原花青素衍生物的制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】一种原花青素衍生物，采用葡萄籽提取的原花青素与乙酸酐发生乙酰化反应制备。制备方法：新鲜的葡萄籽经粉碎、脱脂，加入60％乙醇水溶液为提取剂，在超声波提取器中震荡提取20min，重复提取三次，浓缩体积、低温离心过滤后，用乙酸乙酯萃取3次。萃取液用旋转蒸发仪蒸馏、浓缩得到红褐色原花青素。然后与乙酸酐乙酰化反应得到乙酰基原花青素。它也可以以60％乙醇水溶液为提取剂，温度50℃，浸提4次，每次1h。浸提浓缩、低温离心过滤后，用2倍量乙酸乙酯萃取。然后与乙酸酐乙酰化反应得到乙酰基原花青素。所述的原花青素衍生物，用于制备防治肿瘤的保健食品及药品。
【专利说明】原花青素衍生物的制备方法和应用
【技术领域】:
[0001]本发明属于医药【技术领域】，涉及原花青素衍生物的制备方法和用途，具体地说是涉及其在制备防治肿瘤保健食品和药品方而的应用。
【背景技术】:
[0002]原花青素，国外多称为procyanidine或proanthocyanidins,是一种由不同数量的儿茶素或表儿茶素单体聚合而成的天然植物化学物，广泛存在于桔、柠檬、橄榄、葡萄等多种植物体中，具有良好的抗氧化、清除自由基功效，在食品、保健品、药品等领域有较多应用。其中葡萄籽易于保藏和处理，并且含有丰富的原花青素，所以在现有的技术中多是以葡萄籽为原料提取原花青素。葡萄籽原花青素含有2-10个儿茶素单体，通常将含有2-4个单体的儿茶素称为低聚体原花青素(oligomersic procyanidine),含有4个以上单体的儿茶素称为高聚体原花青素(polymersic procyanidine)。目前认为低聚体原花青素的生物活性大于高聚体原花青素，高聚体原花青素的水溶性较差。因而在原花青素产品中低聚体成分含量高低成为评价产品质量的主要指标。
[0003]原花青素是由儿茶酚和表儿茶酸组成的低聚或多聚酚类化合物，具有抗氧化、清除自由基、抗炎和抗癌的生理活性。
[0004]因为原花青素在植物体内通常与蛋白质、多糖等以氢键和疏水键形式形成稳定的分子复合物，原花青素分子间也是如此。因此原花青素的提取剂，不仅要求对其有很好的溶解性，而且还必须有氢键断裂作用。因此有机溶剂和水的复合体系(有机溶剂占总体积的50%?70% )最适合提取。有机溶剂的提取能力顺序为丙醇< 乙醇< 甲醇<丙酮< 四氢呋喃，其中应用较多的是丙酮-水体系和甲醇-水体系。
【发明内容】
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[0005]本发明的目的为了克服目前原花青素二聚体及以上多聚体常温在水中溶解度不高的缺点，提供一种原花青素衍生物的制备方法。
[0006]本发明的优点是:制取的原花青素衍生物在常温下容易溶于水，利于吸收，以获得更好的治疗预防肿瘤的效果。
[0007]本发明是以如下技术方案实现的:
方法一
[0008]新鲜的葡萄籽经处理后，收集葡萄籽，自然风干。将干燥好的葡萄籽用粉碎机粉碎至30-40目。
[0009]称取IOOg上述处理好的滤渣I份，加入500mL锥形瓶中，在索氏提取器上用石油醚脱脂8h，去除脂溶性色素，抽滤，脱去溶剂和油脂。加入60%乙醇水溶液为提取荆，料液比1: 4，在超声波提取器中震荡提取20min，重复提取三次，合并提取液。提取液浓缩至原来体积一半时加入一定量饱和NaCI溶液。低温离心过滤后，用2倍量乙酸乙酯萃取3次。萃取液用旋转蒸发仪蒸馏、浓缩得到红褐色原花青素。[0010]将制取的原花青素100g加100ml乙酸酐、2ml浓硫酸，短暂加温30_50°C，剧烈乙
酰化反应开始。等反应液温度下降，反应终止，立即过滤得到乙酰基原花青素。然后用乙醇洗2-3次,干燥备用。
方法二
[0011]新鲜的葡萄经处理后，收集葡萄籽，自然风干。将干燥好的葡萄籽用粉碎机粉碎至30-40 目。
[0012]脱脂:为了实现对葡萄籽的综合利用，加入石油醚，葡萄籽:石油醚(重量/体积)=1: 3常温浸泡48h，间歇搅拌。抽滤，脱去溶剂和油脂。
[0013]将脱脂后的葡萄籽粉阴干，用5% NaCI溶液以1: 5料液比于室温下搅拌Ih以去除其中的蛋白质，抽滤，蒸馏水洗涤，滤渣阴干备用。
[0014]称取100g上述处理好的滤渣1份，以60%乙醇水溶液为提取剂，原料粒度为40-60目，料液比1: 12，浸提温度50°C，浸提4次，每次lh。浸提浓缩液加入一定量饱和NaCI溶液，低温离心过滤后，用2倍量乙酸乙酯萃取3次。萃取液用旋转蒸发仪蒸馏、浓缩得到红褐色原花青素。
[0015]将制取的原花青素100g加100ml乙酸酐、2ml浓硫酸，短暂加温30_50°C，剧烈乙
酰化反应开始。等反应液温度下降，反应终止，立即过滤得到乙酰基原花青素。然后用乙醇洗2-3次,干燥备用。
[0016]原花青素衍生物对肿瘤细胞抑制作用的实验
[0017]细胞及分组鼻咽癌XB-5-8F细胞系、食管癌TE8细胞系，均惠赠于新乡医学院肿瘤与信号传导实验室杨万才教授。原花青素衍生物的浓度为1.5mg/L(I组)、15mg/L(II组)、150mg/L(III组)、1500mg/L(IV组)培养液培养和正常培养液培养空白对照组(C组)
[0018]制备单细胞悬液用含双抗和10%小牛血清的RPM1-1640培养基制备单细胞悬液，调细胞浓度为5 X 105/ml。台盼兰计活细胞数，要求活细胞达97%以上。
[0019]加药方案取96孔板，每孔加入癌细胞悬液100 μ 1，每孔加药20 μ 1，每个浓度设三个孔，另设三个不加药的癌细胞对照孔。加药孔中各加入80 μ I含10%胎牛牛血清的RPM1-1640培养基，对照孔中各加入含100 μ I含10%胎牛血清的RPM1-1640培养基以使各孔的培养液量均为200 μ I
[0020]细胞培养5% C02，37°C培养。
6.MTT测OD值培养24h后，加入MTT(5mg/ml) 100 μ 1，共同孵育4小时。小心弃上清，加入DMSO ( 二甲基亚砜)150 μ I，振摇10分钟，测试各孔490nm的OD值。
[0021]细胞存活率)=实验孔光吸收值(A)/对照孔光吸收值(B) X 100%
[0022]统计学处理所有实验数据均以x±s(均数土标准差)表示，输入SPSS11.5软件进行处理，组间比较采用单因素方差分析。检验标准:α =0.05。
[0023]MTT实验结果(0D值与细胞活性成正比).[0024]XB-5-8F细胞5组XB_5_8F细胞的OD值比较:C组、I组与II组3组间无显著性差别；π?组、IV组的OD值小于C组、I组与II组；111组OD值小于IV组。上述结果具有统计学意义。(见表1)
表1XB-5-8F细胞MTT法实验结果
【权利要求】
1.一种原花青素衍生物，其特征在于采用葡萄籽提取的原花青素与乙酸酐发生乙酰化反应。
2.按权利要求1所述的原花青素衍生物的制备方法，其特征在于:新鲜的葡萄籽经粉碎、脱脂，加入60%乙醇水溶液为提取剂，料液比1: 4，在超声波提取器中震荡提取20min，重复提取三次，浓缩体积、低温离心过滤后，用2倍量乙酸乙酯萃取3次。萃取液用旋转蒸发仪蒸馏、浓缩得到红褐色原花青素。然后与乙酸酐乙酰化反应得到乙酰基原花青素。
3.按权利要求1所述的原花青素衍生物的制备方法，其特征在于:新鲜的葡萄籽经粉碎、脱脂，以60%乙醇水溶液为提取剂，料液比1: 12，浸提温度50°C，浸提4次，每次lh。浸提浓缩液加入一定量饱和NaCI溶液，低温离心过滤后，用2倍量乙酸乙酯萃取3次。萃取液用旋转蒸发仪蒸馏、浓缩得到红褐色原花青素。然后与乙酸酐乙酰化反应得到乙酰基原花青素。
4.按权利要求1所述的原花青素衍生物，其特征在于:原花青素衍生物在制备防治肿瘤的保健食品及药品中的用途。
【文档编号】A61K31/353GK103833718SQ201310142881
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2013年4月24日 优先权日:2013年4月24日
【发明者】千智斌, 牛秉轩, 孙冰, 马敬, 尹延彦 申请人:新乡医学院