用于猝灭自由基和调节炎症的组合物和方法

用于猝灭自由基和调节炎症的组合物和方法
【专利摘要】本发明提供用于猝灭自由基的组合物和方法，该组合物包含二氢槲皮素、维生素C和阿拉伯半乳聚糖，尤其是落叶松阿拉伯半乳聚糖，该组合物通过猝灭引起氧化应激和炎症的级联反应的自由基来有效增强落叶松阿拉伯半乳聚糖的免疫调节性质。
【专利说明】用于猝灭自由基和调节炎症的组合物和方法

【技术领域】
[0001] 本发明及其所公开的内容涉及猝灭哺乳动物体内、特别是人体内的自由基的化合 物和方法，其导致抑制由氧化应激引起的炎性细胞因子的上调以及获得健康益处。

【背景技术】
[0002] 现如今，氧化应激与人体健康之间的关系，特别是有关循环功能与患恶性肿瘤风 险之间的关系是公认的科学（Harman, D，1067Ann N Y Acad Scil〇-21 (2006))。所有好氧生 物都需要氧。虽然人在没有食物的情况下能够生存数周，在没有水的情况下能够生存数天， 但是在没有氧的情况下生存不会超过几分钟。然而，这个给予我们生命的相同分子还是衰 老的退行性疾病和衰老过程本身的根源，根本上其对我们的衰老的退行性疾病和死亡负有 责任。我们需要氧来生存，但是我们的好氧利用产生对我们体内的器官、细胞、甚至细胞器、 细胞线粒体以及细胞核和核糖体的DNA和RNA具有毒性的危险自由基。
[0003] 氧化应激
[0004] 数以千计的发表的研究表明自由基导致了退行性疾病的发展且加速了衰老 (Knight JA. 28(6)Ann Clin Lab Sci. (1998) ；Huang H, Manton KG. 9110〇-17Front Biosci. (2004))。年轻人通常产生抗氧化酶、超氧化物歧化酶（SOD)、过氧化氢酶以及谷胱 甘肽过氧化物酶来减少和消除在正常生理过程中产生的自由基。S0D和其他重要的抗氧化 酶的水平会随着年龄减退，从而成为与年龄有关的疾病的祸根。
[0005] 在1878年，当将试验动物暴露于纯氧时第一次提到了氧毒性，并且在1899年进一 步确立了这些有害作用。当将试验动物放入超过正常大气压的纯氧高压舱中时，试验动物 会在几分钟之内死亡。相比之下，当在持续数天的时间内缓慢提升纯氧的压力时，试验动物 会存活下来，这是因为它们的身体有时间产生高于正常的水平的可诱导抗氧化酶来使其免 受氧毒性。暴露于高于正常的氧浓度的动物的肺显示出由过多的氧（称为高氧的条件）导 致的大规模组织损伤。因此，在高于正常的浓度时，氧是一种毒性元素，而在正常压力下，允 许我们度过相当完整的物种特异性寿命（Knight JA.28(6)Ann Clin Lab Sci. (1998))。
[0006] 在19世纪以及20世纪早期，随着在深海潜水中呼吸高压空气的第一个案例的出 现（其中，氧中毒和氮麻醉引起了潜水员的死亡、麻痹或终生乏力），氧对人体的毒副作用 第一次显现出来。在第二次世界大战中的大不列颠战役中，每天呼吸数小时纯氧的飞行 员出现了肺气肿、肺损伤，并且出现了大大加速衰老的作用。在某些情况中，飞行员的外表 和举止看起来像高于其三倍年龄的人的外表和举止。氧毒性的最悲惨事件之一发生在20 世纪40年代后期，当时将新生儿放入了富氧恒温箱中。一些婴儿失明，这是因为他们的眼 睛组织还未积聚膳食抗氧化类胡萝卜素来使其免受高于正常的氧浓度的毒性作用（Reedy ΕΑ· 23 (2)Neonatal New31-8(2004))。
[0007] 各种衰老的自由基理论以及衰老的氧自由基理论都假定衰老以及衰老的退行性 疾病主要由好氧生物的氧利用引起。在地球生命的进化过程中，植物演化出如下驾驭太阳 能的方法，即通过光合作用来利用二氧化碳并释放氧作为毒性代谢产物。动物的最终进化 具备了大大提高的移动能力，然而，由于需要更多的能源来穿越海洋和在陆地上漫步，因此 它们演化出在提高氧的气氛下直接呼吸由植物群产生的氧的方式。它们的细胞演化出能够 以四步还原过程利用细胞色素氧化酶将氧还原成水的线粒体。虽然氧分子本身不具独特的 化学活性，但是其能够在还原反应过程中产生强效的化学活性中间体。氧的部分还原形式 最终在四步中转化，附着四个电子产生水并且将由氧的还原反应释放的能量存放于通用的 储存分子ATP中。
[0008] 利用细胞色素 C氧化酶，接近80%的氧在线粒体中被还原成水，只有1%的电子 (超氧化物）跨越超氧自由基的初始形成之间的传递阶段I漏入末端细胞色素 C氧化酶。 氧从一端进入，水从另一端出来，其被完全还原，极少形成可检测的自由基中间体。不幸地， 在好氧生物中，随着单电子附着于氧分子，发生20 %的氧还原反应，在此，细胞色素氧化酶 没有被利用。这通常在遵循泡利不相容原理的量子定律的含铜和铁的酶存在的情况下发 生，其中，单电子必须附着于氧原子，这是因为氧分子的各氧原子中的非成对电子具有相同 的平行自旋且根据量子力学任何时候都禁止附着多于一个的平行电子。
[0009] 单电子附着于氧分子形成100%化学计量产率的超氧自由基。在生物系统中，超氧 化物是首先形成的自由基。第二个电子附着于氧分子产生过氧化氢，第三个电子附着于氧 分子产生氢氧自由基，以及附着的第四个电子将氧还原成水。
[0010] 炎性级联反应
[0011] 就氧化应激而言，已建立了良好的炎症与各种疾病之间的关联，尤其是衰老，但 是近期才证实了这两种破坏性途径之间的关系。它首次发表是关于始于20世纪80年 代的HIV流行病，此时，发现了 N-乙酰半胱氨酸的益处，其是膳食半胱氨酸的较低毒性 来源，且是谷胱甘肽过氧化物酶的合成中的直接前体和限速因子。研究人员证实，感染 HTV的个体在其循环T细胞中具有降低的细胞内GSH水平。由于GSH是细胞内抵抗R0S 的产生的首要小分子，因此研究人员假设观察到的GSH的降低是由持续暴露于提高的炎 性细胞因子的水平而导致的慢性氧化应激引起（R〇ederer，M，et al，8(2)ADDS Res Hum Retroviruses209-17(1992))。近来，糖尿病被证实与活性氧簇的产生和抗氧化防御之间的 明显失衡（称为氧化应激的情况）有关（Helmut Seiss，1990)，其导致应激信号传输途径 的改变，从而最终导致终末器官的损伤，即，胰岛上的β细胞。氧化应激和代谢炎症上调促 炎性细胞因子的表达，包括组织坏死因子α、单核细胞趋化蛋白-1、白介素-6,以及活化应 激敏感激酶，诸如c-Jun氨基末端激酶（JNK)、磷酸化激酶C异构体、裂原活化蛋白激酶和 kappa B抑制剂的激酶（Lamb, RE, Goldstein, BJ, 62(7) Int J Clin Practl087-95 (2008))。
[0012] 二氢槲皮素
[0013] 二氢槲皮素是生物类黄酮。类黄酮显示出广泛的生物化学和药学性质，其最突出 的特征在于起到化学预防活性的作用，该化学预防活性由化学预防指数（作为标志物用于 筛选潜在药剂）测量。二氢槲皮素，也称为紫杉叶素，在细胞中展现出高解毒能力以及较低 的细胞毒性，这代表了一种高化学预防指数。它已证明能够调节一些基因的表达，包括那些 对解毒酶、细胞周期调控蛋白、生长因子和DNA修复蛋白的编码。近期基因微阵列研究结 果表明，在紫杉叶素存在的条件下，II相解毒酶（NQ01和GSTM1)被上调，然而I相解毒酶 (CYP2El)被下调（Lee，SB等人，30(6)BiolPharmBulll074-1079(2007))。对人肺胚胎 成纤维细胞（TIG-1)和人脐静脉内皮细胞（HUVE)进行了细胞毒性的测量，并且二氢槲皮素 在十种测试的类黄酮中表现出最低的细胞毒性，其中，二氢槲皮素在TIG-1细胞中具有大 于300微摩尔的50 %的致死浓度以及在HUVE细胞中具有大于200微摩尔的50 %的致死浓 度（Matsuo, Μ 等人，28 (2) Biol Pharm Bui 1253-9 (2005))。
[0014] 二氢槲皮素是一种强效抗氧化剂且是一种在食品中使用的物质，其显 著降低自由基氧簇和活性氮簇的不良反应（Valko, Μ等人，39 (1) Int J Biochem Cell Biol.44-84(2007) ；Kostyuk VA,Potapovich AI,355(1)Arch Biochem Biophys43-8 (1998) ； So 1iman KF&Mazz io EA,218 (4)Proc Soc Exp Biol Med390-7(1998))。它被发现在类黄酮的生物合成途径中是一种基本分子中间体，其负责 槲皮素、低聚原花青素（0PC)和儿茶素的形成，并且已多次证明了其作为抗氧化剂的优越 性（Tiukavkina NA，Rulenko LA, Kolesnik LA，6Vopr Pitan. 12-5 (1997) ;Teselkin，10,et al，41 (3)Biofizika. 620-4 (1996))。
[0015] 二氢槲皮素保护细胞膜免受自由基损害、改善毛细血管的活性及有助于全身血液 微循环的恢复。正如所示，氧化应激被减少至细胞水平，例如在培养的肾细胞中（Areias，FM 等人，62 (1) Biochem Pharmacol. 111-8 (2001))。
[0016] 由于二氢槲皮素对包括血细胞在内的人体细胞具有渗透性，因此已证明二氢槲皮 素能够在细胞水平上提供可靠的保护来远离各种活性自由基簇。
[0017] 在人体中，与普通槲皮素相比，二氢槲皮素的血浆浓度会保持得更高且更长，这 是因为二氢槲皮素不会被体内的酶分解为较低活性的化合物，从而在速度或数量上达到 槲皮素的程度。此外，在细菌致突变试验中，二氢槲皮素的致突变性比槲皮素低400倍； 对于DHQ，槲皮素具有4nmol至1626nmol的最低致突变剂量（Jurado, J.，et al.，6 (4) Mutagenesis289_95(1991))。
[0018] 已证明二氢槲皮素在活化的人中性粒细胞中能够抑制鲁米诺依赖的化学 发光（CLlum)产生（T Hart，Chem Biol Interact. 1990 ;73 (2-3):323-35)，并且能 够在炎症期间抑制活化的人中性粒细胞的粘附（Wang.，YH.等人，67 (12) Biochem Pharmacol2251-62 (2004))。据报导二氢槲皮素保护吞噬细胞免受二氧化娃诱导的损伤 (Kostyuk VA, Potapovich AL;355(l)Arch Biochem Biophys43_8(1998))。二氧懈皮素在 肥大细胞中已显示出作为组胺释放的抑制剂的活性（Bronner C, Landry Y., 16(3)Agents Actionsl47-51(1985))〇
[0019] 由于这些性质也有助于这种类型的化合物的抗氧化性能，因此测定了仿生体 系中儿茶素和紫杉叶素的分配系数。基于带有不同电荷的胶束（获得了两性离子和阳 离子胶束的最高值）的化合物的静电相互作用，测定了 log Ρ值。通过由铜催化且由 芬顿反应诱导的8-羟基-2' -脱氧鸟苷的氧化，评估了化合物的促氧化性能。在该特定 体系中，获得的数据显示出研究中的类黄酮没有体现促氧化活性（Teixeiria，S，39(8) Free Radic Biol Medl099-108(2005))。类黄酮、尤其是二氢槲皮素还有助于心血管功 能。已证明它能够抑制脂氧合酶，该酶参与脂肪酸双层中脂质的氧化（Wheeler, E.L. and Berry, D. L.，7(l)Carcinogenesis33_6(1986))。与维生素 C 结合，二氢槲皮素能够提高 红细胞变形性且降低它们的聚合（Plotnikov, MB.，et al，104(12)Zh Nevrol Psikhiatr Im S S Korsakova33-7 (2004))。还证明二氢槲皮素能够改善微粒体对脂质过氧化的抗性 (Kravchenko LV, Morozov SV, Tutel'yan V. A. , 136 (6)Bull Exp Biol. :572-5(2003)) 〇
[0020] 与维生素 A、C和E相比，二氢槲皮素是一种更加强效的抗氧化剂，这可由有关氧 自由基吸收能力（0RAC)的美国农业部（USDA)的比较性排名来表明，并且受到其他研究的 支持，诸如对抗过氧自由基的基于细胞的抗氧化保护分析（CAP-e)，该分析用于测试含有抗 氧化剂的天然产品是否能够进入活细胞以及使保护活细胞免受氧化性损伤。因此，如果在 CAP-e分析中看到任何保护作用，则其表明由产品引起的生物学意义上的抗氧化保护。
[0021] 过氧化物自由基与脂肪酸和其他脂质的氧化性损伤有关，并且证实为什么自由 基，诸如过氧化物自由基和氢氧自由基，能够引起比预料的损害大得多损害，这是因为自由 基在脂质中产生了增殖阶段。根据有关的化学反应，主要的抗氧化能力分析基本分为两大 类：（1)基于氢原子转移（HAT)反应的分析和（2)基于单电子转移（ET)反应的分析。
[0022] 大多数的基于HAT的分析采用竞争性的反应方案，其中，抗氧化剂和底物通过偶 氮化合物的分解来竞争由热产生的过氧自由基。还可以采用0RAC和CAP-e作为用于抑制 诱导的低密度脂蛋白氧化和其他氧自由基吸收的分析方法。ORAChydro (水溶性成分抗氧化 值）和CAP-e测试由二氢槲皮素产生的氢原子转移（HAT)竞争由热产生的过氧自由基和氢 氧自由基的能力。对于后者，有必要使用H0RAC分析测试。不像基于电子转移的分析测量 抗氧化剂的还原能力，而基于HAT的分析测量氢原子给予能力。氢原子转移在自由基链反 应中是关键步骤。因此，基于HAT的分析与阻断自由基链式反应的抗氧化能力更相关。
[0023] 在所有基于HAT的分析方法中，0RAC和CAP-e采用一种AUC (曲线下面积）技术 来量化抗氧化能力。AUC方法的优点是，能够同样良好的应用于体现不同滞后期的抗氧化剂 以及那些不具有滞后期的样品。该方法统一了滞后时间法和初始速率法，并且尤其对食物 样品有用，其经常含有多种成分且具有复杂反应动力学。
[0024] 因此，0RAC和CAP-e分析作为量化抗氧化能力可选的方法被广泛地应用于院校 和食品补充剂行业。事实上，已经建立了应用0RAC分析结合总酚类分析的抗氧化剂数据 库。所测量的我们的二氢槲皮素的ORAChydro值是，每412. 3mg的胶囊为3, 890微摩尔的 Trolox(水溶性维生素 E)当量，或者每克为28, 000微摩尔的Trolox当量。所测量的我们 的二氢槲皮素的CAP-e值是9. 9CAP-e单位每克。
[0025] 西伯利亚和兴安落叶松物种（落叶松物种：L. dahurica L.、L. gmelinii、 L. sibirica ledeb.，通常也称为西伯利亚和蒙古落叶松）是公认的商业上可用的大量二氢 槲皮素的优异来源。
[0026] 维生素 C
[0027] 维生素 C (抗坏血酸）的生物学功能主要基于其能够为各种生物化学反应提供还 原力。由于它的还原力，维生素 C能够还原大多数生理相关的活性氧簇。由此，维生素 C通 过细胞内外途径主要起如下作用：作为辅助因子用于要求还原的铁或铜金属酶的还原反应 以及作为保护性抗氧化剂在水相中发挥作用。
[0028] 已知维生素是八种人类酶的电子给体。它们中的三种酶参与胶原蛋白羟基化反 应，两种被用于肉毒碱的生物合成以及三种被用于激素和氨基酸的生物合成。因此，维生素 C在铁吸收、胶原蛋白形成、骨骼生长和氨基酸代谢中起作用。维生素 C参与神经系统的一 些激素组分的合成与调节，且帮助保持牙齿、牙龈、软骨、肌肉、血管的健康和免疫系统的健 康。
[0029] 次氯酸产自源于免疫应答细胞的过氧化氢，从而利用次氯酸来杀死入侵的外源蛋 白，诸如病毒和细菌，但是次氯酸还会损害正常的人体蛋白。为了提供抗氧化保护，成人的 维生素 C的推荐膳食供给量（RDA)将女性设为75mg/day且将男性设为90mg/day。该摄入 量可以以较少的尿排泄来保持接近最高的中性粒细胞抗坏血酸浓度。
[0030] 由于吸烟者处于提高的氧化应激和维生素 C的代谢转换状态，因此他们的推荐摄 入量提高了约35mg/day。正如在人类临床试验中所显示，包含维生素 C的试剂应当符合或 超过这些推荐量，并且理想地应当包含二氢槲皮素作为维生素 C的增效剂和再生剂。这两 种保健品都是由高低亲和性转运蛋白介导的。由于稳态调节，抗坏血酸的生物半衰期从8 至40天不等，并且与抗坏血酸体库相反。小于300mg的总体库与人的坏血病症状有关，然 而体库的最大值被限制在约2-4g。
[0031] 二氢槲皮素和维生素 C的结合，在俄罗斯也称为Ascovertin(商品名），已在患 有血管性脑病的患者中用于改善细胞流变学指标，这些指标包括集合的降低、红细胞变 形性的提高以及红细胞膜和血楽中脂质过氧化的降低（Plotnikov, MB, 104 (12) ZhNevrol Psikhiatr Im S S orsakova33-7(2004))。它还被证明能够保护大鼠视网膜细胞免受紫外 线造成的损伤（Logvinos，SV 等人，140 (5) Bull Exp Biol Med. 578-81 (2005))。
[0032] 阿拉伯半乳聚糖
[0033] 许多草本植物很好地确立了免疫增强性质，诸如紫松果菊、赝靛、金钟柏，当归和 姜黄（Curcuma longa)也含有大量的阿拉伯半乳聚糖。在用于免疫增强的药用草本植物中 经常能够发现多糖，包括松果菊和黄芪。
[0034] 阿拉伯半乳聚糖是一种长且密的支链多糖，其具有6, 000至120, 000或更大的分 子量，并且发现于多种可食用的和不可食用的木本植物的细胞壁中。阿拉伯半乳聚糖是带 有适度甜味的细小、干燥、类白色粉末，其能够与液体良好混合。该安全而有效的植物化学 成分被FDA GRAS批准可作为膳食纤维（甚至以大剂量）和食品添加剂来使用（5(5)Altern Med Rev463-6(2000)(没有列出作者））。唯一报道的副作用是少量摄取它的人出现偶尔的 肿胀和肠胃胀气。
[0035] 西部落叶松树（Larix occidentalis)的木材能够从其内皮提供大量的免费阿拉 伯半乳聚糖。由于阿拉伯半乳聚糖具有有效的生物学活性和免疫增强性质，该独特的膳食 纤维正作为一种临床上有用的营养剂而受到关注。
[0036] 落叶松作为药物使用是因为这些多糖对肠道和免疫系统的作用。落叶松阿拉伯半 乳聚糖是一种不易消化的可溶性膳食纤维，其能够抵抗酶的分解，完好无损地进入大肠，在 此被结肠细菌发酵。许多可食用的和不可食用的植物是阿拉伯半乳聚糖的丰富来源，包括 亜菜种子、胡萝卜、萝卜、黑豆（black gram beans)、梨、玉米、小麦、红葡萄酒、意大利黑麦 草、西红柿、豚草、高粱、竹草、椰肉和牛奶。
[0037] 阿拉伯半乳聚糖在落叶松树（Larix spp.)中最为丰富，落叶松阿拉伯半乳聚糖可 以提取自西部落叶松（Larix occidentalis),或西伯利亚落叶松和兴安落叶松（落叶松物 种：L. dahurica L.、L. gmelinii、L. sibirica ledeb.)，前面已提到通常称为西伯利亚落叶 松和蒙古落叶松。西部落叶松使用最为普遍。
[0038] 免疫调节
[0039] 阿拉伯半乳聚糖支持免疫系统功能的健康（Sch印etkin，IA，5 (13-14) Int Immunopharmacol 1783-99. (2005))。特别地，落叶松阿拉伯半乳聚糖提高有益的免 疫细胞水平，诸如白细胞，且不会刺激促炎性免疫细胞产生或活化（Kelly，GS，4(2) Altern Med Rev96-103(1999))。落叶松阿拉伯半乳聚糖降低骨髓中淋巴样细胞的产生 (Currier, NL, 10 (2-3) Phytomedicine: 145-53 (2003))。落叶松阿拉伯半乳聚糖高效促进 体外和体内的巨噬细胞增殖，从而体现抗炎性、抗补体性和抗过敏作用（Kim LS, Waters RF, Burkholder ΡΜ·, 7(2)Altern Med Revl38-49(2002))。
[0040] 一些研究已经证实落叶松阿拉伯半乳聚糖在动物体重具有抗癌活性。在一项1987 年发表于癌症研究和临床肿瘤学杂质的研究中，研究人员测试了他们的理论：在动物体内， 器官特异性凝集素（代表一种蛋白）帮助测定恶性肿瘤细胞将转移至何处。注射阿拉伯 半乳聚糖被证实能够在小鼠肝脏中有效阻止这些凝集素，从而能够防止这种小鼠癌的扩散 (Beuth，J·， 113(1)J Cancer Res Clin 0ncol51-5(1987))。
[0041] 该研究被德国科隆的研究人员成功复制，并于1988年发表（BeuthJ.，6 (2) Clin Exp Metastasisll5-20(1988))。在1991年的瑞典的类似研究发现，用阿拉伯半乳聚糖 预处理试验动物减少了肝脏转移数量并延长了存活时间（Hagmar B.，Ryd W.，Skomedal Η·，11 (6)Invasion Metastasis348_55(1991)。
[0042] 在1999年刊登于替代医学评论中的落叶松阿拉伯半乳聚糖的研究评论报道了该 物质能够刺激自然杀伤细胞的活性，并且也能够增强免疫功能的其他方面（Kelly，GS，4 (2) Altern Med Rev96-103(1999))〇
[0043] 由于落叶松阿拉伯半乳聚糖能够刺激"自然杀伤"（NK)细胞的细胞毒性（一种针 对健康的功能性标志物），因此在某种程度上增强免疫应答。在医学文献的报导中，将降低 的NK细胞活性关联至多种慢性疾病，包括慢性疲劳综合症、病毒性肝炎、HIV/AIDS以及诸 如多发性硬化症的自身免疫疾病。改性的柑橘果胶在动物体内具有与落叶松阿拉伯半乳聚 糖相同的抗转移作用机制，但是无法提供免疫-调节作用。
[0044] 在一个合理控制的研究中，落叶松阿拉伯半乳聚糖诱导了干扰素 Y (TFNY)、肿瘤 坏死因子α、白介素-1 β (IL-1 β )和白介素-6 (IL-6)的释放的提高。这导致活化了免疫 系统的两种强效细胞：巨噬细胞和ΝΚ细胞。发现IFN γ对观察到的ΝΚ细胞毒性的增强负 有最大责任（Hauer J, Anderer FA.，36 (4) Cancer Immunol Immunother. 237-44 (1993))。
[0045] 其他研究表明落叶松阿拉伯半乳聚糖有助于由革兰阴性杆菌、尤其由大肠埃希氏 菌和克雷伯氏菌引起的小儿中耳炎的发作频率和严重程度的降低。
[0046] 消化
[0047] 消化不良非常普遍，并且影响着大量人群。低纤维且高蛋白和碳水化合物的典型 的美国饮食是这些消化不良盛行的因素。低水平的短链脂肪酸和提高的氨水平与该类型的 饮食有关。已表明摄入纤维、尤其落叶松阿拉伯半乳聚糖有助于对抗由不良饮食引起的有 害作用。已证实落叶松阿拉伯半乳聚糖能够提高短链脂肪酸、降低结肠的氨水平、提高结肠 中有益细菌的数量以及盖上免疫应答。落叶松阿拉伯半乳聚糖的这些有益作用能够积极调 解许多这些过于常见的肠道因素。
[0048] 肠道暴露于许多物质一从抗生素到原生动物寄生虫再到含糖加工食品一这在结 肠中造成了一种不利的氛围。其结果可以导致便秘、腹泻、念珠菌感染、寄生虫感染以及由 结肠健康欠佳引起的其他情况。结肠清洗是减少消化道暴露于每天遭遇的大量微生物的重 要方法。然而，相对而言，与填满有毒物质、寄生虫、致病酵母菌、真菌和细菌的结肠相比，正 常功能的结肠是非常干净的。
[0049] 落叶松阿拉伯半乳聚糖也被确信起到益生元的作用；它刺激结肠内双歧杆菌和乳 杆菌等细菌的生长，这些细菌能够给予一定的健康益处。落叶松阿拉伯半乳聚糖的摄取对 增强有益的肠道菌群具有巨大作用，尤其能够提升诸如乳杆菌的厌氧菌的数量（Robinson RR, Feirtag J, Slavin JL, 20(4)J Am Coll Nutr279-85 (2001)) 〇
[0050] 短链脂肪酸，主要指乙酸、丙酸和丁酸，是由结肠中膳食碳水化合物、特别是抗降 解淀粉和膳食纤维的发酵产生的，其在肠道健康中起重要作用。这些酸是结肠上皮细胞的 主要能量来源。阿拉伯半乳聚糖的非吸收纤维容易被远端肠道菌群发酵，从而使短链脂肪 酸的产量提升，主要是丁酸，还有较少量的丙酸。
[0051] 氨是在结肠中由蛋白和其他含氮物质的细菌发酵产生的副产物。研究表明，氨水 平低至5mmol/L对排列结肠的上皮细胞具有有害作用。氨对结肠上皮细胞的毒性能够导致 细胞损伤和提高这些细胞的转换。
[0052] 许多临床医生将益生元用作肠道疾病的补充剂，包括肠憩室病、肠道渗漏、肠道易 激综合症以及诸如克罗恩病和溃疡性结肠炎的炎性肠道疾病。研究证实，落叶松阿拉伯半 乳聚糖的消耗能够减少肠道氨的产生（Robinson, RR.，Feirtag J.，Slavin, JL.，20(4) J Am Coll Nutr279-85 (2001))。由于低氨水平对肠道的结肠细胞具有损害作用，因此落叶松阿 拉伯半乳聚糖能够支持不能够解毒氨的患者。
[0053] 落叶松阿拉伯半乳聚糖已被分离且以低分子量为特征：9kDalton的阿拉伯半乳 聚糖片段和37kDa的精制的阿拉伯半乳聚糖，其提取自西部落叶松且由相似分子量和组合 物的重复单元构成。9kDa的阿拉伯半乳聚糖可以通过在121°C下高压釜或通过暴露于存在 硼氢化钠的碱性溶液中从37kDa的阿拉伯半乳聚糖高产率地获得。由散射光强度法和沉降 平衡法测定的37kDa的阿拉伯半乳聚糖的重均分子量分别为37和38kDa。由散射光强度法 和沉降平衡法测定的9kDa的阿拉伯半乳聚糖的重均分子量分别为9. 1和9. 5kDa。
[0054] MALDI-T0F质谱显示阿拉伯半乳聚糖（9kDa)的分子量具有8. 3kDa的峰值分布。 阿拉伯半乳聚糖（37kDa)和阿拉伯半乳聚糖（9kDa)都显示出窄分子量分布（Mw/Mn约为 1.2)。阿拉伯半乳聚糖（37kDa)和阿拉伯半乳聚糖（9kDa)显示出近似相同的13C-NMR谱、 单糖组合物和糖键。从而提出阿拉伯半乳聚糖（37kDa)由阿拉伯半乳聚糖（9kDa)的共价 键二级单元构成。阿拉伯半乳聚糖（37kDa)和阿拉伯半乳聚糖（9kDa)结合分离的肝细胞 糖蛋白受体能够同样良好。因此，阿拉伯半乳聚糖（9kDa)能够作为候选用于指导药物递送 的肝细胞且在这方面的使用中比阿拉伯半乳聚糖（37kDa)更加令人期待。
[0055] 典型地，粉末形式的落叶松阿拉伯半乳聚糖以约3克每茶匙的浓度用茶匙或汤匙 给药。成人剂量的分剂量是每天一至三茶匙。
[0056] 由于其味道温和且在水或果汁中具有优异的溶解性，因此易于对儿童给药。临床 反馈显示出现偶尔的肿胀和肠胃胀气反应的个体的数量低于3%，且通常为女性。
[0057] 美国专利第4, 950, 751号（DeWitt，Jill E·)，转让给了南茜国际集团（Nanci Corporation International)，其公开了一种从原料中提取半乳聚糖的方法，包括如下步 骤：提供一定量的原料固体颗粒、形成用于半乳聚糖的颗粒和液体提取介质的混合物以及 回收提取的半乳聚糖。改进点在于，对混合物施加有效量的声波能量，从而增强半乳聚糖从 原料颗粒中的提取。
[0058] 美国专利第7, 241，461号（Myhill等人），转让给了生命线保健品公司（Lifeline Nutraceuticals Corp·)，其公开了一种具有至少约150mg的假马齿览提取物的组合物， 其中，上述假马齿苋提取物具有45%的假马齿苋皂苷和至少约225mg的水飞蓟（silybum marianum，水飞蓟（milk thistle))提取物。上述水飞蓟提取物具有在约70%和约80%之 间的水飞蓟素、至少约150mg南非醉爺（印度人参（ashwagandha))粉末和至少约75mg茶 树（绿茶提取物）。上述绿茶提取物具有98%的多酚，该多酚包含45%的表倍儿茶素没食 子酸和至少75mg的姜黄（姜黄（turmeric))提取物，该姜黄提取物具有95%的姜黄素。其 中，当以所需的有效量将上述组合物给药于哺乳动物时，该组合物提高至少一种抗氧化酶 的酶活性水平且降低硫代巴比土酸活性化学簇的血浆浓度水平，上述抗氧化酶包含超氧化 物歧化酶和过氧化氢酶。
[0059] 美国专利第5, 756, 098号（Price等人），转让给了蒙大拿大学（University of Montana)、拉瑞斯国际股份有限公司（Larex International Inc.)和皇冠钢铁厂有限公司 (Crown Iron Works Co.)，其公开了一种从纤维状木本植物原料回收具有阿拉伯半乳聚糖 的渗出物、压缩的植物纤维产物和萃取液的方法。上述方法包括：在不存在任何添加溶剂的 情况下挤压纤维状木本植物原料，从该纤维状木本植物原料回收具有阿拉伯半乳聚糖的液 体渗出物，以及从该纤维状木本植物原料回收一次压缩的植物纤维产物，并且用溶剂浸渍 上述一次植物纤维产物来回收萃取液和浸渍的植物纤维。
[0060] 美国专利第7, 288, 374号（Pincemail等人），转让给了 Probiox SA，其公开了一种 在确定具有引起氧化应激的危险因素的一组个体中测定氧化应激标志物的相对量的方法。 上述方法提供如下：测量全血或组分样品中至少10种不同氧化应激标志物的量，该样品取 自确定具有引起氧化应激的危险因素的一组个体中的各个个体，并且比较确定具有引起氧 化应激的危险因素的一组个体中的各氧化应激标志物的量与健康个体中测量的各氧化应 激标志物的量。在此确定了，相对于健康个体，在确定具有引起氧化应激的危险因素的一组 个体中氧化应激标志物的相对量。


【发明内容】

[0061] 本发明人发现，将有效抗氧化剂、二氢槲皮素与作为强效免疫调节剂的落叶松阿 拉伯半乳聚糖结合，可以有效干扰上调促炎性细胞因子的表达的氧化应激和代谢炎症的级 联反应。在所述公开内容的实施方式中，有效猝灭自由氧基的膳食补充剂组合物包含：
[0062] ?二氢槲皮素，也称为紫杉叶素；
[0063] ?抗坏血酸，也称为维生素 C ;和
[0064] ?阿拉伯半乳聚糖，具体是低分子量的落叶松阿拉伯半乳聚糖。
[0065] 上述组合物可以以胶囊、片剂、液剂、微粒体、栓剂或皮肤贴剂形式给药且可以包 含可药用的载体。

【具体实施方式】
[0066] 在下述描述中，为了对本发明提供更全面的描述，提出了大量具体细节。然而，对 于本领域的技术人员，没有这些具体细节也可以实施本发明。另一方面，为了不混淆本发 明，没有对公知特征进行详细描述。
[0067] 在
【发明内容】
、【具体实施方式】、权利要求和摘要中，可以涉及本发明的具体特征（包 括方法步骤）。将会理解的是，该公开包含这些具体特征的可能的组合。例如，如果某个特 定的特征被公开于本发明的特定方面或特定实施方式、或者特定权利要求中，则也可以在 可能的程度内将该特征与本发明的其它特定方面或实施方式结合，和/或用于与本发明的 其它特定方面或实施方式，以及通常可以用于本发明。
[0068] 本文中使用的术语"包括"及其语法上的等同意义是指其他组分、成分、步骤等是 任选存在的。例如，文章"包含"（或"其包含"）组分A、B和C可以指由组分A、B和C组成 (即，仅包含），或可以指不仅包含组分A、B和C，还可以包含一种或多种其他组分。如果此 处涉及的是包含两种或多种定义的步骤的方法，该定义的步骤可以以任意顺序或同时（除 了文章中排出了这种可能）进行，并且该方法可以包括一种或多种其他步骤，该一种或多 种其他步骤可以在任何定义的步骤之前进行、在两个定义的步骤之间进行或在全部定义的 步骤之后进行（除了文章中排出了这种可能）。
[0069] 本文中使用的后接数字或不定冠词"a"（指"one"（一个或一种））的术语"至少" 是指以上述数字开始的范围的起始点（基于变量的定义，该范围可以具有上限或不具有上 限）。例如，"至少one"或"至少a"是指1或大于1。本文中使用的后接数字的术语"最多" 是指以上述数字结束的范围的结束点（基于变量的定义，该范围可以是以1或〇作为下限 的范围或不具有下限的范围）。例如，"最多4"是指4或小于4,且"最多40% "是指40 % 或小于40%。如果在本公开文本中，一个范围是以"（第一个数字）至（第二个数字）"或 "（第一个数字）_(第二个数字）"的形式给出，则它的意思是，上述范围的下限是第一个数 字，上限是第二个数字。例如，〇-l〇mm是指范围的下限是0mm且上限是10mm。
[0070] 本文中使用的术语"或"作为连接词用于连接一系列可供选择的事物。本文中使 用的术语"和/或"作为连接词是指可以是两者中的一种或全部两种。
[0071] 在一个【具体实施方式】中，阿拉伯半乳聚糖是低分子量落叶松阿拉伯半乳聚糖， LAG。二氢槲皮素的含量可以是在约4mg至约450mg的范围内，维生素 C的含量是在7mg至 约700mg的范围内以及拉伯半乳聚糖的含量是在约38mg至约3000mg的范围内。
[0072] 更具体地，二氢槲皮素的含量是在约15mg至约150mg的范围内，维生素 C的含量 是在20mg至约200mg的范围内以及落叶松阿拉伯半乳聚糖的含量是在约12mg至约1500mg 的范围内。在其最具体的实施方式中，二氢槲皮素的含量为约50mg，维生素 C的含量为约 70mg以及落叶松阿拉伯半乳聚糖的含量为约500mg。
[0073] 上述组合物通过猝灭由引发氧化应激和炎症的级联反应的自由基有效增强落叶 松阿拉伯半乳聚糖的免疫调节性质，从而可以证明抗炎性和抗过敏性质，或者免疫功能的 增强。
[0074] 在一个附加实施方式中，由组合物引起的自由基的猝灭进一步提高血细胞的适应 性来调节微脉管系统。
[0075] 在另一实施方式中，在抗坏血酸-抗坏血酸氧化酶反应混合物中，二氢槲皮素与 落叶松阿拉伯半乳聚糖积极影响抗坏血酸自由基的初期强度以及延长抗坏血酸自由基的 寿命。
[0076] 在又另一实施方式中，由组合物引起的自由基的猝灭进一步保持胶原蛋白健康和 刺激体内胶原蛋白的产生。
[0077] 在一个附加实施方式中，由组合物引起的自由基的猝灭进一步维持毛细血管强度 和帮组调节毛细血管渗透性。
[0078] 在另一实施方式中，上述组合物进一步清除活性氧物质和活性氮物质（R0S-RNS)， 诸如氢氧自由基、过氧自由基、超氧自由基、过氧亚硝酸自由基和氮氧自由基，以及单态氧 和次氯酸。
[0079] 在另一实施方式中，由组合物引起的自由基的猝灭进一步对眼睛提供实质性保护 以免受紫外线产生的自由基损害。
[0080] 在另一实施方式中，由组合物引起的自由基的猝灭对中性粒细胞进一步提供抗氧 化保护。
[0081] 在另一实施方式中，由组合物引起的自由基的猝灭进一步提供抗氧化保护来抵抗 在吞噬作用过程中产生的R0S。
[0082] 在另一实施方式中，由组合物引起的自由基的猝灭在精液中进一步提供抗氧化保 护，以抵抗对精子DNA的氧化性损害。
[0083] 在另一实施方式中，由组合物引起的自由基的猝灭通过在R0S引发细胞膜或脂肪 酸脂质过氧化之前清除水相中的R0S来进一步防止LDL氧化。
[0084] 在另一实施方式中，由组合物引起的自由基的猝灭进一步使维生素 E恢复至其还 原态。
[0085] 在另一实施方式中，维生素 C以二氢抗坏血酸形式存在，该形式更容易渗透血细 胞膜和肠道细胞膜，之后，二氢抗坏血酸（即维生素 C的氧化形式）在细胞内被还原为抗坏 血酸（即维生素 C的还原形式）。
[0086] 在另一实施方式中，由组合物引起的自由基的猝灭进一步增强维生素 C在细胞质 中的定位和在血浆中的细胞内积聚。
[0087] 本发明人还公开了一种增强落叶松阿拉伯半乳聚糖的免疫调节性能的方法，其通 过给药上述包含二氢槲皮素、维生素 C和阿拉伯半乳聚糖的组合物来猝灭引发氧化应激和 炎症的级联反应的自由基的过量产生。
[0088] 在【具体实施方式】中，该方法包括由自由基的猝灭引起的各种附加益处。之所以自 由基的猝灭是有益的，是因为其提高血细胞适应性；保持胶原蛋白健康和刺激所述胶原蛋 白的产生；维持毛细血管的强度和调节毛细血管的渗透性；对眼睛提供实质性抗氧化保护 以免受紫外线产生的自由基损害；对中性粒细胞提供实质性抗氧化保护；提供实质性抗氧 化保护来抵抗在吞噬作用过程中产生的R0S ;对精液提供实质性抗氧化保护，以抵抗对精 子DNA的氧化性损害；在细胞膜或脂肪酸脂质过氧化之前通过清除水相中的R0S来防止 LDL氧化；使维生素 E恢复成其还原形式；有效协助维生素 C在细胞质中的定位和在血浆中 提供细胞内积聚。
[0089] 在又另一实施方式中，教导了将上述组合物给药至哺乳动物、尤其给药至人来调 节免疫系统的方法。该组合物显示出免疫刺激性质，并且该组合物可以用于控制炎症和过 敏反应。
[0090] 还教导如下方法，即在抗坏血酸-抗坏血酸氧化酶反应混合物中给药维生素 C来 提商抗坏血酸自由基的初期强度和所述抗坏血酸自由基的寿命。
[0091] 在又另一实施方式中，公开了一种用于猝灭活性氧物质和活性氮物质的方法，包 括氢氧自由基、过氧自由基、超氧自由基、过氧亚硝酸自由基、氮氧自由基、单态氧和次氯 酸。
[0092] 在又另一实施方式中，将落叶松阿拉伯半乳聚糖的免疫刺激性质的增强用在如下 方法中，即通过将权利要求6的组合物给药至哺乳动物来调节免疫系统的方法。该方法可 以用于控制炎症和过敏反应，或用于增强免疫功能。
[0093] 在又另一实施方式中，公开了一种方法，其中，维生素 C以二氢抗坏血酸的形式存 在，该形式更容易渗透血细胞膜和肠道细胞膜，之后，二氢抗坏血酸在细胞内被还原为抗坏 血酸。
[0094] 虽然本发明通过参考优选的实施方式进行了具体的展示和说明，但是本领域的技 术人员应当理解，在不脱离本发明的权利要求的精神和范围的情况下，可以进行各种形式 的变形和细化。本领域的技术人员将会识别或无需额外的常规实验就可以确认许多等同于 本发明的【具体实施方式】所描述的具体内容。这种等同也包含在本发明的权利要求的范围 内。
【权利要求】
1. 一种膳食补充剂组合物，包含： 二氢槲皮素； 维生素 C ;和 阿拉伯半乳聚糖。
2. 如权利要求1所述的膳食补充剂组合物，其中，所述阿拉伯半乳聚糖以落叶松阿拉 伯半乳聚糖形式存在。
3. 如权利要求2所述的膳食补充剂组合物，其中，所述落叶松阿拉伯半乳聚糖具有在 约9. lkDas和约37kDas之间的分子量。
4. 如权利要求2所述膳食补充剂组合物，其中，所述组合物被配制成胶囊、片剂、液剂、 微粒体、栓剂或皮肤贴剂形式给药。
5. 如权利要求3所述的膳食补充剂组合物，进一步包含可药用的载体。
6. 如权利要求2所述的膳食补充剂组合物，其中，所述组合物通过猝灭引发氧化应激 和炎症的级联反应的自由基来有效增强所述落叶松阿拉伯半乳聚糖的免疫调节性能。
7. 如权利要求6所述的膳食补充剂组合物，其中，所述二氢槲皮素和落叶松阿拉伯半 乳聚糖从西伯利亚落叶松和兴安落叶松的锯材原木和树皮中提取。
8. 如权利要求6所述的膳食补充剂组合物，其中，所述二氢槲皮素的含量是在约4mg至 约450mg的范围内，所述维生素 C的含量是在7mg至约700mg的范围内，以及所述落叶松阿 拉伯半乳聚糖的含量是在约38mg至约3000mg的范围内。
9. 如权利要求8所述的膳食补充剂组合物，其中，所述二氢槲皮素的含量是在约15mg 至约150mg的范围内，所述维生素 C的含量是在20mg至约200mg的范围内，以及所述落叶 松阿拉伯半乳聚糖的含量是在约12mg至约1500mg的范围内。
10. 如权利要求9所述的膳食补充剂组合物，其中，所述二氢槲皮素的含量为约50mg， 所述维生素 C的含量为约70mg，以及所述落叶松阿拉伯半乳聚糖的含量为约50mg。
11. 如权利要求6所述的膳食补充剂组合物，其中，自由基的所述猝灭提高血细胞的适 应性。
12. 如权利要求6所述的膳食补充剂组合物，其中，自由基的所述猝灭保持胶原蛋白健 康以及刺激人体产生所述胶原蛋白。
13. 如权利要求6所述的膳食补充剂组合物，其中，自由基的所述猝灭维持毛细血管的 强度和调节毛细血管的渗透性。
14. 如权利要求6所述的膳食补充剂组合物，其中，自由基的所述猝灭有效清除活性氮 物质。
15. 如权利要求6所述的膳食补充剂组合物，其中，自由基的所述猝灭有效防护眼镜免 受紫外线产生的自由基损害。
16. 如权利要求6所述的膳食补充剂组合物，其中，自由基的所述猝灭在中性粒细胞中 有效提供实质性抗氧化保护。
17. 如权利要求6所述的膳食补充剂组合物，其中，自由基的所述猝灭有效提供实质性 抗氧化保护来抵抗在吞噬作用过程中所产生的ROS。
18. 如权利要求6所述的膳食补充剂组合物，其中，自由基的所述猝灭通过防止对精子 DNA的氧化性损害来有效为精液提供实质性抗氧化保护。
19. 如权利要求6所述的膳食补充剂组合物，其中，自由基的所述猝灭通过在细胞膜或 脂肪酸脂质的过氧化之前清除水相中的ROS来有效防止LDL氧化。
20. 如权利要求6所述的膳食补充剂组合物，其中，自由基的所述猝灭有效使维生素 E 恢复至其活化状态。
21. 如权利要求6所述的膳食补充剂组合物，其中，所述维生素 C以二氢抗坏血酸形式 存在，且更容易地渗透血细胞膜和肠道细胞膜，之后，所述二氢抗坏血酸在细胞内被还原为 抗坏血酸，即，维生素 C的还原形式。
22. 如权利要求6所述的膳食补充剂组合物，其中，自由基的所述猝灭有效地显著协助 维生素 C在细胞质中定位以及在血浆中有效提供细胞内积聚。
23. -种增强落叶松阿拉伯半乳聚糖的免疫调节性能的方法，其包括如下步骤：通过 将包含二氢槲皮素、维生素 C和阿拉伯半乳聚糖的组合物给药至需要该组合物的哺乳动 物，猝灭引发氧化应激和炎症的级联反应的自由基，所述阿拉伯半乳聚糖以落叶松阿拉伯 半乳聚糖的形式存在。
24. 如权利要求23所述的方法，其中，自由基的所述猝灭进一步提高血细胞的适应性。
25. 如权利要求23所述的方法，其中，抗坏血酸-抗坏血酸氧化酶反应混合物提高抗坏 血酸自由基的初期强度和所述抗坏血酸自由基的寿命。
26. 如权利要求23所述的方法，其中，自由基的所述猝灭进一步保持胶原蛋白健康以 及刺激产生所述胶原蛋白。
27. 如权利要求23所述的方法，其中，自由基的所述猝灭进一步维持毛细血管的强度 和调节毛细血管的渗透性。
28. 如权利要求23所述的方法，其中，自由基的所述猝灭进一步清除自由基氧物质和 活性氮物质。
29. 如权利要求28所述的方法，其中，所述活性氧物质和活性氮物质（ROS-RNS)选自由 氢氧自由基、过氧自由基、超氧自由基、过氧亚硝酸自由基、氮氧自由基、单态氧和次氯酸盐 组成的组。
30. 如权利要求23所述的方法，其中，自由基的所述猝灭进一步对眼睛提供实质性抗 氧化保护来抵抗紫外线产生的自由基损害。
31. 如权利要求23所述的方法，其中，自由基的所述猝灭进一步对中性粒细胞提供实 质性抗氧化保护。
32. 如权利要求23所述的方法，其中，自由基的所述猝灭进一步提供实质性抗氧化保 护以抵抗在吞噬作用过程中产生的ROS。
33. 如权利要求23所述的方法，其中，自由基的所述猝灭通过防止对精子DNA的氧化性 损害为精液进一步提供实质性抗氧化保护。
34. 如权利要求23所述的方法，其中，自由基的所述猝灭通过在细胞膜或脂肪酸脂质 的过氧化之前清除水相中的ROS来进一步有效防止LDL氧化。
35. 如权利要求23所述的方法，其中，自由基的所述猝灭进一步使维生素 E恢复至其活 化状态。
36. 如权利要求23所述的方法，其中，当所述维生素 C以二氢抗坏血酸形式存在，所述 二氢抗坏血酸更容易渗透血细胞膜和肠道细胞膜，之后，所述二氢抗坏血酸在细胞内被还 原为抗坏血酸。
37. 如权利要求23所述的方法，其中，自由基的所述猝灭显著协助维生素 C在细胞质中 定位且在血浆中提供细胞内积聚。
38. -种调节免疫系统的方法，其通过将包含二氢槲皮素、维生素 C和阿拉伯半乳聚糖 的组合物给药至需要所述组合物的哺乳动物，所述阿拉伯半乳聚糖以落叶松阿拉伯半乳聚 糖的形式存在。
39. 如权利要求38所述的调节免疫系统的方法，其中，控制了炎症和过敏反应。
40. 如权利要求38所述的调节免疫系统的方法，其中，增强了免疫功能。
【文档编号】A61P29/00GK104159582SQ201280069969
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2012年8月17日 优先权日:2012年2月16日
【发明者】谢尔盖·菲利波夫, 伊戈尔·博戈罗多夫 申请人:弗拉维特普雷有限公司