胞 进行划线，用PBS洗去漂起的细胞。加入抗OPN的iA12单抗，使之终浓度为25 pg/ml，对照组采用无关抗体处理。将细胞在37'C细胞培养箱中孵育24小时后, 进行拍照。结果以穿越基准线的细胞数表示。实验结果见阁5，抗0PN单抗1A12在25闢Aii可以有效抑制细胞损伤划痕 的修复，而无关对照抗体则无此作用。 实验例4软琼脂克降形成实验软琼脂克隆形成实验使用双层软琼脂系统进行。将2.5%融化的琼脂粉与 37"C预温的DMKM培摔基混合，配制0. 5%的琼脂粉溶、瓶，再用DMEM稀释成浓度 为0.3%琼脂粉溶液。在24孔细胞培养板每孔加入500 ^ 0.5%琼脂粉溶液， 置于4t:使其凝固后，转移至37'C细胞培养箱中保温。MM-鹏-435s细胞以0.2 MEDTA消化后，用0.3%琼脂粉溶液重悬，调整细胞浓度为5Xl(f细胞/ml。在 24孔板每孔中加入500^细胞悬液，并使其凝固。从第二日起，每隔l日向细 胞培养板的各孔中加入A12或无关抗休(23C3D3) (25pg/ml)处理，3周后观 察克隆形成的大小，以〉10个细胞聚集作为1个克隆。实验结果见阁6，抗OPN的iA12举抗可以抑制MDA MB-435s细胞在软琼脂 上克隆形成的大小，而对照抗体则无此作用。说明该抗体可有效抑制转移肿瘤 灶的形成。实验例M12单抗抗原表位的鉴定实验实验例l lAl2审-抗的可变区基因克隆和序列测定收集1A12 5X l(f 1 X 107杂交瘤细胞；用TRIzol ( Invitrogen Cat.No. 15596-026)抽提其总RNA，根据小鼠抗体恒定区序列，设计引物如下 HGSP1: 5' (;ATACTCTGATCT(;TTTG 3' (SEQIDN0.12) HGSP2: 5, TCGCAGATGAGTCTCGAC 3, ( SEQIDNCU3) HGSP3: 5， ATGMCACACTCACATTG 3，( SEQIDNO.！4)LGSP1: 5' GAGGTTATGACTTTCATAGTCA(:C.-3， ( Sh:QIDN0.15〉 LGSP2: 5， MCACT(;TCCAGGACA訓、CT(:G 3, ( S崎1DNCU6) LGSP3: 5' TCTGGGATAGMGTOTTCATGAG'3，( S即DN0.17)
采用lnvit.rogen 5'图;ki"CH 18374 058),分别以HGSP1， LGSP1 为引物，合成第一链cDNA;在TdT和dn'P作用—F，给第一链c咖A3，端加poly C尾;分别以HGSP2，恥SP3、 LGSP2,L(;SP3为5，引物，通过巢式PCR得到VH、 VL的PCR产物；将PCR产物装入pGEM T载体中；挑取克隆抽提质粒，限制性 内切酶鉴定得到阳性克隆，通过测序确定其序列。单抗的重链可变区的核 苷酸序列为S抑1D肌3,氨基酸序列为SEQ ID肌4, IA12单抗的轻链可变区 的核苷酸序列为SEQ I.D恥.5,氨荜酸序列为SEQ II) NO. 6 实验例2mMti h()PN (1A12)争売:隆杭体抗原表位的淘选
采用随机肽库免疫淘选法，盩个过程在96孔板上进行。100ug/ml, 100ul/ 孔抗体4"C包被过夜，10%脱脂奶粉(TBST稀释)封闭过夜，IX TBST(Tween 20 0, 1%)洗涤6次；噬菌体随机肽库(购自NEB, Ph. D. -121， Phage Display P印Ude Library KU) 4X10"'pfu ，. ,1 :lI.:常小鼠血清,室温轻摇 l小时。1XTBST(Tween-20 0.1%) 15次;用含lmg/ml BSA的Glycine—Cl PH 2. 2 洗脱，室温轻摇15idn， 15ul Tris-C〗.PH 9.1中和。UM用于测滴度，其余扩 增。扩增产物经P仪;/NaO沉淀，测滴度，同时进行第二轮淘选，相同过程进行 第三轮淘选.，每次J叩ut噬薪体数相同(4X10"'pfu),三轮淘选output噬菌体 数分别为6.9xl(f pfu、 2.9&d(f pfu、 1.69xl08pfu;淘选效率分别是第一轮的 4333和240000倍，结果表明淘选富集效果明显，见阁7。 实验例3无关对照抗体23C3D3对应噬菌体克隆的淘选采用随机肽库免疫淘选法，整个过程在96孔板上进行。100ug/迈l， lOOul/ 孔23C3D3抗体4'C包被过夜，〗0%脱脂奶粉(TBST稀释)封闭过夜，IX TBST(Twcen 20 0.浅)洗涤6次；噬菌体随机肽库(购自鹏Ph. D. -12 Phage Display PtH)"clc Library Kit) 4XJU)."pfu卜lOOul正常小鼠血清，室温轻摇 l小时。lXTBST(TTOcn 20 0.1%) 15次;用含1mg/inl BSA的Glycine-CI PH 2.2 洗脱，室温轻摇15rnin, 15ul Tr'is' C.! l)H 9. 1中和。i0uj用于测滴度,其余扩 增。扩增产物会iPEGZNaCl沉淀，测滴度，同时进行第二轮淘选，相同过程进行 第三轮淘选。用23C3D3抗体包板，KLIS/l方法检测，选取阳性反应克隆_~5F12, 作为对照噬衛体。
实验例4 phage clones F丄lSA和wcstern blot鉴定
ELISA过程在96孔板进行，1(K)ug/m.l,50uV孔固2争抗4。C包被过夜，10% 脱脂奶粉(TBST稀释)37。C封闭2小时，1XTBST(Twl'ot 20 0.1%)洗涤5次；各 单克隆噬菌体扩增上淸用1XTBS稀释后，均以5X1()W5(M，对照抗体为鼠抗 人OPN单克隆抗休(Santa Ouz)，阴性对照噬菌体为5卜'12(该克隆为23C3D3的阳 性克隆)。室温结合l小时，1XTBST('M)節-20 0.1%)洗涤5次后，每孔加入200ul 1: 5000稀释的服P标记的抗M13抗体(Pharmacia #27 9411-01)，室温震荡作 用l小时，! xmST(Tween 20 0. !%)洗錄5次,晶美公司I':LISA检测试剂盒A:B-1:1 新鲜配置的反应底物50ul/孔，室温l 5分钟。2N貼(),终止反应。每个克隆对1A12 和对照抗体23C3D3均设3复孔平行检测。OD^记录结果表明，阳性克隆与抗体的 反应是特异的。如图8-1.
We"r.'n blot过程扩增后的噬菌体单克隆上清经20% PEG/NaCl沉淀纯 化后，1)U0"'pfii/lane 10% SDS PAGE电泳，360mA恒流1小时转至硝酸纤维素膜，10%脱脂奶粉41:封闭过夜或者室温封闭2小时；lXTBST(TTOen-20 0.1%) 洗涤3次，每次10分钟；与i0ug/ml —抗室温反应i小时，iXTBST(Tween-20 0.W)洗涤5次，每次10分钟；1: lOO()稀释冊P标记的兔抗鼠IgG (北京中山 公司)室潟反应1小时，ECL kU (Ti;"igen公ff])反应1-2分钟，医用X射线 感蓝胶片压片離糸。左图为1A12争抗杂交，右图为无关抗体23C3D3杂交；箭 头所示为目标条带；结果显示阳性克隆与抗体的反应是特异的，如图8-2. 实验例5抗体识别表位的测序及序列分析
单链DNA提取试剂盒(上海捷瑞公司)制备模版，96弓i物测序，Chro迈as 读取序列，l()O个阳性克隆有4个独立序列AHgnX分析，结果有一致序列 NXNNAP,又因为G与A均为非极性、芳香族氨基酸；S、 T、 N、 P均为极性，不 带电荷氨基酸；在抗原MFN序列上，可以找到NAPS的同源motif,由此可见， 1A12的可能抗原表位为1M，结果见图9 实验例6 Phage克隆与抗体结合能力分折
各个克隆均以5Xl(fpfu投入到包被有抗体的96孔板，经过相同条件的淘 选(control an "body: 23C3D3; Irrelative control phage : 5F12),对洗 脱后的噬菌体进行滴度测定(参见bicK'd 2006 04 014639)。结果显示M)PN序 列中表位MPS,其中APS在介导h0PN的结合中起重要作用，单独的N或 丽不能介导两者的结合，在表位racrtif的第二氨基酸位置A、 G可以互换而不影 响结合能力，两者均为非极性、脂肪族氨基酸；在表位motif的第四氨基酸位 置，只要是极性、不带电荷的氨基酸(如S、 T、 N、 P)就不会影响结合能力。 该实验进一歩证实1A12的表位是NAPS。结果见阁IO
说明M12抗体的特异识别表位位于0PN第七外显/'处212-215aa处，是一木
新的表位，表《t的位置和序列如图U所示，序列也见SEQ ID NO.7,SEQUENCE LTSTiN(;
<110>上海国鍵生物技术研究院
<120>骨桥豕ft的功能表位、与其特异性结合的単经;隆抗体及其用途 <130> Ranga.swami II, Bulhide A, Kundu (;('. 0su'"pontin: r()h' hi cell signaling an(l c肌cer progression. Trends Cell Biol, ,t;
<湖> 7
<170> P沐1 enl:ii version :"
<210> 1 <211>鄉 <212>臓
<213> ArUfi"ial
<220>
<223>人()PN核苷酸序列 ■》1
atgagaattg腦:刚"鹏60
诚，gg歸ag120
gccacatggG180
gtgtcctctgtgactttaaacaagagaccc1 l.(:c卿taagtcc:gaa240
绍ccatgacc腦tggatgatatggatgatgaagat糾gh Lgaccatgtgg ir邻c(:ag300
gactccattgct (:tgatgatrtgatgattc360
gatgagtct(:(:t仰ttttcc420
c卿c咖cgta，agttgtctgg(u:g卿t480
gatagtgtggg鄉teaaaaucgcagacc540
taccctgatgggacatcacct.cac".gggttg朋t醇600
gcatacaaggt,g(:ecagg icctgtuicg(:gct'i t.ctgaUg660
ggg卿gac"gaglcagt:tg720
肪gcagtccagcggaaagccg(:aatgagcatt(:c糾gLg780
attgatagt(:鄉犯cttt(:caaagtcagccgtg福.tcca(:agccatga840
catga卿tetgdggttgtagMcccaaaagt卿g卿900cgtatttct(: at將atuiRa tagtgctttct lct.ga 935
<210> 2
<211>娜
<212>鹏
<213> ArliH:ial
<22()>
<223>鼠(炉N梭苷酸序列
<柳> 2
atgagattggc"ttgcctg"'lcctccct60
gtgactgatt'120
atci卿uag(:agnat,ru;c180
tcctctg卿ct,tt卿caagaaactt:ttc(':'mgcaattc240
catgaccaratgatgacgatgat卵t,gtgc,g嘟300
gagggtttetgt卿tctgacg朋U:tt:acc360
accgtcactgt"'igUu、arnUr"'(:t."'朋.;'gtccctac420
cccaacggcc(u但gtctaggHg""、nig480
gtttctgatg細，滩爐r(:gatgag,:(:540
ggtgagtct8卿agtc(:rt卿tgtcatc卿ttetgagcatg(x:(:t.ct,
gatcaggacti,cagecat卿tggatga660
gaaacacacnt r.(:caaag滩720
gtU匿HgC780
cacaaggaca卿tagtc(:1:a,cctaagn t.gataggtatctg微it l.c840
cgaatttctetctgaggtcaactaaagaag鄉ca朋nac卿
acagttccttHCUtgCat1'.tagtaaaaacaagaaaaagtgUagtgagggtt卿卿g卿
aatactaactCflgtt98S
〈210〉 3
<211> 35'i'
<212> DMA
<213> Artificial <220>
20<223>重链可变区核苷酸序列 <400> 3
atggcccagg t'i'.唯"鹏i gi"igtct卿r(:，-g唯'，ggi.!卿cctgg滞("tni自冊
卿atgtcct gr.iHglr.t" t.卿tacH(:fi itcm:l;":('1.咖
caga3gcctg gg'.鄉grrr 1.卿tggiitf ,tiitm加i"(:ettacaa tgm朋t"gt180
卿tacaatg啡tagUc冊aggeaaggcc acactgHctt(':igacaaatc ctce报u:iit:a240
gcctacatgg ag('!cag卿ci:tgacctct g鄉acixtg卿tctatta ctgt ,卿,
cactacggtg g，igra'4gi: Unctgg鹏caag,ct('1媒tcactgt etc:,357
<210> 4
<211>薦
<212> PRT
<213> A"ifh'ial
<220>
<223>重链可变区氣甚酸序列
權> 4
Met Ala Gin U Leu Glu Gin Ser Gly Pro{;iu Leu Val l-ys Pro
1S 10
Gly Ala Ser V,il l,ys Met S(;r Cys Lys S(-，r SerTyr Thr Ph(. Thr
》； 2fi30
衡Tyr Vt". His l'rp似Lys Gin Lys Pro(;!y Gin Gly l>cu (;!u
35 幼45
Trp lie Gy .h'r !le ,.\sn Pro Tyr Asn Asp&r Lys Tyr Asri (;lu
50 fi5糾
Lys Phe Lys l,ys ;Ua Thr I,eu Thr Ser Aspl.vs Ser Ser Asn .:'hr
6570 ,5甜
Ala Tyr Met (;lu Leu Ser Ser Leu Thr Ser GluA叩Ser Ala Val Tyr
85 恥站
Tyr Cys AJa !k'r His Tyr (Uy Gly Ser Pro Ala'lyr Trp Gly Gin (;ly
iu() 鹏 iio
Thr Leu ￥al Val Ser Ala1〗5
<210〉 5
<211> 347
<212> ,
<213> Artificial <220〉
<223>轻链可变区核苷酸序列
<400> 5
gatattttgatec:actctcc《:tgccW'ra,ttggaga tcfmgccu:c60
atctcttgcaguu: tsgl.ragagccttgta caeagtmitg,acaccta tttiicattgg120
tacctgcaga鄉'(:aggr('ngtctccm-uig t:tc:ct恭，tct180
tctggggtc(、細
agcagagtgg,C300
tggacgttcgCHugctgga i rttaaaargtg347
<210〉 6 <211>
<212> PK1'
<213> Artifirifti
<220>
<223>轻链可变区氮甚酸序列 <柳> 6
Asp lie L织i Met Thr (;ln Thr Pro Leu Ser Leu l.'ro Va〗Ser Leu (;]>'
1 5 10 15
Asp Gin Ala lit' Ser ('ys Arg Ser Sct Gin Leu Val Hj's St'r
加 25 30
Asn Gly Asn T〖rr Tyr l,eu l!is Trp Tyr Leu Gin l.ys Pro Gly Gin Ser
35 幼 45
Pro Lys Leu.uu Tie Tyr Lys VaJ Ser Asn Arg l'ht' Ser Gly Val Pro
50 55 ffi
Asp Arg Phe Si'r (;ly Ser Gly Ser G〗y Thr Asp Wit' Thr Leu Lys 1 li:65 ,0 Ser Arg Val Ala (;lu Asp Leu Gly 85
Thr His Val Trp I'hr Phe Gly f;y 「"i ,
tog
■> 7 <211> 314 <212> PRT <213> An in ;i" <220>
<223> OPN氨基酸序列 <■ 7
Aia Valie (:ys Wie Cys
Met 1
lie
Arg lie
Pro Va〗L、、' (;lti 加
Tyr Asn Lys 'I、t 35
Ser
Glu
65
Ser
Gin 50 Thr
Asn Asp Phe
His Asp lh's
￥al Asp Ser
Mel 胎 A邓
函
Asp Thr Asp帥Ser 115
Ser Asp Glu Vai
Ala Asp Ser Gly
Asp Ala Val Aa 40
Leu Leu Pro 55
l.ys f;ln Glu Thr 70
Asp Asp Met Asp
Ser lie Asp Ser 105
His (;ln Ser Asp l幼
Thr Asp Phe Pro
',.5 H()
Vai Tyr Cys Ser Gin St'r 90 %
(;ly Thr l.ys Leu (;lu l.ys 110
Leu Leu (;iy I丄e Thr Cys Ahi 10 ，ft Stn. Ser (;hi Glu Lys Gin i丄'u 30
Thr rrp I.(hi Asn Pro Asp Pro 45
(;n Asn A hi W Ser Scr Clu 抑
Leu Pro S(-;r iLys Ser Asn
75 80 Asp (;〗u A邻Asp Asp A邓His 恥 ％ Asn Asp S('r Asp Asp Val Asp
no
(;lu Ser llis His Ser Asp 125
Thr Asp k!u Pro Ala ThrVal 145 Asp
130 Phe
Ser
Pro Asp
Met Glu
Gin
Tyr 225
Asp 210 (;lu
Gin
His Ser
Phe His
Pro
2恥 Leu
〗35 HO Thr l3r(> Val Val l'ro Thr Vnl Asp Thr ':n' Asp Gly Arg
Ai.g
ins
"50 l幼 Val Tyr (;ly l.eu Ar'g St'r Lys Ser l.ys Lys Phe Arg 版 170 l'/h
lie (;lri Tyr !)ro Asp AJa Thr Asp (;lu A邻lie Thr Ser
!80 185 190
Ser "hi (;lu Asn (;ly Al" Tyr l,ys ,U" Tie Pro Wil I9f) 2(K) 205
Leu Asn Ala lJro Ser Asp Trp A邻Ser At.g Gly Lys Asp Sur
215 ， Thr S"r !,eii Asp Asp (;Jn St!r Ala ('!u Thr His Ser
Ser Ar'g l,eu
Asp Vnl〗]c
M) Ser (;h』 275
Ser 1 s
"(〗 ！:;ft
l'yr Lys Arg Lys Ala Asn A叩Glu Ser Asn Asp Ser Gin G丄u Leu Ser l、、's Val Ser Arg
II is
:沐) (;hi
Ser
26H 270 Pht' liis Si、r His (;lu Asp阪.i Leu Val Vf.U Asp
(;lu
Asp 娜
Asp S("' A hi Ser Ser (;丄u Val Asm
280 285 Lys His Lys Plie Arg lie Sur His
:鄉
Glu 305
<210> 8
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223>引物
働> 8
加
24ggg卿ctta r"tlg"柳"tg(:agtga" lg 32 <210> 9
am 29
<212>鹏
<213> Artil'i..ial <22().、
<223>引物
<柳> 9
gccggtacca ",cteig aagatgca(: 29
<210> 10
<211> 42
<212> ,
<213> ArtiH
<220>
<223>引物
<柳> i0
at卿cttgg Hth'f曙"柳cH卿tg, H"gcagtga i！ 42
<210> 11
<211> 26
<212>鹏A
<213> Artirh ial
<220>
<223>引物
<柳> 11
atctcgagtt a;mgmxn.(' agaaga 26
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220><formula>formula see original document page 26</formula><213> ArUfh'ial <220>
<223〉引物 ■> 16
aacactgtc;c卿acac(加cl.eg 24
<210> 17
<211〉 24
<212>鹏
<213> Artifi''iai
<220>
<223>引物 備0> 17
tctgggatag卿"gi":u t, 24
<210> 18
<211> 354
<212> ,
<213〉 Artm"ial
<220>
<223>重链可变区 ■》18
atggcccagc (:gg(:caLgg'.: e欧iggtg(:ag cggglggagt (l.ggtggagg attggl.gcag 60 ccta卿ggt ca"ga,t Wcatgtgca gcctctggat teaccttcaa tat.(:tai;gcc 120 atgaactggg k:(:gc(:ttggc tc(:aggaaag ggtt.tggaat gggttgctcg cat.aagaagt 180 caaagtaata a"atac柳atattatg(:c gaucagcga卿織ggtt c織a":tcc 2幼 agagatgatt狐'朋ag(:Ht getctatctg ca朋tga鄉wttgaaaac tg鄉謡ea 300 gccatgtatt a('rgtgt，g acaaatggga gactact鹏gu(:aaggcac cact 3S4 <210> 19 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial<formula>formula see original document page 28</formula>gaagattttg ggacttauu ctgtcaacat Utt都ggta'sxcattcac gttcggctcg 300
gggacaaagt tgg舰U.tuia a(:gt 324
<210> 21
<211>腦
<212> TO'
<213> Artifh'ial
<220>
<223>轻链可变区 <猶21
Asple ￥aMw. Thf. (;ln Ser Pro Aki Ser Leu &r Val Ser Val (;ly 1 S . 10 15
Glu Thr Val Thr rhr Cys Arg Ala Ser Glu Asn lie Tyr Ser Phe
加 幼 30
Leu Ala Trp l,ys (;ln (;iy l.ys Sc.r Pro Gin I加Luu V'"l.
:35 4(〗 45
Tyr Ala Ma Tl". A幼Leu Aia A邻Giy Val Pro S 'r Arg Phe (;1.￥
50 沾 投)
Ser Gly Ser Giy Thr Phe Ser Leu Lys lie Asn Ser Leu (;in &r 65 70 75 TO
Glu Asp Phe (;ly Thr Tyr Tyr Cys (iln His Phe Trp Gly Thr Pro l,he
肪 90 邪
Thr Phe Gly Ser G〗y Thr Lys Leu G〗u IJe Lys Arg J(K) 10fj
权利要求
1.骨桥蛋白的功能表位NAPS。
2. 与权利要求l所述的功能表位特异性结合的抗骨桥蛋白的单克隆抗体。
3. 权利要求2所述的单克隆抗体，其重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO. 4,轻 链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO. 6。
4. ^克隆抗体1A12,其重链可变区氨基酸序列为SEQ ID N0.4,轻链可变区氨 基酸序列为SEQ ID NO. 6，恒定区为小鼠IgG。
5. —种DNA分子，编码权利要求l所述的单克隆抗体。
6. 权利要求5所述的DNA分子，其包含编码重链可变区的核苷酸序列SEQIDN0.3 和编码轻链可变区的核苷酸序列SEQ ID恥.5。
7. 权利要求2 4任一所述的抗骨桥蛋白的单克隆抗体在制备抗肿瘤转移药物中 的应用。
8. 权利要求7所述的应用，其中肿瘤为腺癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、肉 瘤之一，肿瘤組织来自肾上腺、胆囊、骨、骨髓、脑、乳腺、胆管、胃肠道、 心脏、肾脏、肝脏、肺、肌肉、卵巢、胰腺、甲状旁腺、阴基、前列腺、皮肤、 唾液腺、脾脏、睾丸、胸腺、甲状腺和子宫。
9. 权利要求7所述的应用，其中肿瘤为中枢神经系统的肿瘤如胶质细胞多样性 瘤、星细胞瘤之一。
10. 权利要求7所述的应用，其中肿瘤还可以为眼部肿瘤、内分泌腺肿瘤、神经 内分泌系统肿瘤、胃肠道胰腺内分泌系统肿癯，生殖系统肿瘤及头颈部肿瘤之 一，其中眼部肿瘤可以为基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤。
全文摘要
本发明公开了一种骨桥蛋白的功能表位NAPS，与这个表位特异性结合的单克隆抗体1A12，本发明还公开了单克隆抗体1A12的重链可变区氨基酸序列SEQID NO.4和轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO.6，本发明进一步公开了此抗体在制备抗肿瘤转移药物中的用途。
文档编号C07K14/435GK101293924SQ20071003987
公开日2008年10月29日 申请日期2007年4月24日 优先权日2007年4月24日
发明者盛 侯, 庚 寇, 玲 彭, 戴建新, 皓 王, 郭亚军, 钱卫珠 申请人:上海国健生物技术研究院