用cyld抑制剂治疗中耳炎及其它病状的组合物和方法
【专利摘要】本发明部分地基于我们对于包括去泛素化酶CYLD的分子途径的研究。因此，本发明尤其特征性描述了表达CYLD或其生物活性变体(例如，包括催化结构域的变体)的核酸构建体、抑制CYLD的负调节剂(例如，PDE4B或JNK2)的表达的核酸、调整下游CYLD靶标(例如，Akt，通过抑制或促进下游靶标的表达)的表达的核酸、包含这些类型的构建体中的一种或多种的组合物(例如，药物组合物)、包括一种或多种本文所述的组合物和使用说明书的试剂盒、识别上调CYLD、下调CYLD的负调节剂或调整(例如，抑制)下游CYLD靶标(例如，Akt)的治疗剂(例如，消炎剂)的筛选方法和包括单独或组合地施用上述核酸、蛋白生物治疗剂和/或小分子以对付癌症、炎症和纤维化的各种治疗方法。本文所述的组合物可用于制备药物(例如，用于制备用以治疗癌症、炎症、纤维化或一种或多种本文所述的更具体病状的药物)。
【专利说明】用CYLD抑制剂治疗中耳炎及其它病状的组合物和方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年4月10日提交的美国临时申请61/622,486号的提交日的权 Mo
[0003] 关于联邦资助的研究的声明
[0004] 本发明在由国家卫生研究所（National Institutes of Health)颁发的许可编号 DC005843下在政府支持下完成。政府对本发明具有一定的权利。
【技术领域】
[0005] 本发明总体上涉及通过调整在受试者中的炎症反应，诸如响应病原体或化学刺激 剂引起的炎症反应而治疗或预防医学病状的方法。更具体地，一方面，本发明涉及用于上调 编码去泛素化酶CYLD(圆柱瘤蛋白（cylindromatosis))的基因的表达或所编码酶的活性 的组合物和方法。在其它方面，本发明特征性描述了调整影响CYLD或受CYLD影响的其它 细胞组分的组合物和方法。如下文进一步描述，所述组合物可包含两种活性剂。
【背景技术】
[0006] 炎症是组织对有害刺激物如病原体、受损细胞或刺激剂以及对机械性创伤、毒素 和肿瘤形成的复杂生物反应。炎症作为宿主对外来物质入侵的防御性反应而出现且分类成 急性炎症或慢性炎症。急性炎症为身体对有害刺激物的初始反应且通过增加血浆和白血球 从血液到损伤组织的移动来实现。级联生化事件传导了涉及局部血管系统、免疫系统和损 伤组织内的各种细胞的炎症反应且使其成熟。慢性（长期）炎症导致在炎症部位存在的细 胞类型中的渐进性转变且以组织因炎症过程同时毁坏和愈合为特征。
[0007] 过度炎症或炎症过程的延长可导致局部组织受损；感染后综合征，如在纤维化病 变中；和风湿性疾病，诸如系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎；或甚至炎症反应诱发的疾 病,诸如各种各样的糖尿病、动脉硬化、白内障、再灌注损伤和癌症。
【发明内容】
[0008] 本发明部分地基于我们对于包括去泛素化酶CYLD的分子途径的研究。因此，本发 明特征性描述了尤其是表达CYLD或其生物活性变体（例如，包括催化结构域的变体）的核 酸构建体、抑制CYLD的负调节剂（例如，PDE4B或JNK2)的表达的核酸、调整下游CYLD靶 标（例如，Akt，通过抑制或促进下游靶标的表达）的表达的核酸、包含这些类型的构建体中 的一种或多种的组合物（例如，医药组合物）、包括一种或多种本文所述的组合物和使用说 明书的试剂盒、识别上调CYLD、下调CYLD的负调节剂或调整（例如，抑制）下游CYLD靶标 (例如，Akt)的治疗剂（例如，消炎剂）的筛选方法和各种治疗方法。代替如上所述的核酸 或除了如上所述的核酸之外，所述组合物可包含以下物质且本发明的治疗方法可用以下物 质进行：增强CYLD的表达或活性、抑制CYLD的负调节剂的活性或调整（例如，阻遏）下游 CYLD靶标（例如，Akt)的活性的蛋白生物治疗剂或小分子。在所述治疗剂以TOE4B为靶标 时，所述治疗剂可为选择性地抑制roE4B同种型的表达或活性的治疗剂（与相对于例如另 一磷酸二酯酶如roE4A、PDE4C或TOE4D同种型而非选择性地抑制TOE4B同种型相反）。我 们可互换地使用术语"治疗剂"和"医药剂"。
[0009] 更具体地，本发明特征性描述了包含单一活性剂的组合物以及包含两种或多种活 性剂的组合物。虽然下文将进一步描述合适的制剂，但我们在此注意到所述组合物可配制 为药物组合物或任何活性治疗剂可在其中非常浓或另外不适合施用到患者的储备溶液。例 如，本发明特征性描述了包含作为单一活性医药剂或作为多种活性医药剂中的第一种的本 发明的核酸构建体（例如，如下核酸构建体，由其表达CYLD ;由其或通过其抑制TOE4B ;或 由其或通过其调整（例如，表达或抑制）Akt)的组合物。分子生物学领域现在已经全面发 展，且本领域的普通技术人员将熟悉可用以实现本文所述的结果的各种表达载体和系统。 可表达CYLD的核酸构建体例如可由许多质体或病毒载体形成。现在也熟知阻遏基因表达 的核酸构建体，其中所述核酸包括反义寡聚核苷酸、微RNAs和介导RNAi (例如，siRNA和 shRNA)的核酸。参见,例如题为"使用人造微RNA下调基因表达（Down-regulation of gene expression using artificial microRNAs)"的美国专利 8, 415, 526 号。所述组合物还可包 含作为单一活性医药剂或作为多种活性医药剂中的第一种的蛋白治疗剂，诸如抑制TOE4B 或Akt的抗体或促进CYLD的活性、抑制PDE4B或调整Akt的小分子（化合物）。第二活性 剂可例如为消炎剂，所述消炎剂也为核酸、蛋白治疗剂或小分子。所述第二药剂可例如为类 固醇（例如，地塞米松（dexamethasone))、非类固醇消炎药（例如，阿司匹林（aspirin)、布 洛芬（ibuprofen)或萘普生（naproxen))、免疫选择性消炎衍生物（例如，7-mer SGP-T或 3_mer FEG)、长春西丁（vinpocetine)、咯利普兰（rolipram)、罗氟司特（roflumilast)、西 洛司特（cilomilast)、Ro 20-1724或如在WO 2007/142929中所述的化合物。其它组合治 疗剂包括以下各物中的两种或多种：类固醇（例如，地塞米松）、非类固醇消炎药（例如，阿 司匹林、布洛芬或萘普生）、免疫选择性消炎衍生物（例如，7-mer SGP-T或3-mer FEG)、长 春西丁、咯利普兰、罗氟司特、西洛司特、Ro 20-1724或如在WO 2007/142929中所述的化合 物。例如，在一个实施方式中，本发明特征性描述了包含地塞米松和长春西丁的组合物（例 如,药物组合物）。
[0010] 上述药剂，不管是单独施用、组合在单一制剂中，还是仅通过单独的制剂施用到同 一患者，可用于本文所述的方法中以治疗罹患各种病状的患者，所述病状包括其中认为炎 症起到成因性作用或其中炎症为常见病征的病状。因此，本发明特征性描述了如下方法，其 包括向有需要的患者施用治疗有效量的本文所述的药物组合物的步骤。唯一或第一活性剂 可如上所述为核酸构建体、蛋白生物治疗剂或小分子。在包含第二活性剂时，所述第二活 性剂可例如为消炎剂，其也为核酸，或在其它实施方式中，其为小分子，诸如类固醇（例如， 地塞米松）、非类固醇消炎药（例如，阿司匹林、布洛芬或萘普生）、免疫选择性消炎衍生物 (例如，7-mer SGP-T或3-mer FEG)、长春西丁、咯利普兰、罗氟司特、西洛司特、Ro 20-1724 或如在WO 2007/142929中所述的化合物。可施用以治疗如本文所述的病状的其它组合治 疗剂包括以下各物中的两种或多种：类固醇（例如，地塞米松）、非类固醇消炎药（例如，阿 司匹林、布洛芬或萘普生）、免疫选择性消炎衍生物（例如，7-mer SGP-T或3-mer FEG)、长 春西丁、咯利普兰、罗氟司特、西洛司特、Ro 20-1724或如在WO 2007/142929中所述的化合 物。 toon] 本文所述的组合物可用于制备药物（例如，用于制备用以治疗癌症、炎症、纤维化 或本文更具体描述的病状中的任一种或多种的药物）。因此，本发明的另一实施方式包括如 本文所述的组合物在制造用于治疗如本文所述的病状的药物中的用途。
[0012] 可治疗的病状包括癌症、炎症和纤维化，其可影响许多不同的器官或器官系统。 在特定的实施方式中，用如本文所述的组合物治疗的病状可与在耳（单或双）、鼻或喉咙 中的炎症或粘液生产过剩相关，并且还可影响鼻道、在呼吸系统内的另一区域或组织（例 如，肺或支气管树）或窦腔或从窦腔延伸的通道。例如，所述病状可为间质性肺病、人类纤 维化肺病（例如，特发性肺纤维化（IPF)、囊性纤维化、呼吸窘迫综合征（成人（ARDS)或 婴儿）、肺病中的肿瘤基质、全身性硬化、Hermansky-Pudlak综合征（HPS)、煤矿工人尘肺 (CWP)、慢性肺动脉高血压、AIDS相关的肺动脉高血压等、哮喘、慢性支气管炎、慢性阻塞性 肺病（COPD)、咳嗽（例如，嗜酸性咳嗽）、肺纤维化、鼻炎（例如，过敏性鼻炎）、窦炎或中耳 炎。在其它实施方式中，用如本文所述的组合物治疗的病状可为人类肾病。例如，患者可具 有肾病综合征、阿尔波特氏综合征（Alport's syndrome)、HIV相关的肾病、多囊性肾病、法 布里病（Fabry's disease)、糖尿病性或其它肾病、肾小球性肾炎（例如，慢性肾小球性肾 炎）或与全身性狼疮相关的肾炎。如所提到的，本发明的组合物可有效抵抗纤维化，包括 在肝（肝纤维化）、心脏（心肌纤维化）和生殖系统（子宫内膜纤维化）中的纤维化病状。 在涉及到肝时，可治疗的病状还包括肝炎（不管是由病毒剂、自身免疫疾病、还是由滥用药 品引起）、肝性脂肪变性和肝硬化。在其它实施方式中，用如本文所述的组合物治疗的病状 可为心血管疾病，包括动脉再狭窄和动脉粥样硬化或心肌的再灌注损伤。在其它实施方式 中，用如本文所述的组合物治疗的病状可为癌症，且本发明的组合物可用以阻止肿瘤生长 和/或转移。可服从治疗的特定癌症包括硬皮病、在Li-Fraumeni综合征中的胶质母细胞 瘤、散发性胶质母细胞瘤、骨髓性白血病、急性髓性白血病、脊髓发育不良综合征、骨髓增生 性综合征，癌症如乳癌、肺癌、结肠癌（例如，Lynch综合征）、前列腺癌或妇科癌症（例如， 卵巢或子宫癌）和皮肤癌（例如，黑素瘤或卡波西肉瘤（Kaposi's sarcoma))。除了皮肤 癌或恶性增殖性皮肤病之外，本发明的组合物可用于治疗嗜酸粒细胞肉芽肿、其它良性皮 肤病如特异性皮炎（一种湿疹）和荨麻疹（urticaria)(通常称为荨麻疹（Hives))和疤 痕。在另一实施方式中，本发明的组合物和方法可应用到表现出组织变形的患者，该组织变 形通常被理解为响应在周围或慢性刺激中的改变而出现的良性改变。例如，在患者呼吸道 内的细胞和组织可响应烟气（例如，从烟草产品如雪茄或香烟吸入的烟气）而表现出组织 变形。虽然本发明不受此限制，但在这种情况下，刺激剂可促使加衬气管的粘液分泌纤毛 假复层柱状呼吸上皮细胞被复层扁平上皮替代。如所提到的，本发明的组合物可有效抵抗 炎性病状，包括影响胃肠道的那些病状。这些病状包括炎性肠病（例如，溃疡性结肠炎或克 罗恩氏病（Crohn's disease))，且本发明的组合物也可用于治疗胃酸的分泌亢进。在其它 实施方式中，用如本文所述的组合物治疗的病状可为神经病症或对神经系统（例如，外周 或中枢神经系统）的损伤。例如，所述病状可为脑的再灌注损伤、抑郁症、记忆障碍、单极 性抑郁症、帕金森病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、脊髓创伤、颅脑损伤、神经原性炎症或 疼痛。日益证明神经降解性病症和损伤具有重要的炎性组分，且任何所述病症或损伤都可 用本文所述的组合物治疗。在其它实施方式中，用如本文所述的组合物治疗的病状可为自 身免疫病症，诸如多发性硬化、类风湿性关节炎、Grave氏眼病、牛皮癣或尿崩症。也可治疗 移植排斥和移植抗宿主病。在其它实施方式中，用如本文所述的组合物治疗的病状可为与 细菌或病毒病原体相关的感染疾病。例如，所述病状可为由链球菌（streptococcus)属的 细菌（例如，肺炎链球菌（S. pneumoniae),有时称为肺炎球菌（pneumococcus)或产脓链球 菌（S. pyogenes))、不可分型流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae) (NTHi)或绿脓杆菌 (Pseudomas aeruginosa)引起的感染疾病。其它可治疗的感染疾病与病毒（例如，呼吸道 合胞病毒或流感病毒）相关。还可治疗汉森氏病（Hansen's disease)，细菌、真菌或病毒诱 发的脓毒症或脓毒性休克（内毒素休克）。在其它实施方式中，用如本文所述的组合物治 疗的病状可影响生殖或泌尿生殖组织或器官。例如，所述患者可为罹患与生殖器官的炎症 相关的医学病状（例如，前列腺炎、盆腔炎或引起生殖组织或器官的炎症的感染疾病）的患 者。在其它实施方式中，用如本文所述的组合物治疗的病状可影响骨骼肌肉系统。例如，患 者可罹患炎症性关节炎、骨关节炎、骨质疏松、炎症和细胞因子介导的慢性组织变性、肌肉 耗损、恶病质或关节强硬性脊椎炎。在其它实施方式中，用如本文所述的组合物治疗的病状 可为药物诱发的麦角中毒、过敏性结膜炎、春季结膜炎、肥胖症或胰腺炎。
[0013] 涉及治疗性或预防性治疗的本发明方法中的任一种可包括识别需要治疗的患者 的步骤（例如，通过进行诊断性试验或测定）。例如，医师或其它保健提供者可识别显示炎 症病征如温度升高、发红、肿胀和功能丧失（例如，在如本文所述的组织、器官或系统中）的 患者。所述患者还可能诉苦疼痛或僵硬。在所述病状包括异常细胞增殖的情况下，医师或 其它保健提供者可用适当诊断工具（例如，癌症生物标志物和成像剂）类似地评定患者。 因为本发明涵盖兽医应用，所以所述患者可为人类或另一哺乳动物，诸如驯化宠物（例如， 猫或狗）、家畜、马或被关（例如，在动物园中）的动物。我们可互换地使用术语"患者"和 "受试者"。本文所述的方法可适用于任何年龄的受试者。例如，在所述患者为人类的情况 下，所述人类可为婴儿或儿童。
[0014] 在一个实施方式中，本发明特征性描述了治疗罹患与在耳（单或双（例如，中耳 炎））、鼻、鼻道、在呼吸系统内的另一组织或器官（例如，肺或支气管树）或窦腔或从窦腔 延伸的管道、口腔和/或喉咙中的炎症或粘液生产过剩相关的医学病状的患者的方法。因 此，所述病状可定义为与下呼吸道和/或上呼吸道相关的病状。所述方法可通过向所述患 者施用治疗有效量的本文所述的药物组合物来进行。"有效量"是指引起临床有益反应的 治疗剂或医药剂的量。如上所述，所述方法涵盖包括婴儿和儿童的多种受试者的治疗。下 调Akt基因的表达的药剂可为抑制Akt基因的核酸（例如，反义寡聚核苷酸、微RNA或介导 MAi的核酸）。在一个实施方式中，抑制所编码激酶的活性的所述药剂可为表达使Akt去 泛素化的酶（例如，酶CYLD)的核酸构建体。在另一实施方式中，抑制所编码激酶的活性的 所述药剂可为VQD-002、哌立福新（perifosine)或米替福新（miltefosine)。如所提到的， 所述药物组合物可配制成适合耳局部或鼻施用。
[0015] 上调CYLD的表达的所述药剂可为磷酸二酯酶4 (PDE4(例如，PDE4B))的抑制剂或 c-jun N-末端激酶2 (JNK2)的抑制剂。在任何情况下（即，在本发明的任何方面或实施方 式中），所述TOE4的抑制剂可对TOE4B具有特异性。例如，所述抑制剂可为抑制TOE4B、但 不显著抑制TOE4D的抑制剂。为了选择性地抑制TOE4B，可施用抑制TOE4B基因表达的核 酸（例如，核酸构建体）。所述核酸在本领域中已知且包括反义寡聚核苷酸、微RNA和介导 RNAi (例如，siRNA和shRNA)的核酸。TOE4的有用化学抑制剂包括咯利普兰、罗氟司特和西 洛司特。其它有用的抑制剂为在WO 2007/142929(其全部内容通过引用结合到本文中来） 中描述的那些。这些抑制剂包括被取代的苯或包含一个或两个环氮的被取代的6元杂芳基 环，所述取代包括醚、硫醚或胺基团，其中在所述醚、硫醚或胺上的烷基为齒烷基。所述卤烷 基可为氟甲基、二氟甲基或三氟甲基。
[0016] 上调CYLD的表达的所述药剂为JNK2的抑制剂。例如，所述JNK2抑制剂可为JNK 相互作用蛋白（JIP)或其肽片段，任选与细胞渗透肽TAT (如例如在Kaoud等（ACS Chem. Biol. 6:658?666, 2011)中所述）或2, 4-二氨基嘧啶（如例如在Song等（Med. Chem. Commun 3:238?243, 2012)中所述）相连。所述JNK2的抑制剂还可为抑制JNK2基因表达 的核酸。在希望用核酸构建体抑制靶标的任何情况下，不管是JNK2,还是本文所述的另一目 标，都可使用反义寡聚核苷酸、微RNA或介导RNAi (例如，siRNA和shRNA)的核酸。
[0017] 在需要用于治疗影响耳或鼻的病状的药物组合物的任何方法中，可将所述组合物 配制成适合耳局部或鼻施用。
[0018] 在另一实施方式中，本发明特征性描述了治疗罹患与生殖器官的炎症相关的医学 病状（例如，前列腺炎、盆腔炎或引起生殖组织或器官的炎症的感染疾病）的患者的方法。 所述方法可通过向所述患者施用治疗有效量的包含上调圆柱瘤蛋白（CYLD)基因的表达或 所编码的去泛素化酶的活性的药剂的药物组合物来进行。所述药剂可为上述的那些。或者 或另外，该患者群体还可用治疗有效量的包含下调Akt基因的表达或抑制所编码激酶的活 性的药剂的药物组合物治疗。
[0019] 在另一实施方式中，本发明特征性描述了治疗罹患自身免疫性疾病、尤其是牛皮 癣或类风湿性关节炎的患者的方法。所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的包含上调 圆柱瘤蛋白（CYLD)基因的表达或所编码去泛素化酶的活性的药剂的药物组合物。在这些 方法中，在上文和本文中的其它地方描述的任何药剂都可配制成适合施用。因为牛皮癣影 响皮肤，所以旨在治疗该病状的制剂可为局部的。另外，且如所提到的，这些方法可使用抑 制TOE4B、但不显著抑制另一 TOE4-家族成员（例如，TOE4D)的TOE4抑制剂进行。这些选 择性抑制剂可为使用本领域已知的方法设计以产生序列特异性靶向分子（例如，反义寡聚 核苷酸、微RNA和介导RNAi (例如，siRNA和shRNA)的核酸）的核酸（例如，核酸构建体）。 在另一实施方式中，上调CYLD基因表达的药剂可以是JNK2的抑制剂。
[0020] 在另一实施方式中，本发明特征性描述了通过向罹患自身免疫性疾病、尤其是牛 皮癣或类风湿性关节炎的患者施用治疗有效量的包含下调Akt基因的表达或抑制所编码 激酶的活性的药剂的药物组合物来治疗所述患者的方法。
[0021] 在另一实施方式中，本发明特征性描述了通过施用TOE4B的选择性抑制剂（例如， 核酸，经由序列特异性相互作用，特异性地抑制TOE4B的表达，或化合物治疗剂）治疗多种 病状的方法。在一些实施方式中，如本文所述的可治疗病状可急性存在，且本文所述的组合 物和方法可急性应用（例如，经最方便地以数天或数周测量的时间）。在其它实施方式中， 所述病状可为慢性的，且本文所述的组合物和方法可慢性应用（即，经最方便地以数月或 数年测量的时间）。
[0022] 在另一实施方式中，本发明特征性描述了识别治疗剂的方法。所述方法可通过包 括以下步骤来进行：（a)提供测试药剂；(b)将所述药剂暴露于TOE4B且同时或单独地暴露 于另一种I 3DE (例如，PDE4D);和（c)测定编码TOE4B和另一种PDE (例如，PDE4D)的基因的 表达水平和/或所编码磷酸二酯酶的活性水平。抑制TOE4B的表达或活性、但不显著抑制 所测定的另一种Η)Ε(例如，PDE4D)的表达或活性的药剂为用于治疗癌症、炎症或纤维化的 潜在治疗剂，且更特定地用于本文提到的任何患者群体（例如，患有中耳炎或影响耳、鼻、 喉咙或呼吸系统的其它炎症有关病状的患者）的潜在治疗剂。
[0023] 我们在本文中提到指定药剂的生物活性变体。例如，本发明的核酸构建体（例如， 编码CYLD的构建体）可包括作为天然存在基因的生物活性变体的序列。这些变体可借助 于一个或多个核苷酸的删除、添加或替换而不同于它们天然存在的对应物。因此，编码CYLD 的基因的生物活性变体可为其编码例如催化结构域的片段或可为替换突变体。替换突变体 可在编码与未改变的序列相同的氨基酸残基的密码子内的第三位置处不同，且所述序列可 被密码子优化。类似地，在所述药剂为多肽的情况下，生物活性变体的序列可比其天然存在 的对应物短、比其长或以其它方式与其不同（例如，借助于替换一个或多个氨基酸残基）。 药剂在可用于本发明的组合物和方法中时为生物活性的。其不必在所有或甚至大多数方面 与天然对应物相同。为了便于阅读，我们并没有在每一机会下重复短语"或其生物活性变 体"。应理解，在如本文所述可使用天然存在的药剂的情况下，也可使用其生物活性变体。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1图示在小鼠和人类中作为肺纤维化的负调节剂的CYLD。图Ia为显示来自肺 炎链球菌感染（插入：X 400) 2周后的Cyld+/+和Cyld/-小鼠的肺组织的H&E和Masson三 色（Trichrome)染色的显微照片的画面。比例尺对应于200 μ m。图Ib为图示与内部对照 物相比较I型和ΠΙ型胶原蛋白（C0L1A2和C0L3A1)、CTGF和1型纤溶酶原激活物抑制剂 (PAI-I)的mRNA表达的相对量的条形图。在肺炎链球菌感染2周后的Cyld+/+和Cyld-/-小 鼠的肺组织中测量甘油醛3-磷酸脱氢酶。*P〈0. 05值为平均值土标准偏差（η = 3)。使 用不配对学生t检验以与Cyld+/+相比较。图Ic为对照物（Con)和人类患者的肺纤维化 组织（纤维化肺）的H&E、Masson三色和抗-CYLD染色的显微照片的画面。肺纤维化组织 在肺切除术期间从患有肺纤维化的患者获得，且正常对照组织在手术期间从具有气胸的患 者获得。载玻片表示5种（对照）人类肺组织和10种（纤维化）人类肺组织。比例尺： 200 μ m。
[0025] 图2图示CYLD经由抑制TGF-β -信号传导而防止了肺纤维化的发展。在图2a的 免疫印迹中，用siRNA-对照物（SiCon)或siCYLD转染的上皮细胞通过用所指示的抗体进 行免疫印迹来分析。图2b为其中在用TNF-a (l〇ng mr1)刺激的siCon-或siCYLD-转染 细胞中显示NF-κ B-启动子活性的条形图。图2c为图示在用TGF-β激发的siRNA-对照物 (siCon)或siCYLD-转染细胞中的SBE-启动子和PAI-I-启动子活性的一对条形图。图2d 为图示在用TGF- β刺激的siCon-或siCYLD-转染细胞中与甘油醛3-磷酸脱氢酶相比较的 PAI-ImRNA表达的相对量的条形图。图2e为显示在用各种量的siCYLD或WT-CYLD转染并 用TGF-β刺激的A549细胞中的SBE-启动子活性的一对条形图。图2f为图示在用TGF-β 刺激的siCYLD或WT-CYLD-转染的人类原代支气管上皮NHBE细胞中的SBE-启动子活性的 条形图。图2g为图示在来自用TGF-β刺激的Cyld+/+和Cyld-/-小鼠的小鼠 MEF中的 SBE-启动子活性的条形图。图2h为图示在气管内接种TGF-β (25?IOOng/小鼠）6小时后 在Cyld+/+和Cyld-/-小鼠的肺组织中与甘油醛3-磷酸脱氢酶相比较的PAI-I和CTGF的 mRNA表达的相对量的一对条形图。在（b?h)中的*P〈0. 05值为平均值土标准偏差（η = 3)。使用学生t-检验进行统计数据分析。图2i为在有或没有腹腔内接种SB431542(10mg/ kg体重）的情况下在肺炎链球菌感染2周后来自Cyld-/-小鼠的肺组织的H&E和Masson 三色染色的一系列显微照片。比例尺：200 μ m。
[0026] 图3图示CYLD经由降低Smad3蛋白的稳定性而抑制TGF-β -信号。图3a为图示 在用对照载体或组成性活化的（C/A)-T β RI共转染的SiCon-或iCYLD-转染的T β II-缺 陷的DR26细胞中的SBE-启动子活性的条形图。图3b为图示在用对照载体或WT-Smad3共 转染的siCON-或siCYLD-转染的T β I-缺陷的RlB细胞中的SBE-启动子活性的条形图。 图3c为图示在用对照载体或WT-Smad3共转染的siCON-或siCYLD-转染的Smad3-/-MEF 细胞中的SBE-启动子活性的条形图。图3d为图示用TGF-β处理并通过用所指示的抗体 免疫印迹分析的用siCYLD或WT-CYLD转染的细胞的一对免疫印迹。在图3e和图3f中的 免疫印迹中，来自Cyld+/+和Cyld-/-小鼠的MEF细胞和肺组织通过用所指示的抗体进行 免疫印迹来分析。在图3g的显微照片的画面中，来自对照物的肺组织（Con)和肺部纤维 化患者的肺组织（纤维化肺）相对Smad3染色（左画面，X 100 ;右画面，X 400)。比例尺： 200μπι。在图3h的条形图中，具有Flag-WT-Smad3(右画面）或没有Flag-WT-Smad3(左画 面）的用WT-CYLD转染的细胞通过用所指示的抗体进行免疫印迹来分析。图3i为图示在 用siCON或siCYLD转染并用TGF-β刺激的A549细胞中与甘油醛3-磷酸脱氢酶相比较的 PAI-UCTGF和Smad3的mRNA表达的相对量的一系列条形图。在图3j的免疫印迹中，将用对 照载体或WT-CYLD转染的细胞用MG132 (20 μ M)处理并通过用所指示的抗体进行免疫印迹 来分析。在图3k的条形图中，将用WT-CYLD转染的细胞用MG-132预处理，且在TGF-β -处 理后，得到与甘油醛3-磷酸脱氢酶相比较的PAI-ImRNA表达的相对量。在a、b、c、i和k中 的*P〈0. 05、#P>0. 05值为平均值土标准偏差（η = 3)。使用学生t-检验进行统计数据分 析。
[0027] 图4图示CYLD以GSK3P -CHIP-依赖性方式可能经由Akt降低了 Smad3蛋白的 稳定性。图4a为图示用所指示的抗体对用WT-CYLD或DUB-缺陷突变体（H/N-CYLD或C/ S-CYLD)转染的细胞的免疫印迹。图4b为显示在用TGF-β刺激的用WT-CYLD、H/N-CYLD或 C/S-CYLD转染的细胞中的SBE-启动子活性的条形图。图4c为图示用所指示的抗体得到的 用siCon或siCHIP与WT-CYLD或H/N-CYLD共转染的细胞的免疫印迹。图4d为显示在用 TGF- β刺激的用SiCon或siCHIP与WT-CYLD共转染的细胞中的SBE-启动子活性的条形图。 图4e的条形图显示在用TGF-β刺激的用siCon或siCHIP与WT-CYLD共转染的细胞中与甘 油醛3-磷酸脱氢酶相比较的PAI-ImRNA表达的相对量。在图4f中，将用对照载体、WT-CYLD 或DUB-缺陷的H/N-CYLD转染的细胞用媒介对照物或GSK3 β -抑制剂SB216763 (5 μ M) 处理12小时并通过用所指示的抗体进行免疫印迹来分析。在图4g中，将用对照载体或 WT-CYLD转染的细胞用GSK3 β -抑制剂（5 μ M)预处理2小时，接着TGF- β -刺激，且随后 测定SBE-启动子活性。在图4h中，将重组GSK3 β蛋白（His-GSK3 β )用GST或重组CHIP 蛋白（GST-CHIP)体外温育。将CHIP用琼脂糖4B珠粒捕获（pull down)并相对于His免疫 印迹以检测GSK3。在图4i中，将在用Myc-CHIP和HA-GSK30共转染细胞中的HA-GSK33 用HA探针捕获并通过用抗-Myc抗体进行免疫印迹来分析。在图4j中，将A549细胞用肺 炎链球菌处理历时如在该图中所指示的各种时间，且细胞溶解产物通过用所指示的抗体进 行免疫印迹来分析。在图4k中，将来自Cyld+/+和Cyld-/-小鼠的MEF细胞用肺炎链球菌 处理30分钟，且细胞溶解产物通过用所指示的抗体进行免疫印迹来分析。在图41中，将WT 小鼠用肺炎链球菌气管内接种历时如在该图中所指示的各种时间，且来自肺组织的蛋白质 通过用所指示的抗体进行免疫印迹来分析。在图4m中，将A549细胞用肺炎链球菌处理历 时所指示的各种时间，且细胞溶解产物通过用所指示的抗体进行免疫印迹来分析。在b、d、 e和g中的*P〈〇. 05值为平均值土标准偏差（η = 3)。使用学生t-检验进行统计数据分 析。S.p.:肺炎链球菌。
[0028] 图5图示CYLD通过抑制Akt降低了 Smad3稳定性。（a)将来自Cyld+/+和 Cyld-/-小鼠的MEF细胞用siCon或siAktl/2转染并通过用所指示的抗体进行免疫印迹 来分析。（b)在有或没有siAkt共转染且用TGF-β刺激的siCYLD-转染的A549细胞中 测定SBE-启动子活性。（c)在来自用Akt抑制剂预处理并用TGF-β刺激的Cyld+/+和 Cyld-/-小鼠的MEF中测定SBE-启动子活性。（d)将来自Cyld+/+和Cyld-/-小鼠的MEF 细胞用Akt抑制剂（20 μ M)培育，且细胞溶解产物通过用所指示的抗体进行免疫印迹来分 析。（e)将细胞用Akt抑制剂（20 μ Μ)或LY294002 (20 μ Μ)温育，且细胞溶解产物通过 用所指示的抗体进行免疫印迹来分析。（f)将来自用HA-CYLD和Flag-Akt转染的细胞的 溶解产物用抗-CYLD抗体（上部画面）或抗-Akt抗体（下部画面）免疫沉淀，且相互作用 蛋白通过免疫印迹进行分析。（g)将A549细胞用肺炎链球菌处理历时在该图中所指示的 各种时间，用兔抗-CYLD抗体和/或小鼠抗-Akt抗体染色，且在CYLD和Akt之间的体内蛋 白-蛋白相互作用使用Duolink体内蛋白-蛋白相互作用检测试剂盒（Olink)用二次近接 式探针、抗-兔MINUS和抗小鼠-PLUS检测。比例尺：10 μ m。（h)将细胞用肺炎链球菌或 媒介对照物处理。在细胞溶解产物中的Akt用抗-Akt抗体捕获且相对于CYLD和Akt进行 免疫印迹。在b、c中的*P〈0. 05值为平均值土标准偏差（η = 3)。使用学生t-检验进行 统计数据分析。S. p.:肺炎链球菌。
[0029] 图6图示CYLD使K63-多聚泛素化Akt去泛素化以降低Smad3。（a)将来自用 HA-Ub WT、Flag-Akt WT、Flag-WT-CYLD 或 Flag-H/N-CYLD 共转染的 A549 细胞的溶解产 物用抗-Akt抗体免疫沉淀且通过用所指示的抗体进行免疫印迹来分析。（b)将细胞用 Flag-Akt、HA-CYLD或siCYLD共转染且用肺炎链球菌处理。Akt用Flag探针捕获且相对于 泛素（Ub)、Akt和CYLD免疫印迹。（c)将用对照载体或Flag-WT-CYLD转染的细胞用肺炎链 球菌处理，且细胞溶解产物用抗-Aktl抗体免疫沉淀并通过用所指示的抗体进行免疫印迹 来分析。（d)将使用siCYLD的CYLD-贫化细胞用肺炎链球菌处理，且在细胞溶解产物中的 Akt用抗-Akt抗体捕获并相对于Ub、Akt和CYLD进行免疫印迹。（e)将来自用Flag-Akt WT、 Flag-WT-CYLD、HA-Ub WT、HA-Ub K63或HA-Ub K48共转染的A549细胞的溶解产物用抗-Akt 抗体免疫沉淀且通过用所指示的抗体进行免疫印迹来分析。（f)将重组Aktl (His-rAktl) 在体外去泛素化测定缓冲液（BostonBiochem)中在有或没有重组CYLD (GST-rCYLD)的情况 下用重组K63泛素（His-rUb-K63)温育并通过用所指示的抗体进行免疫印迹来分析。（g) 将来自Cyld+/+和Cyld-/-小鼠的MEF细胞用Flag-Akt和HA-Ub K63共转染，且用肺炎球 菌处理。在细胞溶解产物中的Akt用Flag探针捕获且相对于Ub和Akt进行免疫印迹。（h) 将来自用 HA-Ub K63、Flag-Akt WT 或 Flag-Akt KR 突变体（K8R、K14R、K20R 或 K30R)共转 染的细胞的溶解产物用抗-Flag探针进行免疫沉淀且通过用所指示的抗体进行免疫印迹 来分析。⑴在用TGF-β刺激的用WT-CYLD、Akt WT、Akt K14R或Akt K20R共转染的A549 细胞中测定SBE-启动子活性。在i中的*P〈0. 05、#P>0. 05值为平均值土标准偏差（η = 3)。使用学生t-检验进行统计数据分析。S.p.:肺炎链球菌。
[0030] 图7为图示CYLD在肺纤维化中的关键作用的图解模型。一方面，在严重细菌感 染（例如，肺炎链球菌感染）后的肺损伤之后，胞外基质产生和组织恢复过程经由Smad3的 T β RII/I-介导的激活和GSK3 β -CHIP-介导的Smad3降解的Akt-依赖性抑制二者来引发。 另一方面，由肺炎链球菌诱发的CYLD通过使K63-多聚泛素化Akt去泛素化而抑制Akt,这 又引起GSK3 0的激活且促进了 CHIP-介导的Smad3降解，由此减弱了过度纤维化反应并预 防了肺纤维化（a)。Cyld的缺陷引起增强的Akt激活，这又引起抑制GSK3 0和CHIP-介导 的Smad3降解，由此促进了过度纤维化反应和组织纤维化（b)。ECM :胞外基质；T β RII/I : TGF-β受体II和I。
【具体实施方式】
[0031] 在过去的数十年间已经对于研发消炎剂花费了巨大的努力，大多数策略集中在直 接靶向正途径（例如，包括I K B激酶（IKK)的那些）以阻遏炎症。虽然这些药剂常显示合 理的功效，但它们还展示出显著的不良作用，诸如增加患者对感染的易感性和诱发细胞凋 亡。这些作用妨碍了进一步的临床研发。因为在研发用于长期治疗炎症病症而没有显著副 作用的疗法方面的成功较为有限，所以仍然需要治疗炎症及其它免疫有关疾病的方法。
[0032] 我们现在发现通过包括药理学抑制炎症自己的负调节剂的各种策略而上调 CYLD(炎症的关键负调节剂）的表达为治疗在许多病理学病状中不想要的炎症提供了新方 法。此外，我们预期本文所述的策略不会引起在靶向于炎症的正调节剂时常见到的严重不 良反应。因此，本发明方法的一个优势可以为维持患者的防御反应。
[0033] 靶向CYLD :近来研究已经识别出CYLD(圆柱瘤蛋白）为细菌诱发炎症的关键的可 诱发负反馈调节剂（Sun, Nature Rev. Immunol.呈:501 ?511，2008 和 Wang 等，Cell. Mol. Immunol. 2:131?135, 2012)。CYLD为一种去泛素化酶，已经显示其通过从多种特异性底物 中除去赖氨酸63-连接的多聚泛素链而充当包括TRAF6、NEMO和Akt的各种信号途径的负 调节剂（Lim等，Nature Commun. 771，2012 ;Sun, Cell Death Differ. 17:25 ?34, 2010)。 CYLD的表达在生理条件下相对较低，但在呼吸系统中的细菌感染时显著上调（Jono等， T. Biol. Chem. 279:36171 ?36174, 2004 :Lim 等，PLoS One 2, el032, 2007 ;和 Yoshida 等， T.Biol. Chem. 280:4111?41121，2005)。相比之下，也已经报道了 CYLD在肿瘤中的低表 达（Massoumi, Future Oncol. 285 ?297, 2011 ;和 Espinosa 等，Cancer Cell 18:268 ? 281，2010)。CYLD基因的结构（包括其序列和内含子-外显子边界）和所编码去泛素化酶的 结构和功能是充分了解的。参见，例如Reiley等（J. Biol. Chem.55161?55167, 2004)。
[0034] 已经在呼吸性细菌感染、特别是由不可分型流感嗜血杆菌（NTHi)引起的感染中 广泛研究了 CYLD，并且我们在如下所述的一些研究中使用了该模型系统。NTHi及其它助激 动剂可在感染组织中协同地诱发严重炎症，且CYLD负调节了在感染期间诱发的许多途径。 例如，CYLD为在NF κ B的下调中涉及到的去泛素化酶。其含有结合到泛素且将其从目标蛋 白分开的泛素羧基-端水解酶。泛素，一种在所有真核细胞中存在的小调节蛋白，附着到其 它蛋白，引起它们的激活或降解。
[0035] 上调在受试者或生物体中CYLD的表达或活性可通过向受试者施用有效量的药物 组合物来完成，该药物组合物包含作为唯一活性成分或作为多种活性成分中的一种的上调 圆柱瘤蛋白（CYLD)基因的表达或所编码的去泛素化酶的活性的药剂。所述上调可通过施 用表达CYLD或下调CYLD的负调节剂（诸如，磷酸二酯酶4(PDE4(例如，TOE4B)或c-jun N-末端激酶2 (JNK2))的表达或活性的核酸构建体来完成。基因和/或蛋白质表达或活性 的降低在临床有益的程度上减轻或预防了如本文所述的医学病状或其病征或症状。
[0036] 如上所述，可使用多种表达载体中的任一种来承载CYLD-编码、TOE4B-抑制、 JNK2-抑制或Akt-调整核酸序列。该载体可例如为质粒、粘粒或病毒载体。表达可使用 标准控制元件如启动子调节，其可能允许组成性活化或可诱发的表达。该启动子也可为驱 动组织特异性表达的启动子。除了该启动子之外，该表达载体还可含有含有在宿主细胞中 (例如，在患者体内的受影响细胞中）核酸的表达所需要的另外元件中的任一种或所有的 转录单元或表达盒。典型的表达盒含有可操作性连接到编码所要产物的核酸序列以及例如 转录本的有效聚腺苷酸化、转录终止、核糖体结合位点或翻译终止所需要的信号的启动子。 该构建体或盒的另外元件可包括增强子和外源性拼接的内含子信号。在本发明的情况下可 使用将核苷酸序列引入宿主细胞的熟知程序中的任一种。这些程序包括使用磷酸钙转染、 聚凝胺、原生质体融合、电穿孔、脂质体、显微注射、裸DNA、质粒载体、病毒载体（附加型和 整合型两种），和将克隆基因组DNA、cDNA、合成DNA或其它外来基因材料引入宿主细胞的 其它熟知方法中的任一种（参见，例如Sambrook等，〃Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 〃 第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 ;和 Ausubel 等，''Current Protocols in Molecular Biology〃，John Wiley&Sons, New York, 1987 和定期更新）。可 选择组织特异性启动子以驱动在受本文所述的病状之一影响的组织或细胞类型（例如，呼 吸系统、神经系统、心血管系统、生殖或生殖泌尿系统、胃肠系统、皮肤、结缔组织或耳鼻喉 或窦）中的表达。
[0037] 关于将特异性结合并抑制TOE4B、JNK2或Akt的包括抗体的蛋白生物治疗剂的制 造，存在类似的资料资源。在本发明组合物和方法中使用的抗-PDE4B、抗-JNK2或抗-Akt 抗体可为四聚抗体（例如，IgG (例如IgGl))、单链抗体、Fab片段或F (ab'）2片段。该抗体 也可为人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在本领域中熟知这些和类似改性的构造。
[0038] 不仅本发明的抗癌、消炎和抗纤维化策略适用于许多医学病状，而且我们还预期 它们可以使用而不会有在靶向于炎症的正调节剂时常见到的严重不良作用。
[0039] 本发明化合物中的任一种可没有（S卩，它们可排除）调整炎症的正调节剂的药剂。 类似地，本发明方法中的任一种（特定地，治疗方法）可排除其中患者用调整炎症的正调 节剂的药剂治疗的步骤。例如，本发明的组合物可没有类固醇（例如，糖皮质激素），没有 NF κ B的抑制剂（例如，吡咯烷二硫代氨基甲酸酯（PDTC))和/或没有磷酸酶PAC-I的抑制 齐[J，且本发明的治疗方法可没有如下步骤，其中将类固醇、NFk B和/或PAC-I的抑制剂施 用到受试者。
[0040] 在诸如OM的感染性疾病中，细菌诱发的炎症是为了根除病原体的必要身体反应。 然而，如果不受控制的话，过度和/或延长的炎症由于由此引起的严重组织损坏而对宿主 有害。因此，必须紧密地调节炎症。
[0041] 在一个实施方式中，所述上调通过向有需要的受试者或患者引入上调CYLD的表 达的以表达CYLD的核酸构建体或其生物活性变体（例如，其生物活性片段或其替换突变 体）形式的药剂来实现。
[0042] 靶向TOE4或JNK2 :在另一实施方式中，本发明提供了通过经由施用磷酸二酯酶 4(PDE4)的抑制剂或c-jun N-末端激酶2(JNK2)的抑制剂上调CYLD来治疗炎性病状的方 法。又一方面，该TOE4的抑制剂为对同种型TOE4B具有特异性（或选择性）的抑制剂，例 如将抑制Η)Ε4Β (例如，PDE4B1、TOE4B2、TOE4B3或TOE4B4)、而不会在任何显著程度上抑 制另一同种型（例如，TOE4D，诸如TOE4D1?TOE4D9)的抑制剂。本领域的普通技术人员 将理解在各种磷酸二酯酶之间的结构和功能差别且关于该家族可查阅许多出版物（例如， Halpin, Int. J. of COPD 3(4) :543 ?561，2008)。
[0043] 本发明人已经确定磷酸二酯酶4 (PDE4)经由抑制CYLD (0M炎症的关键负调节剂） 而在介导炎症中起关键作用，且因此提供了紧密调节炎症和用于其的治疗剂的目标的重要 见解。在哺乳动物中PDE超家族包含11个亚族，即TOEl?TOE11。它们充当细胞反应的重 要正调节剂和负调节剂。至今，在临床上已经成功地研发了作为药物的许多PDE抑制剂，例 如用于勃起功能障碍的Viagra? (靶向TOE5)和用于哮喘和COro的罗氟司特（靶向TOE4)。 然而，可用的非特异性TOE4抑制剂（靶向所有四种亚族成员A?D)由于它们对TOE4D的 抑制而展示出无法忍受的不良作用，例如呕吐。此外，PDE4D的抑制导致生长受损。因此， 识别Η)Ε4Β，而不是TOE4D为用于炎症的关键调节剂和治疗目标提供了对于选择性且特异 性地靶向TOE4B、而不是TOE4D的更可耐受的消炎剂、用于治疗炎性疾病的治疗目标。
[0044] 已知可用的TOE4B抑制剂的实例包括咯利普兰、罗氟司特和西洛司特。罗氟司特 例如为TOE4B的强效且更特异性的抑制剂，且目前临床上可用于治疗哮喘和C0PD。
[0045] 其它有用的抑制剂为在WO 2007/142929(其全部内容通过引用结合到本文中来） 中描述的那些。这些抑制剂包括被取代的苯或包含一个或两个环氮的被取代的6元杂芳基 环，该取代包括醚、硫醚或胺基团，其中在该醚、硫醚或胺上的烷基为卤烷基。该卤烷基可为 氟甲基、二氟甲基或三氟甲基。
[0046] 另外，研究已经显示两种主要的MAP激酶JNK家族成员JNKl和JNK2在包括中耳 的各种人类组织中泛表达，而JNK3在神经元中选择性地表达。传统上认为JNKl和JNK2在 功能上是多余的，但近代研究显示它们被选择性地激活且起到不同的功能性作用。然而，在 该选择性激活下面的机制尚不明确。本发明人已经发现Η)Ε4(特别是TOE4B)选择性地激 活JNK2,而不激活JNKl。识别JNK2、而不是JNKl在通过抑制CYLD介导PDE4B-介导的炎症 中的作用提供了用选择性JNK2抑制剂处理的另一治疗目标，从而阻遏OM炎症，且使由JNKl 的并存抑制引起的不良副作用如细胞生长最小化。
[0047] 如所提到的，TOE4的抑制剂可为抑制TOE4B、但不显著抑制另一 TOE4-家族成员 (例如，PDE4D)的抑制剂。为了选择性地抑制TOE4B，可施用抑制TOE4B基因表达的核酸（例 如，核酸构建体）。该核酸在本领域中已知且包括反义寡聚核苷酸、微RNA和介导RNAi (例 如，siRNA和shRNA)的核酸。
[0048] 在本发明的组合物和方法中上调CYLD的表达的药剂可为JNK2的抑制剂。例如， 该JNK2的抑制剂可为JNK相互作用蛋白（JIP)或其肽片段，任选与细胞渗透肽TAT (如例 如在Kaoud等（ACS Chem. Biol. 6:658?666, 2011)中所述）或2, 4-二氨基嘧啶（如例如 在Song等（Med Chem. Commun 2:238?243, 2012)中所述）相连。JNK2的抑制剂还可为抑 制JNK2基因表达的核酸。
[0049] 在本发明的组合物包含小分子（化合物）时，所述组合物可包含该分子或化合物 或其"可药用的盐"。我们使用该术语以指代保持它们的生物效应且并不属于生物学或另外 不合需要的如本文所述的化合物的盐。所述可药用的碱加成盐可由无机碱和有机碱制备。 衍生自无机碱的盐包括（仅举例而言）钠、钾、锂、铵、钙和镁盐。衍生自有机碱的盐包括但 不限于以下各物的盐：伯胺、仲胺和叔胺，诸如烷基胺、二烷基胺、三烷基胺、被取代的烷基 胺、二（被取代的烷基）胺、三（被取代的烷基）胺、烯基胺、二烯基胺、三烯基胺、被取代的 烯基胺、二（被取代的烯基）胺、三（被取代的烯基）胺、环烷基胺、二（环烷基）胺、三（环 烷基）胺、被取代的环烷基胺、二取代的环烷基胺、三取代的环烷基胺、环烯基胺、二（环烯 基）胺、三（环烯基）胺、被取代的环烯基胺、二取代的环烯基胺、三取代的环烯基胺、芳基 胺、二芳基胺等。该盐也可为酸加成盐。
[0050] 本发明特征性描述了治疗罹患与炎症相关的医学病状的患者（或受试者）的方 法。该方法包括向该患者施用治疗有效量的包含下调Akt基因的表达或抑制所编码激酶的 活性的药剂的药物组合物。该病状包括但不限于：（1)生殖器官的炎症（例如，前列腺炎、 盆腔炎或引起生殖器官的炎症的感染疾病）；（2)自身免疫性疾病，尤其是牛皮癣或类风湿 性关节炎；或（3)上或下呼吸道疾病或病状，诸如中耳炎、鼻炎、窦炎或引起耳、鼻、鼻道或 喉咙的炎症的感染疾病。
[0051] 如上所述，该方法涵盖了包括婴儿和儿童的多种受试者的治疗。下调Akt基因的 表达的药剂可为抑制Akt基因的核酸（例如，反义寡聚核苷酸、微RNA或介导RNAi的核 酸）。在一个实施方式中，抑制所编码激酶的活性的该药剂可为表达使Akt去泛素化的酶 (例如，酶CYLD)的核酸构建体。在另一实施方式中，抑制所编码激酶的活性的该药剂可为 VQD-002、哌立福新或米替福新。如所提到的，在耳病的情况下，该药物组合物可配制用于耳 局部施用。
[0052] 中耳炎为服从如本文所述的治疗的病状。在一个实施方式中，本发明提供了治疗 罹患与耳、鼻、鼻道或喉咙的炎症相关的医学病状的患者的方法，且包括向该患者施用治疗 有效量的包含上调圆柱瘤蛋白（CYLD)基因的表达或所编码去泛素化酶CYLD的活性的药剂 的药物组合物。该方法可引起炎症或另一症状降低。例如，在治疗中耳炎中，本发明方法还 可降低中耳的粘膜增厚和中耳粘膜中的多形核中性粒细胞（PMN)浸润。
[0053] 服从如本文所述的治疗的病状包括引起中耳炎、鼻炎、窦炎的上呼吸道感染或导 致耳、鼻、鼻道（或其部分）、喉咙或肺的炎症的感染疾病。该感染疾病可与细菌或病毒病原 体（例如，链球菌属的细菌（例如，肺炎链球菌，有时称作肺炎球菌，或产脓链球菌）或病毒 (例如，呼吸道合胞病毒或流感病毒）相关。
[0054] 在一个特定的实施方式中，该病状为中耳炎（OM)，其为中耳的感染，常由用不可分 型的流感嗜血杆菌（NTHi)的感染引起。中耳炎为最常见的儿童细菌感染并且为儿童的传 导性听力损失的主要原因。在美国，每年有2450万就诊者因 OM而到医师诊室就诊。为了 护理0M，每年花费超过50亿美元。约10%的急性OM发展成慢性0M，这是美国儿童的传导 性听力损失的主要原因。因为OM导致在说话和语言开发的关键期间的听力损失，由于频繁 中耳感染而具有早期听力损伤的儿童随后可能罹患说话和语言障碍。尽管显然需要预防措 施，但研发用于OM的高效疫苗仍然是一项挑战。此外，OM的不当抗生素治疗明显具有增加 的抗生素抗性。由于OM的高度流行、其长期后遗症和总体社会成本，NIH/NIDCD已经将OM 指定为重要的研究领域。
[0055] 目前，由于对于OM的分子致病原因了解不足，尚没有可用于治疗OM的有效治疗 齐[J。炎症是OM的一个特征。然而，尚没有可用于治疗在OM中的过度炎性反应的不良结果 的有效治疗剂，包括消炎剂，且至今，在很大程度上不知道在OM中如何紧密调节炎症。
[0056] 本发明现在提供了对于在OM中的炎性反应的负反馈调节的见解，且提供了上调 作为炎症的关键负调节剂的CYLD的表达以调整或降低在OM患者中的过度或延长的炎性反 应，由此预防或抑制由炎性过程引起的其它组织损坏的方法。
[0057] 另外，识别作为在OM中的炎症的关键调节剂和特异性治疗目标的TOE4B在OM的 治疗中提供了新的及现有药物的独特目标，同时避免了消炎的先前目标的不良作用。另外， 在OM的治疗中临床有用的TOE4抑制剂罗氟司特等的耳局部施用通过使由全身性施用引起 的副作用最小化也是有利的。
[0058] 在需要用于治疗影响耳的病状的药物组合物的任何方法中，可将该组合物配制成 用于耳局部施用。
[0059] OM病理不限于由不可分型的流感嗜血杆菌（NTHi)所诱发的；实际上，我们的资料 显示TOE4在调节通过肺炎链球菌（另一主要OM病原体）诱发的OM和由LPS和TNF- α诱 发的炎症中也起到关键作用。因此，本发明也适用于这些病理和临床情形。
[0060] 呼吸相关病状。肺损伤代表了全世界发病率和死亡率的一个主要原因。诸如感染 剂和苛性化学物的有害刺激物引发了复杂且动态系列的宿主伤口愈合反应。在严重肺炎链 球菌感染的早期，肺炎球菌溶血素诱发了急性肺损伤（ALI)和致死。作为关键宿主反应，1 型纤溶酶原激活物抑制剂（PAI-I)由肺炎链球菌上调，其通过预防肺泡出血1而预防ALI。 诸如上调的PAI-I产生的适当宿主反应因此对于修复受损的肺组织和恢复其功能是关键 的。然而，如果不受控制，过度的PAI-I将经由胞外基质在组织中的增强积聚而对组织重塑 过程具有不良作用。因此，在整个宿主伤口愈合过程期间必须紧密且动态地调节PAI-I表 达。我们先前发现去泛素化酶CYLD通过阻遏其Ρ38ΜΡΚ-依赖性表达而在预防PAI-I的 过度产生中具有关键作用。然而，在致命的肺炎链球菌感染期间，肺炎球菌溶血素的过度 释放引起严重的肺损伤，其压倒了可用的PAI-I的保护作用，由此引起致死。有趣的是，在 Cyld-缺陷小鼠中的CYLD缺陷引起了 PAI-I的过度产生，因此提供了对于致死的有效预防。 因此，我们先前的研究证明CYLD为在感染早期期间对于宿主存活的关键负调节剂，因为与 野生型（WT)小鼠相比较，Cyld-缺陷小鼠具有高得多的存活率。因为不受控制且过度的伤 口愈合反应如过度的PAI-I产生可引起肺纤维化，所以我们假设经受致命的肺炎链球菌感 染而存活的Cyld-缺陷小鼠可发展肺纤维化，且在细菌感染的晚期期间，CYLD因此可充当 伤口愈合过程的关键调节剂。在如下所述的研究中，我们显示CYLD通过抑制转化生长因 子-β (TGF-β)-信号传导而充当了对于损伤诱发的纤维化反应的关键负调节剂。我们进 一步显示CYLD通过以糖原合酶激酶3-β (GSK3i3)-Hsc70-相互作用蛋白（CHIP)依赖性方 式降低Smad3蛋白的稳定性而抑制了 TGF-β信号传导。有趣的是，CYLD通过使K63-多聚 泛素化Akt直接去泛素化而降低了 Smad3稳定性。这些研究带来了对于CYLD在调节纤维 化中的新颖作用的新的见解且支持了方法针对识别用于治疗这些疾病的新治疗目标。
[0061] 肺损伤（不管是由感染诱发，还是由苛性化学品诱发）引发了一系列复杂的伤口 愈合反应。如果不受控制，这些反应则可引起肺纤维化疾病和功能丧失。因此，必须紧密调 节肺损伤的消退。紧密控制肺损伤的消散的关键调节蛋白还有待识别。我们已经显示在用 肺炎链球菌感染之后，去泛素化酶CYLD的损失引起小鼠的肺纤维化的发展。CYLD通过以 Hsc70-相互作用蛋白的E3连接酶羧基端点依赖性方式降低Smad3的稳定性而抑制了转化 生长因子-β -信号传导并预防了肺纤维化。此外，CYLD通过使K63-多聚泛素化Akt去泛 素化而降低了 Smad3稳定性。总之，我们的结果揭露CYLD通过使Akt去泛素化而紧密调节 肺损伤的消散并预防纤维化的作用。这些研究可有助于研发用于预防肺纤维化的新治疗策 略。
[0062] 肺损伤代表全世界发病率和死亡率的一个主要原因。诸如感染剂和苛性化学物 的有害刺激物引发了复杂且动态系列的宿主伤口愈合反应。在严重肺炎链球菌感染的早 期期间，肺炎球菌溶血素诱发了急性肺损伤（ALI)和致死。作为关键宿主反应，1型纤溶酶 原激活物抑制剂（PAI-I)由肺炎链球菌上调，其通过预防肺泡出血而预防ALI。诸如上调 的PAI-I产生的适当宿主反应因此对于修复受损的肺组织和恢复其功能是关键的。然而， 如果不受控制，过度的PAI-I将经由胞外基质在组织中的增强积聚而对组织重塑过程具有 不良作用。因此，在整个宿主伤口愈合过程期间必须紧密且动态地调节PAI-I表达。我们 先前发现去泛素化酶CYLD通过阻遏其P38MAPK-依赖性表达而在预防PAI-I的过度产生 中具有关键作用。然而，在致命的肺炎链球菌感染期间，肺炎球菌溶血素的过度释放引起 严重的肺损伤，其压倒了可用的PAI-I的保护作用，由此引起致死。有趣的是，在Cyld-缺 陷小鼠中的CYLD缺陷引起PAI-I的过度产生，因此提供了对于致死的有效预防。因此，我 们先前的研究证明在感染的早期期间CYLD为宿主存活率的关键负调节剂，因为与野生型 (WT)小鼠相比较，Cyld-缺陷小鼠具有高得多的存活率。因为不受控制且过度的伤口愈合 反应如过度的PAI-I产生可引起纤维化，所以我们假设经受致命的肺炎链球菌感染而存活 的Cyld-缺陷小鼠可发展出肺纤维化，且在细菌感染的晚期期间，CYLD因此可充当伤口愈 合过程的关键调节剂。在此，我们显示CYLD通过抑制转化生长因子-β (TGF-β)-信号传 导而充当用于损伤诱发的纤维化反应的关键负调节剂。我们进一步显示CYLD经由以糖原 合酶激酶3-β (GSK3i3)-Hsc70-相互作用蛋白（CHIP)依赖性方式降低Smad3蛋白的稳定 性而抑制TGF-β信号传导。有趣的是，CYLD通过使K63-多聚泛素化Akt(也称作蛋白激 酶B或PKB)直接去泛素化而降低Smad3稳定性。这些研究发现了 CYLD在调节纤维化中的 独特作用且允许识别用于治疗这些疾病的新治疗剂。
[0063] 可根据本发明治疗的其它呼吸疾病、性状（trait)和病状包括但不限于C0PD、哮 喘、嗜酸性咳嗽、支气管炎、结节病、肺纤维化、鼻炎、窦炎和/或与在受试者或生物体中的 过度炎性活性相关的其它疾病状态。
[0064] 服从治疗的其它病状：本发明预期并涵盖通过施用包含TOE4B的选择性抑制剂 (例如，核酸，经由序列特异性相互作用，特别地抑制PDE4B的表达）的如本文所述的组合物 而治疗多种病状的方法。可治疗的病状包括癌症、炎症和纤维化。在特定的实施方式中，用 如本文所述的组合物治疗的病状可与在耳（单或双）、鼻或喉咙中的炎症或粘液生产过剩 相关，并且还可影响鼻道、在呼吸系统内的另一区域或组织（例如，肺或支气管树）或窦腔 或从窦腔延伸的通道。例如，该病状可为间质性肺病、人类纤维化肺病（例如，特发性肺纤 维化（IPF)、囊性纤维化、呼吸窘迫综合征（成人（ARDS)或婴儿）、肺病中的肿瘤基质、全身 性硬化、Hermansky-Pudlak综合征（HPS)、煤矿工人尘肺（CWP)、慢性肺动脉高血压、AIDS相 关的肺动脉高血压等、哮喘、慢性支气管炎、慢性阻塞性肺病（COPD)、咳嗽（例如，嗜酸性咳 嗽）、肺纤维化、鼻炎（例如，过敏性鼻炎）、窦炎或中耳炎。在其它实施方式中，用如本文所 述的组合物治疗的病状可为人类肾病。例如，患者可具有肾病综合征、阿尔波特氏综合征、 HIV相关的肾病、多囊性腎病、法布里病、糖尿病性或其它肾病、肾小球性肾炎（例如，慢性 肾小球性肾炎）或与全身性狼疮相关的肾炎。如所提到的，本发明的组合物可有效抵抗纤 维化，包括在肝（肝纤维化）、心脏（心肌纤维化）和生殖系统（子宫内膜纤维化）中的纤 维化病状。在涉及到肝时，可治疗的病状还包括肝炎（不管是由病毒药剂、自身免疫疾病、 还是由滥用药品引起）、肝性脂肪变性和肝硬化。在其它实施方式中，用如本文所述的组合 物治疗的病状可为心血管疾病，包括动脉再狭窄和动脉粥样硬化或心肌的再灌注损伤。在 其它实施方式中，用如本文所述的组合物治疗的病状可为癌症，且本发明的组合物可用以 阻止肿瘤生长和/或转移。可服从治疗的特定癌症包括硬皮病、在Li-Fraumeni综合征中的 胶质母细胞瘤、散发性胶质母细胞瘤、骨髓性白血病、急性髓性白血病、脊髓发育不良综合 征、骨髓增生性综合征，癌症如乳癌、肺癌、结肠癌（例如，Lynch综合征）、前列腺癌或妇科 癌症（例如，卵巢或子宫癌）和皮肤癌（例如，黑素瘤或卡波西肉瘤）。除了皮肤癌或恶性 增殖性皮肤病之外，本发明的组合物可用于治疗嗜酸粒细胞肉芽肿、其它良性皮肤病如特 异性皮炎（一种湿疹）和荨麻疹（通常称为荨麻诊Olives))和疤痕。在另一实施方式中， 本发明的组合物和方法可施用到表现出组织变形的患者，该组织变形通常被理解为响应在 周围或慢性刺激中的改变而出现的良性改变。例如，在患者呼吸道内的细胞和组织可响应 烟气（例如，从烟草产品如雪茄或香烟吸入的烟气）而表现出组织变形。虽然本发明不受此 限制，但在这种情况下，刺激剂可促使加衬气管的粘液分泌纤毛假复层柱状呼吸上皮细胞 被复层扁平上皮替代。如所提到的，本发明的组合物可有效抵抗炎性病状，包括影响胃肠道 的那些病状。这些病状包括炎性肠病（例如，溃疡性结肠炎或克罗恩氏病），且本发明的组 合物也可用于治疗胃酸的分泌亢进。在其它实施方式中，用如本文所述的组合物治疗的病 状可为神经病症或对神经系统（例如，外周或中枢神经系统）的损伤。例如，该病状可为脑 的再灌注损伤、抑郁症、记忆障碍、单极性抑郁症、帕金森病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、 脊髓创伤、颅脑损伤、神经原性炎症或疼痛。日益证明神经降解性病征和损伤具有重要的炎 性组分，且该病症或损伤可用如本文所述的组合物治疗。在其它实施方式中，用如本文所述 的组合物治疗的病状可为自身免疫病症，诸如多发性硬化、类风湿性关节炎、Grave氏眼病、 牛皮癣或尿崩症。也可治疗移植排斥和移植抗宿主病。在其它实施方式中，用如本文所述 的组合物治疗的病状可为与细菌或病毒病原体相关的感染疾病。例如，该病状可为由链球 菌属的细菌（例如，肺炎链球菌，有时称为肺炎球菌或产脓链球菌）、不可分型流感嗜血杆 菌（NTHi)或绿脓杆菌引起的感染疾病。其它可治疗的感染疾病与病毒（例如，呼吸道合胞 病毒或流感病毒）相关。还可治疗汉森氏病、细菌、真菌或病毒诱发的脓毒症或脓毒性休克 (内毒素休克）。在其它实施方式中，用如本文所述的组合物治疗的病状可影响生殖或泌尿 生殖组织或器官。例如，该患者可为罹患与生殖器官的炎症相关的医学病状（例如，前列腺 炎、盆腔炎或引起生殖组织或器官的炎症的感染疾病）的患者。在其它实施方式中，用如本 文所述的组合物治疗的病状可影响骨骼肌肉系统。例如，患者可罹患炎症性关节炎、骨关节 炎、骨质疏松、炎症和细胞因子介导的慢性组织变性、肌肉耗损、恶病质或关节强硬性脊椎 炎。在其它实施方式中，用如本文所述的组合物治疗的病状可为药物诱发的麦角中毒、过敏 性结膜炎、春季结膜炎、肥胖症或胰腺炎。
[0065] 在一个实施方式中，本发明特征性描述了治疗罹患与生殖器官的炎症相关的医学 病状（例如，前列腺炎、盆腔炎或引起生殖生殖器官的炎症的感染疾病）的患者的方法。所 述方法可通过对该患者施用治疗有效量的包含上调圆柱瘤蛋白（CYLD)基因的表达或所编 码去泛素化酶的活性的药剂的药物组合物来进行。所述药剂可为上述的那些。或者或另 夕卜，该患者群体也可用治疗有效量的包含下调Akt基因的表达或抑制所编码激酶的活性的 药剂的药物组合物治疗。
[0066] 另一方面，本发明特征性描述了治疗罹患自身免疫性疾病、尤其是牛皮癣或类风 湿性关节炎的患者的方法。所述方法包括对该患者施用治疗有效量的包含上调圆柱瘤蛋白 (CYLD)基因的表达或所编码去泛素化酶的活性的药剂的药物组合物。在这些方法中，在上 文和本文中的其它地方描述的任何药剂都可配制成适合施用。因为牛皮癣影响皮肤，所以 旨在治疗该病状的制剂可为局部的。另外，且如所提到的，这些方法可使用抑制TOE4B、但不 显著抑制另一 Η)Ε4-家族成员（例如，TOE4D)的TOE4抑制剂进行。这些选择性抑制剂可 为使用本领域已知的方法设计以产生序列特异性靶向分子（例如，反义寡聚核苷酸、微RNA 和介导RNAi (例如，siRNA和shRNA)的核酸）的核酸（例如，核酸构建体）。在另一实施方 式中，上调CYLD的表达的药剂可为JNK2的抑制剂。
[0067] 在另一实施方式中，本发明特征性描述了通过对罹患自身免疫性疾病、尤其是牛 皮癣或类风湿性关节炎的患者施用治疗有效量的包含下调Akt基因的表达或抑制所编码 激酶的活性的药剂的药物组合物来治疗该患者的方法。
[0068] 在另一实施方式中，本发明特征性描述了治疗肥胖症的患者的方法。所述方法可 包括对该患者施用治疗有效量的包含上调圆柱瘤蛋白（CYLD)基因的表达或所编码去泛素 化酶的活性的药剂的药物组合物的步骤。可用于治疗肥胖症的药剂包括本文所述的那些药 剂中的任一种。例如，这些方法可使用抑制TOE4B、但不显著抑制另一 TOE4-家族成员（例 如，TOE4D)的TOE4抑制剂进行。例如，可设计反义寡聚核苷酸、微RNA或介导RNAi (例如， siRNA或shRNA)的核酸。在另一实施方式中，上调CYLD的表达的该药剂可为JNK2的抑制 齐U。在另一实施方式中，可施用治疗有效量的包含下调Akt基因的表达或抑制所编码激酶 的活性的药剂的药物组合物。
[0069] 本发明的化合物可用于预防或治疗多种人类或其它动物，包括哺乳动物和非哺乳 动物的病症，主要包括炎性病症及其它免疫有关疾病。预期本发明的活性分子如选择性地 抑制TOE4B表达的核酸可在使用前并入任何合适的载体中。活性分子的剂量、施用模式和 合适载体的使用将取决于预定的受体和目标病症。根据本发明的抑制剂的用于兽医用途和 用于人类医疗用途两者的制剂通常包含与可药用的载体相关的所述抑制剂。
[0070] 根据本发明的活性成分为用以上调CYLD的化合物且可为以下各物中的一种或多 种：（I) TOE4抑制剂（特别地，PDE4B抑制剂）；（2) JNK2的抑制剂；（3) Akt抑制剂；其可为核 酸（诸如反义寡聚核苷酸、微RNA和介导RNAi的核酸）或有机小分子化合物。如果需要， 本发明的活性剂则可在单一制剂中与其它治疗化合物组合。
[0071] 制剂和剂量：本发明的药物组合物的治疗有效量将取决于许多因素。例如，患者的 人种、年龄和体重、需要治疗的精确病状及其严重性和制剂的性质为本领域的技术人员所 考虑并理解的所有因素。施用量还可能取决于其它变量，诸如所递送的活性医药剂的相对 生物功效、在制剂中的赋形剂的存在和类型及施用路径。并且，应该理解初始施用剂量可增 加到超出上述上限以快速地达到所要的血液水平或组织水平，或该初始剂量可小于最佳剂 量且日剂量可在治疗过程期间根据特定的情形而逐渐增加。如果需要，日剂量则也可分成 多个剂量以便施用，例如每日施用2?4次。最终指定的治疗有效量将按照主治医师或兽 医的判断而不同。对于可在本发明中使用的治疗剂，其中的至少一些在本领域中已知，在本 文所述的病状的情况下施用的量可根据预先成功使用的量来指导。在治疗癌症、炎症、纤维 化或本文所述的任何特定病状的治疗用途中，药物组合物将以足以获得并维持活性剂在经 历将是有效的治疗的动物中的浓度（即，量、血液水平或组织水平）的剂量经口、肠胃外和 /或局部地施用。通常，该活性剂的剂量的有效量将在约0. 1?约l〇〇mg/kg体重/天的范 围内，更优选在约I. 0?约50mg/kg体重/天的范围内。
[0072] 如下文进一步描述地，本文所述的治疗剂可与一种或多种可药用的载体、稀释剂 或赋形剂组合，它们在与制剂的其它成分相容及不损害所治疗的患者的意义上是"可用 的"。
[0073] 所述制剂可以以剂量单位形式（有时也称作"单位剂型"）方便地存在且可通 过在制药领域中熟知的任何方法制备。通常，一些制剂可通过使医药剂与液态载体或 细分散的固态载体或两者结合且随后如果需要的话，则将产物成型为所要的制剂来制 备。用于施用的组合物可通过医药领域中熟知、例如描述在雷明顿药物学（Remington's Pharmaceutical Sciences), (Gennaro, Α·编），Mack Pub. (1990)中的任何方法制备。单位 剂型可根据所治疗的病状、施用路径和患者的年龄、重量和病状而包含作为非限制性实例 的0. 5mg?Ig的如本文所述的治疗剂。典型的单位剂量制剂为含有日剂量或亚剂量或其 适当部分的活性成分的那些。
[0074] 本发明的药物组合物应该配制成与其预定施用路径相容。施用路径的实例包括经 口或肠胃外施用，例如静脉内、皮内、吸入、经皮（局部）、经粘膜、耳局部和直肠施用。用于 肠胃外、皮内或皮下施用的溶液或混悬剂可包含以下组分：无菌稀释剂，诸如注射用水、盐 水溶液、固定油类、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂，诸如苄醇或对羟基苯 甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸；缓冲剂，诸 如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和用于调节张力的试剂，诸如氯化钠或右旋糖。pH可用诸如 盐酸或氢氧化钠的酸或碱调节。
[0075] 医药制剂可适合通过任何适当的路径，例如通过经口（包括颊或舌下）、直肠、鼻、 局部（包括颊、舌下或经皮）、阴道或肠胃外（包括皮下、肌肉内、静脉内或皮内）路径施用。 所述制剂可通过在制药领域已知的任何方法制备，例如通过使活性成分与载体或赋形剂结 合来制备。例如，但并未想要限制本发明，关于认为可使用本发明的化合物的某些病状和病 症，某些路径将比其它路径更优选。
[0076] 适合口服的医药制剂可提供为离散单位，诸如胶囊或片剂；粉末剂或颗粒剂；溶 液或混悬剂，其各自具有水性和非水性液体；可食用的泡沫体或气泡体；或水包油液体乳 液或油包水液体乳液。例如，为了以片剂或胶囊形式口服，可将活性药物组分与诸如乙醇、 甘油、水等经口无毒的可药用的惰性载体组合。通常，粉末剂通过将化合物粉碎成合适的细 小尺寸并将其与诸如可食用的碳水化合物如淀粉或甘露糖醇的适当药用载体混合来制备。 也可存在调味剂、防腐剂、分散剂和着色剂。
[0077] 胶囊可通过制备粉末、液体或悬浮液混合物并将其用明胶或其它适当的壳材料封 装而制得。在封装之前可将诸如胶体氧化硅、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸钙或固态聚乙二醇 的助流剂和润滑剂加到该混合物中。当摄取胶囊时，还可加入诸如琼脂、碳酸钙或碳酸钠的 崩解或增溶剂以改善药物的利用率。此外，当希望或需要时，也可将合适的粘合剂、润滑剂、 崩解剂和着色剂并入该混合物中。合适粘合剂的实例包括淀粉、明胶、诸如葡萄糖或β_乳 糖的天然糖、玉米甜味剂、诸如阿拉伯胶、黄蓍胶或海藻酸钠的天然和合成树胶、羧甲基纤 维素、聚乙二醇、石蜡等。
[0078] 可用于这些剂型的润滑剂例如包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸 钠、氯化钠等。崩解剂包括而不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、斑脱土、黄原胶等。
[0079] 片剂可例如通过制备粉末混合物、将其制粒或段塞（slugging)、加入润滑剂和崩 解剂和压制成片剂来配制。粉末混合物可通过混合适当粉碎的化合物与如上所述的稀释剂 或基质来制备。任选的成分包括粘合剂，诸如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶或聚乙烯基吡 咯烷酮；溶解延迟剂，诸如石蜡；再吸收加速剂，诸如季盐；和/或吸收剂，诸如斑脱土、高岭 土或磷酸二钙。该粉末混合物可用诸如糊浆、淀粉糊、阿卡迪亚胶浆或纤维素或聚合材料的 溶液湿式制粒并推动使其穿过筛子。作为制粒的替代，可使粉末混合物穿过压片机且结果 为分成颗粒剂的不完全形成的段塞块（slug)。颗粒剂可借助于加入硬脂酸、硬脂酸盐、滑石 粉或矿物油而润滑以防止粘到片剂形成模。随后将润滑的混合物压缩成片剂。本发明的化 合物也可与易流动的惰性载体组合并在不经历制粒或段塞步骤的情况下直接压缩成片剂。 可提供由虫胶封闭涂层、糖或聚合材料的涂层和石蜡的抛光涂层组成的透明或不透明的保 护涂层。可将染料加到这些涂层中以区分不同的单位剂量。
[0080] 在适当的情况下，可将用于口服的剂量单位制剂微封装。该制剂也可制备成例如 通过在聚合物、石蜡等中涂布或嵌入微粒材料而延长或减缓释放。
[0081] 诸如溶液、糊浆和酏剂的口服流体可以以剂量单位形式制备，使得指定的量含有 预定量的化合物。糊浆可例如通过将化合物溶解在合适调味的水溶液中来制备，而酏剂经 由使用无毒的醇媒剂来制备。混悬剂可通常通过将化合物分散在无毒媒剂中来配制。也可 加入增溶剂和乳化剂，诸如乙氧化异十八醇和聚氧乙烯山梨糖醇醚；防腐剂；调味添加剂， 诸如洋薄荷油或天然甜味剂、糖精或其它人工甜味剂；等。
[0082] 所述医药溶液制剂的合适包装可为旨在用于肠胃外用途的所有批准的容器，诸如 塑料和玻璃容器、备用的注射器等。在一个实施方式中，该容器为密封的玻璃容器，诸如小 瓶或安瓿。气密玻璃小瓶为密封的玻璃容器的一个实例。根据本发明的一个实施方式，提 供了在密封玻璃容器中的包含可生理学上使用的溶剂中的本发明化合物且具有利于稳定 性的适当PH的无菌可注射溶液。本发明化合物的酸式盐可比其游离碱配对物更易溶于水 溶液中，但当将酸式盐加到水溶液中时，溶液的pH可能太低而不适合施用。因此，具有高于 pH 4. 5的pH的溶液制剂可在施用之前与pH大于7的稀释溶液组合，使得所施用的组合制 剂的pH为pH 4. 5以上。在一个实施方式中，该稀释溶液包含可药用的碱,诸如氢氧化钠,且 所施用的组合制剂的pH为pH 5. 0?7. 0。在使溶液穿过杀菌过滤器之前可将诸如例如先 前规定种类的助增溶剂、张力调节剂、稳定剂和防腐剂的一种或多种其它组分加到溶液中。 [0083] 可将适合局部施用的医药制剂配制为软膏、乳膏、混悬液、洗剂、粉末剂、溶液、糊 齐IJ、凝胶剂、喷雾剂、气溶胶或油剂。
[0084] 为了治疗眼睛或例如口或皮肤的其它外部组织，可将制剂施用为局部软膏或乳 膏。当配制为软膏时，活性成分可与石蜡或水可混溶的软膏基质一起使用。或者，活性成分 可与水包油软膏基质或油包水基质一起配制在乳膏中。适合局部施用到眼睛的医药制剂包 括滴眼剂，其中活性成分溶解或悬浮在合适载体、特别是水性溶剂中。
[0085] 适合在口中局部施用的医药制剂包括锭剂、软锭剂和嗽口水。
[0086] 适合鼻施用的医药制剂包括具有例如在20?500微米范围内的粒度的粗粉，其中 载体为固体。该粉末以接受鼻烟，即通过从保持紧挨着鼻的粉末的容器经鼻道迅速吸入的 方式施用。适合作为鼻喷雾剂或作为滴鼻剂施用的制剂包含活性成分的水性或油性溶液， 其中载体为液体。
[0087] 适合通过吸入施用的医药制剂包括细粒粉剂或烟雾剂，其可借助于各种类型的计 入剂量加压气溶胶、喷雾器或吹入器产生。
[0088] 另外，本发明的组合物还可以用于本发明化合物的直肠施用的栓剂形式。这些组 合物可通过将药物与合适的无刺激性的赋形剂混合来制备，该赋形剂在常温下为固体，而 在直肠温度下为液体，且因此将在直肠中熔融以释放药物。这类材料例如包括可可脂和聚 乙二醇。适合直肠施用的医药制剂可提供为栓剂或灌肠剂。
[0089] 适合阴道施用的医药制剂可提供为子宫托、棉塞、乳膏、凝胶剂、糊剂、泡沫体或喷 雾制剂。
[0090] 适合肠胃外施用的医药制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，其可含有抗氧化 齐IJ、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预定受体的血液等渗的溶质；和可包含悬浮剂和增稠剂的水 性和非水性无菌混悬剂。所述制剂可存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和 小瓶，且可储存在仅需要在使用前一刻加入无菌液体载体如注射用水的冷冻干燥（冻干） 条件下。
[0091] 临时注射溶液和混悬剂可由无菌粉末剂、颗粒剂和片剂制备。
[0092] 除了上文特定提到的成分之外，所述制剂还可包含考虑所讨论的制剂类型而在本 领域中常规的其它试剂。例如，适合口服的制剂可包含调味或着色剂。
[0093] 新治疗剂的识别。另一方面，本发明提供了识别推定的医药剂（例如，抗癌剂、消 炎剂或抗纤维化剂）的方法。所述方法包括步骤：(a)提供测试药剂；(b)将该药剂暴露 于TOE4B且同时或单独地暴露于另一 Η)Ε(例如，PDE4D);和（c)测定编码TOE4B和另一 I3DE (例如，PDE4D)的基因的表达水平和/或所编码磷酸二酯酶的表达或活性的水平。抑制 PDE4B的表达或活性、但不显著抑制另一所测定的TOE(例如，TOE4D)的表达或活性的药剂 为用于治疗癌症、炎症或纤维化或本文所述或据发现另外受益于TOE4B抑制的消炎作用的 任何医学病状的推定抗癌、消炎或抗纤维化剂。在另一测定中，可进行以下步骤，包括：(a) 提供测试药剂；(b)将该药剂暴露于表达Akt的细胞；和（c)测定编码Akt的基因的表达水 平、所编码蛋白的去泛素化程度或其活性。调整（例如，抑制）Akt的表达、去泛素化程度或 活性的药剂为推定的抗癌、消炎或抗纤维化剂。
[0094] 实施例
[0095] 实施例1.抑制TOE4上调了 CYLD表达
[0096] 已经将磷酸二酯酶（PDE)视为治疗目标。实际上，已经成功地研发了作为有效治 疗剂的许多PDE抑制剂（例如，通过靶向TOE5用于治疗勃起功能障碍的VIAGRA?和通过 靶向TOE4用于治疗哮喘和COro的罗氟司特）。由于这个原因，我们起初设法确定PDE是否 充当CYLD的关键负调节剂。因为TOEl和TOE4在中耳（ME)中选择性地表达，所以我们首先 评价了特异性I 3DEl和TOE4抑制剂对由主要OM细菌性病原体NTHi诱发的CYLD上调的作 用。有趣的是，使用一般TOE4抑制剂咯利普兰和R 〇20-1724的TOE4的药理学抑制在在常规 和空气-液体界面培养条件两者下培养的人类中耳上皮细胞HMEEC、肺上皮细胞A549和人 类原代支气管上皮NHBE中在mRNA水平和蛋白水平两者下明显地增强了 NTHi-诱发的CYLD 上调。类似的结果还从用四种其它常用的临床NTHi株（1479、2019、3198和9274)处理的 细胞中见到。类似地，咯利普兰在如通过使用CYLD-特异性抗体进行实时定量PCR(Q-PCR) 和免疫荧光（IF)染色所评定在OM的公认的小鼠模型的中耳粘膜中也在mRNA水平和蛋白 水平下增强了 CYLD的上调。相比之下，PDEl特异性抑制剂没有展示出对CYLD上调的作用。 这些数据表明TOE4充当了用于CYLD的关键负调节剂。
[0097] 实施例2. TOE4的抑制导致了 NTHi-诱发的炎症的阻遏。
[0098] 我们紧接着确定TOE4抑制是否阻遏了 NTHi-诱发的炎症。正如所料，在通过Q-PCR 和ELISA评定的细胞中（具体地，在中耳上皮HMEEC、肺上皮A549和原代NHBE细胞中）， TOE4抑制剂咯利普兰在mRNA和蛋白水平下强力地抑制了 NTHi-诱发的NF- κ B激活和包 括 IL-I β、IL-8 和 TNF-α 的促炎介质（proinf lammatory mediator)的上调。一致地，在 小鼠的中耳中，咯利普兰也抑制了 NTHi-诱发的促炎介质上调。
[0099] 如通过在NTHi-接种的小鼠中的耳局部检验所评定的，咯利普兰的腹膜内（i. p.) 施用也抑制了 NTHi-诱发的OM的典型耳局部病变，包括鼓膜充血和肿胀及在大泡（bulla) 内的粘液流出物积聚。此外，如通过进行组织病理学分析所评定的，其还抑制在中耳粘膜中 作为OM的关键特征性病变的中耳粘膜增厚和多形核中性粒细胞（PMN)浸润。
[0100] 尽管显示了抑制roE4增强CYLD的上调并阻遏NTHi诱发的炎症，但是尚不明确抑 制TOE4是通过上调CYLD还是通过抑制炎症的正调节剂（例如，IKK β )来阻遏炎症。我们 发现TOE4抑制剂咯利普兰在CYLD用SiRNA CYLD消耗的HMEEC、Α549及原代NHBE细胞中 不再抑制NTHi-诱发的促炎标志物IL-I β、IL-8和TNF- α的上调。类似地，咯利普兰也 未能在CYLD-缺陷细胞中抑制NTHi-诱发的这些细胞因子的mRNA表达。此外，在小鼠 OM 模型中也证实了类似的结果。此外，咯利普兰（通过腹膜内施用）不再抑制NTHi-诱发的 IL-I β和MIP-2 (人类IL-8的小鼠同源物）的上调和在中耳粘膜中的中耳粘膜增厚和PMN 浸润。这些数据表明抑制TOE4通过上调CYLD来阻遏炎症。
[0101] 我们紧接着确定Η)Ε4抑制剂是否也可以经由直接抑制IKK β (NF-κ B依赖性炎症 的关键的正调节剂）来阻遏炎症。咯利普兰并不显著抑制通过过度表达组成性活化形式的 IKK β或野生型p65 (NF- K B的关键亚单元）诱发的NF- K β激活。
[0102] 实施例3. TOE4B涉及在负调节NTHi-诱发的炎症中。
[0103] 我们紧接着设法确定具体涉及哪种TOE4亚族成员。TOE4由编码咯利普兰敏感性 PDE的四种亚族基因 TOE4A?D组成。TOE4通过催化或降解cAMP而发挥其细胞功能，cAMP 为响应刺激物（例如，细菌性病原体）而调节许多病理过程的最重要的第二信使之一。我 们确定在体外HMEEC细胞中和在小鼠体内的中耳粘膜中以及在原代呼吸道上皮NHBE和细 胞系A549中TOE4B通过NTHi在mRNA和蛋白水平下被选择性地且明显地上调。与这些结 果一致地，PDE4B酶活性也通过NTHi被上调。
[0104] 总之，这些数据表明PDE4B在调节NTHi-诱发的炎症中起重要作用。有趣的是， 临床上可用的药物罗氟司特在HMEEC细胞中在比咯利普兰（10 μ M)低得多的浓度（低10 倍，1 μ Μ)下也明显地阻遏NTHi-诱发的炎性反应，罗氟司特是已知的相对于TOE4D来说对 PDE4B更具选择性的一种强效TOE4抑制剂。相比之下，与对TOE4B相比更具TOE4D选择性 的抑制剂西洛司特对NTHi-诱发的炎症没有展示出显著的抑制作用。这些发现具有特定的 推进和临床意义，因为目前临床有用的通用TOE4抑制剂由于它们对TOE4D的抑制作用而具 有严重的不良作用。
[0105] 实施例4. JNK2途径的参与情况。
[0106] 我们紧接着设法确定TOE4B如何经由抑制CYLD来介导NTHi-诱发的炎症。因为 MAP激酶（MAPK)在介导NTHi-诱发的宿主反应中起重要作用，所以我们确定了在使用对于 各种主要MPK具有特异性的抑制剂来调节CYLD的过程中MPK的参与情况。
[0107] 正如在体外HMEEC细胞中和在小鼠体内的中耳中所预期的，MPK JNK的抑制剂 (SP600125) (1 μ M)增强了由NTHi引起的CYLD上调且阻遏了炎症、而ERK或p38的抑制剂 则并非如此。有趣的是，PDE4抑制剂在已经用JNK抑制剂预先处理的HMEEC中不再进一步 增强NTHi-诱发的CYLD上调且不再进一步阻遏炎症。因为JNKl和JNK2代表了在中耳上 皮细胞中表达的两种主要的同种型，我们紧接着确定涉及哪种同种型。TOE4抑制剂选择性 抑制NTHi-诱发的JNK2激活；而不抑制JNKl，也不抑制其它MAPK。这些有趣的发现因此促 使我们进一步确定TOE4B是否经由JNK2的选择性激活、而不是JNKl途径来阻遏CYLD表达 并介导NTHi-诱发的炎症。此外，在CYLD-缺陷细胞中，JNK抑制剂也不再抑制NTHi-诱发 的炎症。这些数据表明TOE4经由JNK2途径而负调节CYLD并介导炎症。
[0108] 实施例5.通用TOE4抑制剂的耳局部接种后施用。
[0109] 上述数据证明，当全身性预施用时，在小鼠 OM模型中，通用TOE4抑制剂咯利普兰 上调了 CYLD并阻遏随后的炎症。这些数据因此促使我们直接试验接种后施用咯利普兰在 临床相关条件下对治疗中耳炎症是否具有任何治疗作用。当鼓膜病理性或因鼓膜置管插入 而手术性穿孔时，耳局部施用有效地起作用。因此，我们首先确定在NTHi接种后小鼠的中 耳中耳局部施用咯利普兰是否会上调CYLD并阻遏炎症。有趣的是，在小鼠 OM模型中，耳局 部接种前和接种后施用咯利普兰在体内均上调了 CYLD并阻遏了炎症。
[0110] 实施例6.体外使用SiRNA和KO细胞方法的TOE4B抑制。
[0111] 因为我们已经显示罗氟司特（强效且更具TOE4B特异性的抑制剂）增强CYLD表 达且抑制NTHi-诱发的炎症，所以我们可以通过使用PDE4B特异性siRNA以及TOE4B敲除 (KO)细胞方法抑制TOE4B来直接确定TOE4B是否充当在体外抑制CYLD表达并介导NTHi-诱 发的炎症的关键调节剂。
[0112] 可使用Q-PCR和蛋白印迹法监测敲除效率或缺陷。可进行TOE4B测定以监测TOE4B 活性的抑制。它们对CYLD表达的影响可使用Q-PCR和蛋白印迹法评定，且对炎性反应的影 响可使用所述的荧光素酶报道体测定、Q-PCR和ELISA评定。除了 HMEEC细胞之外，我们可 以使用在常规和空气-液体界面下培养的人类原代NHBE证实这些关键发现。此外，可使用 其它常见的NTHi临床菌株1479、2019、3198和9274证实使用菌株12获得的我们的发现的 通用性。
[0113] 实施例7. CYLD为肺纤维化的关键负调节剂。
[0114] 我们通过首先确定CYLD缺陷在由肺炎链球菌感染诱发的肺损伤小鼠模型中是否 导致肺纤维化发展来开始该研究。如在图Ia中所示，经受ALI的大部分WT小鼠看起来完 全恢复，而没有显著的病理改变。相比之下，如通过进行H&E染色所评价的，Cyld-/-小鼠 展示出标志性纤维化病理改变。另外，用三色染色的组织分析证明在肺炎链球菌接种的 Cyld-/-小鼠的肺中的显著胶原蛋白沉淀（染蓝色），而在WT小鼠中没有显著的胶原蛋白 沉淀。此外，Cyld-/-小鼠的肺炎链球菌接种肺也展示出超纤维化反应，与WT小鼠肺（图 Ib)相比较，产生纤维的基因 I型和III型胶原蛋白（C0L1A2和C0L3A1)、结缔组织生长因 子（CTGF)和PAI-I的表达增加。类似于致死量的肺炎链球菌，亚致死量的肺炎链球菌也展 示出纤维化作用，且与WT小鼠相比较，在Cyld-/-小鼠中，纤维化反应显著增强。因此，显 然，与感染的严重性无关，CYLD在紧密控制纤维化反应和预防纤维化方面具有关键作用。在 CYLD通过抑制P38MAPK-依赖性PAI-I表达1而充当PAI-I上调的负调节剂的基础上，我们 首先确定CYLD是否也经由抑制P38MAPK信号传导而抑制肺炎链球菌诱发的肺纤维化。有 趣的是，在这些Cyld-/-小鼠中，用p38-特异性抑制剂SB203580治疗并不影响肺纤维化。 该出乎意料的发现因此促使我们集中在确定P38-非依赖性分子机制，CYLD通过该机制预 防细菌感染后肺纤维化的发展。
[0115] 在肺纤维化中所涉及的许多信号传导途径之中，TGF-β -Smad信号传导对于调节 肺纤维化是关键性的，且已经显示肺炎链球菌诱发TGF- β -信号传导。因此，我们首先确定 肺炎链球菌是否诱发TGF- β -表达。在感染的晚期当纤维化发展时肺炎链球菌诱发TGF- β 表达，而在早期当诱发肺损伤时，其诱发迅速的Ρ38ΜΑΡΚ激活，接着在晚期失活。这些有趣 的结果可能很好地解释使用特异性抑制剂的Ρ38抑制为何在Cyld-/-小鼠中不影响肺纤维 化，且还可能暗含着TGF- β -Smad在介导肺炎链球菌诱发的肺纤维化中的重要作用。
[0116] 为了进一步确定我们在小鼠模型中的发现的临床关联性，对在患有肺纤维化的人 类患者的肺中CYLD蛋白的表达水平进行了测量并将其与在正常对照中的CYLD蛋白的表 达水平相比较。如在图Ic中所示，在患有纤维化的肺组织中的CYLD表达比在正常对照物 中的CYLD表达低得多。我们紧接着设法研究CYLD蛋白水平为何在患有纤维化的患者中较 低。因为发现TGF-β -表达在感染后期在组织损伤的恢复过程期间被上调，所以我们设法 确定TGF-β是否调节CYLD表达。实际上，在小鼠的肺组织中，CYLD的表达受到TGF-β抑 制。因此，合理的是提出TGF-β不仅可通过激活TGF-P-Smad信号传导途径（纤维化反应 的关键正调节剂）而促进组织纤维化，而且也可通过抑制CYLD (纤维化反应的负调节剂） 的表达而至少部分地促进组织纤维化。
[0117] 为了进一步评价我们的发现的通用性，我们紧接着设法确定在通过博来霉素诱发 的广泛使用的肺纤维化模型中CYLD是否也充当化学诱发的肺纤维化的关键负调节剂。有 趣的是，与WT小鼠相比较，在Cyld-缺陷的小鼠中博来霉素诱发的肺纤维化也显著增强。这 些数据因此表明经由抑制TGF-β -信号传导实现的CYLD的抗纤维化作用可能对于由其它 有害刺激物诱发的组织纤维化也是通用的。
[0118] 实施例8. CYLD经由抑制TGF- β -信号传导预防了肺纤维化。
[0119] 因为肺炎链球菌诱发TGF-β-信号传导且TGF-β-信号传导已知为在肺纤维 化的发展中所涉及的关键信号传导途径，所以我们使用包括短干扰RNA(SiRNA)的各种 方法确定CYLD是否抑制TGF-β-信号传导。正如所料，如先前所示（图2a、图2b)， siRNA-CYLD(siCYLD)在包括人类原代支气管上皮NHBE细胞的许多细胞类型中有效地降低 了内源CYLD蛋白表达且大大增强了 TNF-α -诱发的NF-κ B-Luc活性激活。有趣的是，采用 siCYLD的CYLD敲除在人类肺上皮Α549和海拉细胞中明显增强了 TGF- β -诱发的Smad-结 合元件（SBE)-依赖性启动子的活性和TGF-α -响应性PAI-I启动子活性以及PAI-I信使 RNA (图2c、图2d)。与这些结果一致地，siCYLD增强了 TGF-β-诱发的SBE-依赖性启动子 活性，而过度表达WT-CYLD，以剂量依赖性方式抑制了 TGF-β -诱发的SBE-依赖性启动子活 性（图2e)。我们紧接着在人类原代支气管上皮NHBE细胞中证实了该发现。如在图2f中 所示，在NHBE细胞中，siCYLD增强了 TGF- β -诱发的SBE-Luc活性，而过度表达WT-CYLD抑 制了 TGF-β -诱发的SBE-Luc活性。与使用siCYLD获得的结果相一致地，与WT MEF相比 较，在Cyld-/-小鼠胚胎成纤维（MEF)细胞中，CYLD缺陷也增强了 TGF- α -诱发的SBE-Luc 激活（图2g)。此外，在小鼠肺组织中，CYLD缺陷也明显地增强了包括PAI-I和CTGF的 TGF-调节的成纤维基因的诱发（图2h)。我们从这些数据中推断CYLD在体外和体内均负 调节TGF- β -信号传导。我们通过使用SB431542 (TGF- β -信号传导的特异性抑制剂）进 一步研究了 CYLD缺陷是否经由增强TGF- β -信号传导而导致肺纤维化。实际上，如在图2i 中所示，SB431542的全身性接种抑制了在肺炎链球菌接种的Cyld-/-肺中的肺纤维化，由 此证实CYLD缺陷经由增强TGF-β -信号传导而在细菌感染后导致肺纤维化。
[0120] 实施例9 :CYLD经由降低Smad3稳定性抑制了 TGF- β -信号传导。
[0121] 在识别了 CYLD为TGF- β -信号传导和肺纤维化的负调节剂的情况下，我们紧接着 设法确定CYLD如何抑制TGF- β -信号传导。TGF- β -配体结合至II型受体（Τ β RII)，其 动员了 I型受体（Τ β RI)并使I型受体（Τ β RI)磷酸化。激活的T β RI随后使称为受体激 活的Smad(R-Smad)如可结合到Co-Smad Smad4的Smad3的Smad子群憐酸化。R-Smad和 Co-Smad复合体随后经历了核移位以便目标基因调节。为了首先确定抑制TGF-β -信号传 导的CYLD的水平，我们利用了分别来源于WT MvlLu细胞且缺乏功能性T β RII和T β RI的 可用的肺上皮细胞系DR26和R1B。如在图3a中所示，siCYLD明显地增强了在T β RII-缺陷 的DR26细胞中的组成性活化的（C/A) -T β RI-诱发的SBE-Luc活性，表明通过CYLD敲除实 现的TGF-β -信号传导增强在T β RI的水平下或其下游出现，而不依赖于T β RII。我们紧 接着通过评定在T β RI-缺陷的RlB细胞中siCYLD对WT-Smad3-诱发的SBE-Luc活性的影 响而确定CYLD是否在T β RI的水平下或其下游对TGF- β -信号传导发挥其抑制作用。CYLD 敲除明显地增强了在RlB细胞中WT-Smad3-诱发的SBE-Luc激活，表明CYLD可在Smad3的 水平下或其下游抑制TGF-β-信号传导，而不依赖于T β RI (图3b)。为了进一步确定CYLD 是否通过可能祀向Smad3而抑制TGF-β -信号传导，我们紧接着评价了在Smad3-缺陷的 MEF细胞中CYLD敲除的影响。如在图3c中所示，在缺乏Smad3的情况下，siCYLD并不增强 SBE-Luc活性。相比之下，在用WT-Smad3重构的细胞中，siCYLD明显地增强了 SBE-Luc活 性，表明CYLD可在Smad3的水平下或其下游抑制TGF-β -信号传导。
[0122] 为了进一步确定CYLD如何经由Smad3抑制TGF-β-信号传导，我们紧接着通过使 用针对磷酸化Smad3的抗体评价CYLD对Smad3激活的影响。有趣的是，CYLD敲除不仅增 加磷酸化Smad3,而且增加总Smad3,而过度表达WT-CYLD不仅抑制磷酸化smad3,而且抑制 总Smad3 (图3d)。与WT对应物相比较，Smad3表达在Cyld-/-MEF和Cyld-/-小鼠肺两者 中也更高，而另一 R-Smad Smad2表达不受CYLD缺陷影响（图3f)。与这些结果一致地，与 正常对照物相比较，Smad3表达在患有肺纤维化的人类患者的肺中也较高（图3g)。
[0123] 此外，过度表达WT-CYLD明显地降低了内源Smad3和外源Smad3两者的表达，但不 降低SmacM蛋白的表达（图3h)，而对Smad3mRNA的水平没有影响（图3i)。有趣的是，用 MG132(特异性蛋白酶体抑制剂）处理逆转了 WT-CYLD-诱发的Smad3蛋白水平（图3j)和 TGF-β-诱发的PAI-I表达（图3k)的降低。总起来说，这些数据表明CYLD通过以蛋白酶 体依赖方式降低Smad3蛋白的稳定性而抑制TGF-β -信号传导。
[0124] 实施例10. CYLD经由Akt_GSK3 β -CHIP途径降低Smad3稳定性。
[0125] 因为CYLD为已知的去泛素化酶（DUB)，我们研究了 CYLD-诱发的Smad3降解是否 取决于其去泛素化活性。我们首先评定了 DUB-缺陷的CYLD突变体对Smad3基准水平和 TGF-β -诱发的SBE启动子活性的影响。如在图4a中所示，与WT-CYLD相比较，DUB缺陷的 CYLD突变体（H/N-CYLD和C/S-CYLD)未能诱发Smad3降解。在TGF- β -诱发的SBE启动子 活性中也观察到类似的结果（图4b)。这些数据表明CYLD以DUB活性依赖方式降低Smad3 稳定性。
[0126] 因为E3泛素连接酶在介导Smad3降解中具有关键作用且CYLD被称为去泛素化 酶，所以我们假设CYLD可能经由调节E3泛素连接酶而降低Smad3稳定性。在已经显示 CHIP的羧基端介导Smad3降解的基础上，我们首先确定CHIP是否通过使用siCHIP而介导 CYLD-诱发的Smad3降解。首先证实在A549细胞中siCHIP在降低CHIP表达中的效率。如 在图4c中所示，使用siCHIP的CHIP敲除在A549细胞中逆转了 WT-CYLD-诱发的Smad3减 少。在TGF- β -诱发的SBE启动子活性和PAI-I上调中也观察到类似的结果（分别，图4d、 图4e)。我们紧接着通过进行共-免疫沉淀实验检验了 CYLD是否与CHIP直接相互作用。 在CYLD和CHIP之间没有观察到直接物理相互作用，由此表明CYLD可能通过靶向CHIP的 上游分子而调节CHIP依赖性Smad3稳定性。
[0127] 鉴于已知的上游信号传导，在介导Smad3降解中涉及的分子，GSK3 0被显示在 介导Smad3降解中具有重要作用。我们因此确定在介导CYLD-诱发的Smad3降解中是否 涉及GSK3 0。如在图4f中所示，在A549细胞中，特异性GSK3 0抑制剂SB216763逆转了 WT-CYLD-诱发的Smad3减少。在TGF-β -诱发的SBE启动子活性中也观察到类似的结果 (图4g)，由此表明在通过CYLD介导Smad3稳定性的调节中涉及到GSK3 β。我们进一步进 行共免疫沉淀实验以确定GSK3 β是否与CYLD直接相互作用。在GSK3 β和CYLD之间没有 发现直接相互作用，表明在GSK30的远上游涉及另一信号传导分子。有趣的是注意到在体 外和体内都发现GSK3 0与CHIP直接相互作用（图4h、图4i)。其它实验证明GSK3 0磷酸 化通过肺炎链球菌诱发且通过CYLD缺陷增强（图4j、图4k)。因为已知GSK3 β的磷酸化 引起其激酶活性失活且CYLD缺陷增强GSK3 β磷酸化，我们预期CYLD可能通过抑制GSK3 β 磷酸化且因此促进GSK3 β -CHIP-介导的Smad3蛋白降解而诱发GSK3 β激酶活性。然而， GSK3 β如何调节CHIP-介导的Smad3蛋白降解仍然不明确。先前，已经报道Erk5MAPK依赖 Erk5激酶活性而调节CHIP的E3连接酶活性。因此，很可能GSK3 β可通过依赖GSK3 β激 酶活性结合CHIP而调节CHIP的Ε3连接酶活性。需要进一步研究来了解在CHIP Ε3连接 酶活性的GSK3 β -介导的调节下面的分子机制。
[0128] 我们紧接着设法确定在介导GSK3 β -依赖的Smad3蛋白降解中CYLD的直接分子 靶标。因为Akt被称为GSK3i3的主要上游调节剂，所以我们研究了 Akt是否介导CYLD-诱 发的Smad3降解。我们首先确定了肺炎链球菌是否诱发Akt的激活。如在图4j中所示，肺 炎链球菌诱发了 Akt和GSK3 β的磷酸化，但不诱发p70S6K的磷酸化，p70S6K代表PI3K途 径的另一下游靶标，这表明Akt-GSK3i3通过肺炎链球菌特异性激活。与这些结果一致地， 肺炎链球菌也以时间依赖方式上调Smad3蛋白表达（图4m)。该有意义的结果因此促使我 们通过首先检验Akt敲除对Smad3蛋白稳定性的影响来确定在介导CYLD-诱发的Smad3降 解中是否关键性地涉及Akt。
[0129] 实施例11. CYLD通过抑制Akt降低Smad3稳定性。
[0130] 我们发现Aktl和Akt2主要表达在Cyld+/+细胞和Cyld-/-细胞两者中，而Akt3 并非如此。因此，我们确定了在这些细胞中Aktl和Akt2的敲除对Smad3蛋白水平的影响。 如在图5a中所示，在WT和Cyld-缺陷的细胞中，Aktl/2的敲除显著地降低了 Smad3蛋白 表达。与该结果一致地，Akt敲除也抑制了由CYLD敲除诱发的TGF- β -诱发的SBE启动子 活性的增强（图5b)。类似地，在Cyld-/-MEF中，增强的TGF- β -诱发的SBE启动子活性也 受Akt-特异性抑制剂抑制（图5c)。此外，在Aktl-/-细胞中TGF-β-诱发的PAI-ImRNA 表达也因 Aktl-缺陷而明显降低，且在Aktl-/-细胞中，siCYLD不再增强TGF- β -诱发的 PAI-I表达。我们进一步证实Akt的激活是否确实经由Smad3诱发纤维化反应基因表达的 上调。Akt通过表达组成性活化的C/A-Akt实现的激活实际上在Smad3+/+细胞中诱发了 PAI-I和CTGF的表达，而在Smad3-/_细胞中并非如此。总之，这些数据提供了对于在介导 CYLD-依赖性Smad3降解中关键性涉及Akt的支援性证明。PI3K被称为在Akt上游的主要 信号传导分子之一。我们因此通过评价PI3K和Akt抑制剂对Smad3蛋白表达的影响而确 定PI3K是否像Akt -样在介导CYLD-依赖性Smad3降解中也涉及到。Akt抑制剂明显地降 低了 Smad3蛋白表达，而PI3K抑制剂LY294002不降低Smad3蛋白表达（图5d、图5e)。这 些结果相当出乎意料，因为众所周知PI3K和接着的PIP3对于Akt激活是完全限速性的（c completely rate-limiting)。因为在我们的研究中仅使用PI3K的化学抑制剂，所以我们 的数据并不完全排除在调节Akt-介导的Smad3调节中可能涉及PI3K。需要通过使用更具 体的方法进一步研究来确定Smad3的CYLD-Akt-介导的调节是否确实不依赖于PI3K。尽管 如此，这些数据表明CYLD经由负调节Akt而降低了 Smad3蛋白稳定性。
[0131] 为了进一步确定CYLD如何负调节Akt，我们首先通过进行共免疫沉淀实验检验了 CYLD是否在物理上与Akt相互作用。在图5f中的结果显示在用HA-CYLD和Flag-Akt共 转染的上皮细胞中，CYLD和Akt确实彼此物理结合。我们紧接着通过进行Duolink体内蛋 白-蛋白相互作用检测测定和共免疫沉淀测定以确定内源CYLD是否与内源Akt直接相互 作用且这一直接相互作用在肺炎链球菌处理时是否进一步增加。如在图5g、图5h中所示， 内源CYLD确实与内源Akt直接相互作用且肺炎链球菌处理增加了它们的直接相互作用。总 之，这些数据表明CYLD通过抑制Akt降低了 Smad3稳定性和TGF- β -信号传导。
[0132] 实施例12. CYLD使Κ63-泛素化Akt去泛素化以抑制Smad3。
[0133] 我们紧接着研究CYLD是否使Akt去泛素化。如在图6a中所示，共表达WT-CYLD、 但非DUB突变体（H/N-CYLD)降低了 Akt多聚泛素化。另外，在上皮细胞中，siCYLD也明 显地增强了肺炎链球菌诱发的Akt泛素化。我们随后确定了在缺乏和存在CYLD的情况下 肺炎链球菌是否诱发内源Akt泛素化。如在图6c、图6d中所示，在缺乏肺炎链球菌的情 况下检测到了内源Akt泛素化，且肺炎链球菌明显地增强了内源Akt泛素化。有趣的是， WT-CYLD的表达大大降低了肺炎链球菌诱发的内源Akt泛素化，而CYLD敲除或CYLD缺陷 则增强了肺炎链球菌诱发的内源Akt泛素化。因为已经显示Akt经历K63多聚泛素化，我 们紧接着确定CYLD是否特定地使K63-多聚泛素化Akt去泛素化。如在图6e中所示，共表 达WT-CYLD明显地降低了 K63-多聚泛素化Akt，但不降低K48-多聚泛素化Akt。一致地， 在图6f中的结果指示在无细胞体系中重组CYLD蛋白（GST-rCYLD)使K63-连接的多聚泛 素化的Akt (HisrAkt)在体外以剂量依赖方式直接去泛素化。此外，CYLD的缺陷也增强了 肺炎链球菌诱发的Akt的K63-多聚泛素化（图6g)。合起来，这些数据提供了在无细胞体 系中在体外和在内源条件下在体内两者中CYLD通过与K63-多聚泛素化Akt直接相互作用 并使K63-多聚泛素化Akt去泛素化而负调节Akt的强有力的证据。
[0134] 因为在Akt的普列克底物蛋白（pleckstrin)同源域中的K14赖氨酸对于介导其 功能是关键性的，所以我们紧接着确定K14赖氨酸突变成精氨酸（R)是否降低了 Akt的多 聚泛素化。实际上，与WT-Akt相比较，K14R、而不是K8R、K20R和K30R，明显地降低了 Akt 的K63-连接的多聚泛素化（图6h)。我们进一步确定在Akt中的K14残基实际上对于介 导CYLD-诱发的TGF-β -信号传导抑制在功能上是否为关键性的。如在图6i中所示，表达 WT-CYLD显著抑制了在用WT-Akt或K20R而不是用K14R共转染的上皮细胞中的TGF- β -诱 发的SBE启动子活性，由此证明在Akt的PH域中的Κ14在介导通过CYLD实现的TGF- β -信 号传导抑制中的关键作用。先前显示TNF受体相关因子6(TRAF6)充当用于Akt-K63多聚泛 素化的E3连接酶，并且CYLD使TRAF6去泛素化。因此，我们接着探索CYLD可经由使TRAF6 去泛素化而抑制Akt-介导的纤维化反应的可能性。使用siCYLD的CYLD敲除在TRAF6-贫 乏细胞中仍然增强了 TGF- β -诱发的纤维化反应，由此表明CYLD至少部分地通过与Akt直 接相互作用并使其去泛素化而抑制Akt-介导的纤维化反应。
[0135] 评论：在本发明研究中，我们提供了识别CYLD去泛素化酶作为预防肺炎链球菌 感染之后肺纤维化发展的关键负调节剂的证据。CYLD抑制了 TGF-β-信号传导且由此经 由以GSK3 β -CHIP-依赖方式降低Smad3蛋白的稳定性而预防纤维化。此外，CYLD通过使 K63-多聚泛素化Akt直接去泛素化而降低Smad3蛋白稳定性，这又引起GSK3 0激活（图 7a)。CYLD缺陷经由在肺损伤之后增强的Smad3-蛋白稳定性而产生增强的纤维化反应（图 7b)。CYLD在感染的早期肺损伤阶段通过经由特异性抑制p38信号传导而抑制肺炎链球菌 诱发的PAI-I表达来促进细菌诱发的肺损伤并降低宿主存活率；且如在我们的当前研究中 所示，在感染的晚期组织重塑阶段，CYLD通过经由降低Smad3稳定性而抑制TGF- β -Smad信 号传导来预防肺纤维化的发展。因此，在肺损伤的整个伤口愈合过程期间，CYLD充当关键 的调节剂。
[0136] 先前，有证据表明TNF受体相关因子6(TRAF6)充当Akt-K63多聚泛素化的Ε3连接 酶，且CYLD使TRAF6去泛素化。在该研究中，我们提供了在Akt和CYLD之间的直接相互作 用的实验证据，并且显示CYLD在内源条件和外源条件两者下都确实使Akt直接去泛素化。 可能的是CYLD可通过使TRAF6实际上去泛素化而抑制Akt-介导的纤维化反应。因此，我 们使用siTRAF6评价在TRAF6-贫乏细胞中siCYLD对TGF-β -诱发的纤维化反应的影响。 有趣的是，在TRAF6-贫乏细胞中，CYLD敲除仍然引起TGF- β -诱发的纤维化反应增强。尽 管如此，这些数据证明CYLD通过与Akt至少部分地直接相互作用并使其去泛素化而确实抑 制了 Akt-介导的纤维化反应。在此，我们提供了 CYLD经由抑制Akt、由此使CYLD经Akt连 接到Smad3而抑制肺炎链球菌诱发的Smad3-依赖性纤维化的强有力的证据。Akt的直接激 活是否经由Smad3诱发纤维化反应仍不明确。实际上，Akt通过表达组成性活化形式的C/ A-Akt直接激活Akt在Smad3+/+细胞中诱发了纤维化反应基因 PAI-I和CTGF的表达，而在 Smad3-/_细胞中并非如此。总起来说，显然CYLD-依赖性Akt去泛素化的纤维化作用实际 上经由TGF-β -Smad3途径特别地介导。
[0137] 在我们提供的实验数据的基础上，很明显在由感染剂引起的肺损伤中在伤口愈合 反应中CYLD通过抑制TGF-β -信号传导调节了肺纤维化。因为TGF-β -信号传导在调节 组织纤维化反应中具有必要的作用，所以我们相信CYLD对于负调节由诸如苛性化学品的 其它有害刺激物诱发的纤维反应也是关键性的。因此，我们设法确定在由博来霉素诱发的 广泛使用的肺纤维化模型中CYLD是否也充当化学诱发的肺纤维化的关键负调节剂。有趣 的是，在Cyld-缺陷小鼠中，CYLD缺陷明显地增强了博来霉素诱发的肺纤维化。这些数据 因此表明CYLD在纤维化反应中的抑制作用不仅对于由感染剂诱发的组织纤维化、而且对 于由诸如苛性化学品的其它有害刺激物诱发的组织纤维化都可为通用的，只要是该纤维化 主要经由TGF-β -Smad信号传导介导。
[0138] 方法。如下所述的方法可用于进行上述研究，且本领域的普通技术人员将认识到 这些方法中的一些或全部（例如,核酸构建体和介导RNAi的核酸的产生）可用于实践如本 文陈述的发明。
[0139] 细胞培养和试剂。将Α549、海拉和ΗΕΚ293细胞保持在具有Earle氏平衡盐溶液 (EMEM)和DMEM闪烁剂的F12-K、Eagle氏最低必需培养基中。将WT貂MvlLu细胞和两种 突变体细胞系DR26和RlB细胞用补充有非必需氨基酸的EMEM保持。将来自Smad3-/-、 Cyld+/+和Cyld-/-小鼠的MEF保持在DMEM中。将人类原代支气管上皮NHBE(Cambrex) 细胞保持在补充有支气管上皮生长培养基single Quot的支气管上皮生长培养基中。重 组TGF- β 1 (在上文指示为TGF- β )和TNF- α自R&D system购买；Akt抑制剂（1L6-羟甲 基-手性-肌醇-2 (R) -2-0-甲基-3-0-十八烷基-sn-丙三氧基碳酸酯）和SB203580得 自 Calbiochem ;SB431542 和博来霉素得自 Sigma ;MG132 得自 American Peptide。体外泛 素化和去泛素化测定试剂盒自Boston Biochem购买。Duolink体内蛋白-蛋白相互作用检 测测定试剂盒得自 Olink Bioscience。重组His-Akt 和 His_GSK3i3 得自 Calbiochem。用 于TGF- β和总及磷酸化-p38MAPK的ELISA测定试剂盒分别从R&D system和Invitrogen 购买。
[0140] 实时定量RT-PCR分析。总RNA使用TRIzoI试剂按照生产商的说明书分离。由 总RNA合成互补DNA用MultiScribe逆转录酶进行。实时定量PCR使用ABI 7500序列 检测系统（Applied Biosystems)进行。mRNA的相对量使用比较阈值循环法计算且使用 人类和小鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶作为内源对照物进行标准化。小鼠 C0L1A2、C0L3A1、 CTGF 和 PAI-I 及人类 PAI-1、CHIP 和 Smad3 的引物序列如下。小鼠 CTGF :5' -GTAACCGGGGA GGGAAATTA-3' （SEQ ID N0:1)和 5'-ACAGCTGGACTCAGCCTCAT-3' （SEQ ID N0:2);小鼠 C0L1A2:5'-GACAAATGAATGGGGCAAG-3'（SEQIDN0:3)和5'-CAATGTCCAGAGGTGCMTG-3'（SEQ ID N0:4)；小 ? C0L3A1 ： 5'-CGAAGATGGCAAAGATGGAT-3' (SEQ ID NO: 5) 和 5' -GCCACTAGGACCCCTTTCTd (SEQ ID NO : 6)；小 鼠 PAI-I ： 5，-GTAGCACAGGCACTGCAAAA-3，（SEQ ID N0:7)和 5，-TGAGATGACAAAGGCTGTGG-3，（SEQ ID N0:8)；人类 PAI-I :5'-CCCTTTGCAGGATGGAACTA-3, (SEQ ID NO: 9) 和 5' -ATGGCAATGTGACTGGAACA-S'（SEQ ID NO: 10);人类 CHIP: 5'-CCCGGCCCCTATACATAGTT-3'（SEQ ID NO:ll)和 5'-CAGTCCAGAGTCCAACAGCA-3'（SEQ ID NO:12)。
[0141] 质粒、转染和荧光素酶测定。先前描述了表达质粒Flag-WT-CYLD、HA-WT-CYLD、 Flag-H/N-CYLD、HA-C/S-CYLD、Flag-WT-Smad3、C/A-TPRI 和报道体质粒 SBE-Luc、 PAI-卜Luc 和 NF-kB-Luc。Flag-WT-Aktl、pRK5-HA-Ub WT、pRK5-HA-Ub K63 和 pRK5-HA_Ub K48得自Addgene，且Akt的K?R突变体使用QuickChange XL定点诱变试 剂盒（Stratagene)用WT-Aktl产生。所有瞬时转染都使用TransIT-LTl试剂（Mirus)或 Lipofectamine (Invitrogen)根据生产商的说明书进行。
[0142] RNA-介导的干扰。用于下调CYLD表达的RNA-介导的干扰使用pSuper-CYLD进 行且 siCYLD 的序列为 5'-GATCCCCGAGCTACTGAGGACAGAAATTCAAGAGATTTCTGTCCTCAGTAGCTC TTTTTGGAAA-3'（SEQ ID NO: 13)。用于 Akt 和 CHIP 的人类和小鼠 siRNA 得自 Dharmacon， 且使用 siAkt 和 siCHIP 敲除 Akt 和 CHIP 用 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)进行。革巴 向人类 AktU人类 CHIP、小鼠 Aktl 和小鼠 Akt2 的 siRNA 的 ON-TARGETplus SMARTpool 由 四种 siRNA 组成且 siRNA 的序列如下：人类 siAktl (5' -CAUCACACCACCUGACCAA-3'（SEQ ID N0:14)、5'-ACAAGGACGGGCACAUUAA-3' （SEQ ID N0:15)、5'CAAGGGCACUUUCGGCAAG-3' （SEQ ID N0:16)、5，-UCACAGCCCUGAAGUACUC-3，（SEQ ID N0:17);人类 CHIP(5，-CGCUGGU GGCCGUGUAUUA-3'（SEQ ID N0:18)、5'-GUGGAGGACUACUGAGGUU-3'（SEQ ID N0:19)、 5'-GAAGGAGGUUAUUGACGC A-3'（SEQ ID N0:20)、5'-UGGAAGAGUGCCAGCGAAA-3'（SEQ ID N0:21))；小 ? Aktl (5'-CUGCAGAACUCUAGGCAUC-3' (SEQ ID NO:22), 5'-GAUCAAGGAUGGUGCCACU-3' （SEQ ID N0:23)、5'-GAGGUUGCCCACACGCUUA-3' （SEQ ID N0:24)、5'-CGACGUAGCCAUUGUGAAG-3'（SEQ ID N0:25);小鼠 Akt2(5'-CCAUGAA UGACUUCGAUUA-3'（SEQ ID N0:26)、5'-GUACUUUGAUGACGAGUUC-3'（SEQ ID N0:27)、 5'-CCUGAACAAUUUCUCU⑶A-3'（SEQ ID N0:28)、5'-GAUGCGGGCUAUCCAGAUG-3'（SEQ ID NO:29))〇
[0143] 蛋白质印迹、免疫沉淀和泛素化实验。蛋白质印迹、免疫沉淀和泛素化实验如下 进行。蛋白质印迹使用全细胞提取物进行，将其在8%或10% SDS-PAGE凝胶上分离并转 移到聚偏二氟乙烯膜。该膜用含有〇. 1%吐温20 (PBS-T)和5% BSA的PBS溶液封闭。随 后将该膜在一级抗体在5% BSA-PBS-T中的1:2, 000稀释液中温育。在PBS-T中洗涤三 次之后，将该膜用相应二级抗体在3%脱脂牛奶-PBS-T中的1:5, 000稀释液中温育。相 应蛋白通过使用增强的化学荧光检测试剂根据生产商的说明书显影。为了进行免疫沉淀 分析，将细胞溶解产物在4°C下用1 μ g -级抗体温育过夜，接着用蛋白A/G-琼脂糖珠粒 (Invitrogen)温育2小时。随后将免疫沉淀物悬浮在样品缓冲剂中，在8% SDS-PAGE上分 离，转移到聚偏二氟乙烯膜上，且通过如上所述的免疫印迹分析进行检测。针对以下各物 的抗体自Cell Signaling购买：总-Akt、在T308和S473处的磷酸化-Akt、总Smad3、磷酸 化-Smad3、总p70S6K、在T389处的磷酸化-p70S6K、总GSK3 β、在S9处的磷酸化-GSK3 β、小 鼠 HA-Tag、His-Tag和小鼠和兔的抗-泛素；针对以下各物的抗体得自Santa Cruz :CYLD、 总-Aktl/2/3、山羊总-Aktl、Smad4、兔HA-Tag、小鼠泛素和肌动蛋白；FLAG和β -肌动蛋白 得自Sigma。
[0144] 体内蛋白-蛋白相互作用检测测定。将A549细胞在组织培养载玻片上培养且用肺 炎链球菌或对照物温育历时在附图中指示的时间。将细胞用2yg πιΓ1的一级小鼠抗-Akt 抗体和兔抗-CYLD抗体染色，且在Akt和CYLD之间的蛋白-蛋白相互作用根据生产商的说 明书（Duolink亲近连接测定，01ink Bioscience)用二级亲近探针、抗-兔MINUS和抗-小 鼠 PLUS使用Duolink体内蛋白-蛋白相互作用检测测定试剂盒检测。
[0145] 小鼠和动物实验。Cyld-/-小鼠通过如下同源重组产生。设计靶向构建体以用 IRES-LacZ/MCl-Neo盒破坏外显子2和3。将靶向质粒线性化且转染到129/S的胚胎干 细胞中。将同源重组的胚胎干细胞注入囊胚中，随后将囊胚转移到寄母畜，以产生嵌合子 代。将产生的嵌合子代回交到C57BL/6J，且种系传递通过PCR用尾部DNA证实。Cyld基 因的纯合敲除通过在MEF细胞和肺组织中通过RT-PCR进行的mRNA检测和通过蛋白质印 迹分析进行CYLD蛋白检测证实。对于在WT和Cyld-/-小鼠中肺炎链球菌诱发的严重感 染，将麻醉的小鼠用活肺炎链球菌（5x IO7CFU/小鼠）气管内（i.t.)接种。在肺炎链球 菌感染2周后将经受住严重肺炎的小鼠处死以便组织病理学分析。对于TGF-β接种，将 麻醉的WT和Cyld-/-小鼠用TGF-M25?IOOng/小鼠）气管内接种6小时，且随后对肺 组织进行总mRNA和蛋白质提取。在使用化学抑制剂的实验中，将SB431542(10mg kg_〇或 SB203580(20mg kg，或等体积的媒介对照在气管内接种肺炎链球菌前1?2小时经腹膜 路径施用。对于博来霉素诱发的纤维化模型，将动物用博来霉素（3单位/kg体重）气管内 接种2周。随后对肺组织进行组织分析及总mRNA和蛋白质提取。所有动物实验都经在罗 切斯特大学（University of Rochester)和乔治亚州立大学（Georgia State University) 的实验动物管理与使用委员会（Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC) 批准。
[0146] 将Cyld-/-小鼠和正常对照及肺纤维化患者用苏木精和曙红（H&E)染色，以显现 肺炎症，且进行Masson三色染色以突出显示组织纤维化。针对CYLD和Smad3的免疫组织 化学染色使用ABC染色系统（Santa Cruz)进行。简单来说，将组织切片用Iyg-级抗体 或对照IgG温育，接着用PBS洗涤三次。随后将组织用1 μ g生物素化二级抗体温育，接 着用AB酶试剂温育。在洗涤三次之后，用过氧化物酶底物进行显色反应。对照和来自患 者的纤维化肺组织在韩国全南国立大学（Chonnam National University)的机构审查委 员会（Institutional Review Board，IRB)的批准下自全南国立医院（Chonnam National Hospital)获得。
[0147] 实施例13. PDE4B通过抑制MKP-I的表达而介导肺炎链球菌诱发的粘蛋白MUC5AC 表达，其进而引起增强的MAPK ERK激活。
[0148] 在证明了 TOE4在调节MUC5AC诱发中的关键作用（数据没有示出）的情况下，我们 紧接着设法确定特别涉及哪种TOE4亚族成员。TOE4由编码咯利普兰-敏感性PDE的4种 亚族基因 TOE4A?D组成。我们首先确定TOE4是否通过肺炎链球菌上调。如使用Q-PCR所 评定，在人类中耳HMEEC细胞中，PDE4B通过肺炎链球菌明显地上调，而TOE4A却并非如此。 在小鼠的中耳粘膜中以及在人类原代NHBE细胞和呼吸道上皮细胞系A549中也观察到类似 的结果。另外，如通过进行蛋白质印迹分析所评定的，在HMEEC细胞中观察到了在蛋白水平 下由肺炎链球菌引起的TOE4B上调。与这些结果一致地，PDE4B酶活性也通过肺炎链球菌上 调。总之，这些数据表明TOE4B在调节肺炎链球菌诱发的粘蛋白MUC5AC上调中可能起重要 作用。为了进一步探索是否需要TOE4B，我们紧接着进行了 TOE4B的siRNA敲除。PDE4B的 小干扰RNA(siRNA)购自Dharmacon (Lafayette, CO)。siRNA按照生产商的说明书且如先前 描述使用 Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Grand Island, NY)转染到上皮细胞中（Ha 等， J. Immunol. 178:1736 ?1747, 2007 ;Ishinaga 等，Biochem. J. MI: 583 ?591，2009 ;Lim等， Cell Microbiol·!^: 2247 ?2256, 2008 ;Lim 等，PLoS One 2, el032, 2007)。我们首先确定 PDE4B-siRNA在降低PDE4B表达中的效率。PDE4B表达通过PDE4B-siRNA明显地降低。紧 接着，我们确定H)E4B-siRNA的作用。在人类中耳上皮HMEEC细胞中，PDE4B-siRNA在mRNA 水平下明显地抑制肺炎链球菌诱发的MUC5AC上调。另外，使用H)E4B-SiRNA的TOE4B敲除 显著地增强了肺炎链球菌诱发的MKP-ImRNA表达。合起来，这些数据提供了 TOE4B经由抑 制MKP-I而在调节肺炎链球菌诱发的粘蛋白MUC5AC上调中起重要作用的直接证据。
【权利要求】
1. 一种治疗罹患与耳、鼻、鼻道、喉咙、肺或支气管树的炎症相关的医学病状的患者的 方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的包含上调圆柱瘤蛋白（CYLD)基因的表 达或所编码去泛素化酶的活性的药剂的药物组合物。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述医学病状为中耳炎、鼻炎、窦炎或引起耳、鼻、 鼻道、喉咙或肺的炎症的感染疾病。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述患者为婴儿或儿童。
4. 根据权利要求1所述的方法，其中上调CYLD基因表达的所述药剂为表达CYLD或其 生物活性变体的核酸构建体。
5. 根据权利要求1所述的方法，其中上调CYLD基因表达的所述药剂为磷酸二酯酶 4(PDE4)的抑制剂或c-junN-末端激酶2(JNK2)的抑制剂。
6. 根据权利要求5所述的方法，其中上调CYLD基因表达的所述药剂为TOE4的抑制剂。
7. 根据权利要求6所述的方法，其中所述TOE4的抑制剂为咯利普兰、罗氟司特或西洛 司特。
8. 根据权利要求6所述的方法，其中所述TOE4的抑制剂为被取代的苯或包含一个或两 个环氮的被取代的6元杂芳基环，所述取代包括醚、硫醚或胺基团，其中在所述醚、硫醚或 胺上的烷基为卤烷基。
9. 根据权利要求8所述的方法，其中所述卤烷基为氟甲基、二氟甲基或三氟甲基。
10. 根据权利要求5所述的方法，其中所述TOE4的抑制剂抑制TOE4B，但不显著抑制 PDE4D。
11. 根据权利要求6或10所述的方法，其中所述TOE4的抑制剂为抑制TOE4B基因表达 的核酸。
12. 根据权利要求11所述的方法，其中所述核酸为反义寡聚核苷酸、微RNA或介导 RNAi的核酸。
13. 根据权利要求5所述的方法，其中上调CYLD基因表达的所述药剂为JNK2的抑制 剂。
14. 根据权利要求13所述的方法，其中所述JNK2的抑制剂为任选连接细胞穿透肽TAT 或2, 4-二氨基嘧啶的JNK相互作用蛋白（JIP)或其肽片段。
15. 根据权利要求13所述的方法，其中所述JNK2的抑制剂为抑制JNK2基因表达的核 酸。
16. 根据权利要求1所述的方法，其中所述药物组合物配制成适合耳局部施用。
17. -种治疗罹患与耳、鼻、鼻道、喉咙或肺的炎症相关的医学病状的患者的方法，所述 方法包括向所述患者施用治疗有效量的包含下调Akt基因的表达或抑制所编码激酶的活 性的药剂的药物组合物。
18. 根据权利要求17所述的方法，其中所述医学病状为中耳炎、鼻炎、窦炎或引起耳、 鼻、鼻道、喉咙或肺的炎症的感染疾病。
19. 根据权利要求17所述的方法，其中所述患者为婴儿或儿童。
20. 根据权利要求17所述的方法，其中下调所述Akt基因的表达的所述药剂为抑制所 述Akt基因的核酸。
21. 根据权利要求20所述的方法，其中所述核酸为反义寡聚核苷酸、微RNA或介导 RNAi的核酸。
22. 根据权利要求17所述的方法，其中抑制所编码激酶的活性的所述药剂为表达使 Akt去泛素化的酶的核酸构建体。
23. 根据权利要求22所述的方法，其中所述酶为CYLD。
24. 根据权利要求17所述的方法，其中抑制所编码激酶的活性的所述药剂为VQD-002、 哌立福新或米替福新。
25. 根据权利要求17所述的方法，其中所述药物组合物配制成适合耳局部施用。
26. -种治疗罹患与生殖器官的炎症相关的医学病状的患者的方法，所述方法包括向 所述患者施用治疗有效量的包含上调圆柱瘤蛋白（CYLD)基因的表达或所编码去泛素化酶 的活性的药剂的药物组合物。
27. 根据权利要求26所述的方法，其中所述医学病状为前列腺炎、盆腔炎或引起生殖 器官的炎症的感染疾病。
28. -种治疗罹患与生殖器官的炎症相关的医学病状的患者的方法，所述方法包括向 所述患者施用治疗有效量的包含下调Akt基因的表达或抑制所编码激酶的活性的药剂的 药物组合物。
29. -种治疗罹患自身免疫性疾病的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗 有效量的包含上调圆柱瘤蛋白（CYLD)基因的表达或所编码去泛素化酶的活性的药剂的药 物组合物，其中所述自身免疫疾病为牛皮癣或类风湿性关节炎。
30. -种治疗罹患自身免疫性疾病的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗 有效量的包含下调Akt基因的表达或抑制所编码激酶的活性的药剂的药物组合物。
31. -种治疗肥胖症患者的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的包含上 调圆柱瘤蛋白（CYLD)基因的表达或所编码去泛素化酶的活性的药剂的药物组合物。
32. -种治疗肥胖症患者的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的包含下 调Akt基因的表达或抑制所编码激酶的活性的药剂的药物组合物。
33. -种识别治疗剂的方法，所述方法包括： (a) 提供测试药剂； (b) 将所述药剂暴露于TOE4B和TOE4D;和 (c) 测定编码TOE4B和TOE4D的基因的表达水平和/或所编码磷酸二酯酶的活性水平， 其中抑制TOE4B的表达或活性、但不显著抑制TOE4D的表达或活性的药剂为用于癌症、炎症 或纤维化的治疗的潜在治疗剂。
34. -种治疗罹患癌症、炎性疾病或纤维化的患者的方法，所述方法包括向所述患者施 用治疗有效量的包含抑制TOE4B的表达、但不显著抑制TOE4D的表达的核酸的药物组合物。
35. 根据权利要求34所述的方法，其中所述核酸为反义寡聚核苷酸、微RNA或介导 RNAi的核酸。
【文档编号】A61P29/00GK104379180SQ201380029324
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年4月9日 优先权日:2012年4月10日
【发明者】李建东 申请人:佐治亚州立大学研究基金会公司