风轮菜总黄酮在制备用于阿霉素诱导心脏毒性的保护作用药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了风轮菜总黄酮在制备用于阿霉素诱导心脏毒性的保护作用药物中的应用。本发明所述的风轮菜总黄酮可以是风轮菜总黄酮的药物组合物，包括口服及肠胃外给药形式的各种剂型。用于口服时，可以是片剂、胶囊、软胶囊、口服液、糖浆、颗粒、滴丸、口崩片、缓释片、缓释胶囊、控释片、控释胶囊；用于肠胃外给药途径时，可以是水针、冻干粉针、无菌粉针、输液。本发明药物组合物优选片剂和水针剂型。
【专利说明】风轮菜总黄酮在制备用于阿霉素诱导心脏毒性的保护作用药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于医药【技术领域】，更具体地，本发明涉及一种药用活性成分在制备药物中的应用，尤其涉及在风轮菜总黄酮制备药物中的应用。
【背景技术】
[0002]阿霉素是蒽环类抗生素，自20世纪60年代发现并应用于多种癌症的治疗，现在仍然是最有效的抗癌药物之一。适用于恶性淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、骨及软组织肉瘤等多种肿瘤。但由于严重的心脏毒性，其临床应用受到一定影响。近年来，对阿霉素心脏毒性的研究较多，阿霉素中毒分为急性毒性、亚急性毒性和慢性毒性。急性中毒发生于单次使用或一个疗程后，常见症状有低血压、心律失常、心脏功能不全等，偶尔可发生心肌梗死，常伴有肝、肾功能损伤。因此评估阿霉素心脏毒性程度及寻找可以有效解除其心脏毒性的物质就成为目前亟待解决的问题，但目前尚缺乏有效预防和治疗方法。
[0003]唇形科风轮菜属植物全球有20余种，在我国主要分布于浙江、江苏等省。该属植物多为民间用药，其中风轮菜和荫风轮被《中国药典》2010年版收载为断血流药物，具有收敛止血之功效。现代药理学研究表明，它具有多种药理作用，如抗炎，抗氧化，抗菌活性。最近，也有报道其对心血管系统具有保护作用。风轮菜中黄酮类化合物含量丰富。通过系统研究风轮菜总黄酮(Total f lavones from Clinopodium chinense (Benth.) 0.Ktze, TFCC)对阿霉素诱导的心肌细胞损伤及心脏毒性的保护作用及分子机制，风轮菜总黄酮与阿霉素联合用药显著提高阿霉素的心脏毒性，且不影响其抗肿瘤作用。
【发明内容】
[0004]本发明公开了风轮菜总黄酮在制备用于心肌细胞保护作用的药物中的应用；
[0005]更具体地，本发明公开了风轮菜总黄酮在制备用于阿霉素诱导心脏毒性的保护作用药物中的应用；
[0006]本发明所述的上 述应用，所述的风轮菜总黄酮为药物组合物，由风轮菜总黄酮与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂制成药物组合物。
[0007]本发明所述阿霉素诱导心脏毒性的保护作用的药物为风轮菜总黄酮的药物组合物，所述药物组合物最小单元所含活性成分风轮菜总黄酮的量为2.5-100mg。
[0008]本发明所述的风轮菜总黄酮药物组合物为临床上任何可接受的剂型形式，包括口服及肠胃外给药形式的各种剂型。用于口服时，可以是片剂、胶囊、软胶囊、口服液、糖浆、颗粒、滴丸、口崩片、缓释片、缓释胶囊、控释片、控释胶囊；用于肠胃外给药途径时，可以是水针、冻干粉针、无菌粉针、输液。本发明药物组合物优选片剂和水针剂型。
[0009]上述药物组合物，所述药学上可接受的载体或赋形剂可选自适用于口服制剂的药用赋形剂，包括填充剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、表面活性剂、吸附载体等。
[0010]上述药物组合物，所述药学上可接受的载体或赋形剂可选自适用于注射剂的药用赋形剂，包括溶剂、抗氧剂、助溶剂、吸附剂、渗透压调节剂、PH调节剂。
[0011]药物组合物最小单元是指一片，一颗胶囊，一袋颗粒或一支注射剂等。
[0012]本发明剂型可使用药物制剂工艺学本领域熟练技术人员所公知的惯常使用的任何方法产生并且对此没有特别限制。
[0013]例如，本发明片剂可通过使用本领域公知的合适的方法粒化、干燥和筛分主要药剂和赋形剂、粘合剂等等，向所得混合物中加入润滑剂等等然后混合并形成片剂。造粒可通过本领域公知的任何合适的方法进行，例如湿法造粒、干法造粒或加热造粒。合适的非限制性实例包括使用高速搅拌造粒机、流动造粒干燥机、挤压造粒机或滚筒压紧器进行这些造粒方法。此外，例如干燥和筛分的方法可以根据进行造粒的需要进行。主要药剂、赋形剂、粘合剂、润滑剂等等的混合物还可直接形成片剂。
[0014]如果需要薄膜包衣，可以使用本领域已知的任何薄膜包衣装置，并且作为薄膜包衣基质，合适的实例包括糖衣基、亲水膜包衣基、肠溶薄膜包衣基和缓释薄膜包衣基。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1风轮菜总黄酮对阿霉素诱导的大鼠心脏损伤的保护作用；大鼠分为正常组，TFCC (80mg/kg)组，DOX组和D0X+TFCC(20，40，80mg/kg)组。大鼠给药结束后分别进行如下处理。测量心重、体重，计算心体比；取血测量血清心肌三酶的含量；取心脏进行HE染色分析，比较各组之间的差异。(A) TFCC可以改善阿霉素引起的心重和体重降低。(B) TFCC降低阿霉素引起的心肌三酶升高。(C) TFCC减轻阿霉素引起的心肌病理损伤。
[0016]图2风轮菜总黄酮对阿霉素诱导的心肌细胞损伤保护作用；(A)阿霉素(O μ Mto3 μ Μ)可以浓度依赖性的降低心肌细胞存活率。(B)TFCC(O μ g/ml to50 μ g/ml)对心肌细胞存活没有影响。(C)TFCC可以浓度依赖性的保护阿霉素(I μ Μ)诱导的心肌细胞活力降低。(D) TFCC可以降低阿霉素(I μ Μ)诱导的细胞上清LDH的释放。
[0017]图3风轮菜总黄酮与阿霉素联用对心肌组织及心肌细胞中抗氧化相关酶活性的结果；收集正常组，模型组及风轮菜总黄酮与阿霉素联用组的大鼠心肌组织及H9C2心肌细胞，测定其中CAT, MDA, SOD和GSH-Px的活性。阿霉素组MDA水平升高，CAT, SOD和GSH-Px活性降低；风轮菜总黄酮可以减弱这种改变。
[0018]图4风轮菜总黄酮减轻阿霉素诱导的心肌细胞活性氧自由基的产生。通过免疫荧光染色和流式细胞仪分析，比较各组心肌细胞ROS的产生。阿霉素组ROS产生显著增加，TFCC可以降低ROE水平。
[0019]图5风轮菜总黄酮抑制阿霉素诱导的心肌组织和心肌细胞凋亡；(A)H0echst33342荧光染色检测细胞凋亡及坏死。(B)荧光测定法检测Caspase-3活性。(C)TFCC减轻阿霉素诱导的心肌组织凋亡。(D) TFCC减轻阿霉素诱导的心肌细胞凋亡。
[0020]图6风轮菜总黄酮与阿霉素联用对阿霉素抗肿瘤作用没有影响。
【具体实施方式】
[0021]下面结合【具体实施方式】对本发明做进一步详细说明，不构成对本发明的进一步限制。
[0022]实施例1风轮菜总黄酮与阿霉素联用对体内心肌的保护作用[0023]实施例1.1体内阿霉素所诱导的大鼠心肌病模型建立
[0024]6-8周鼠龄的SD大鼠(北京维通利华，北京，中国)。动物适应I周并且期间自由获取食物和水。80只大鼠随即分为6组:正常对照组(control);风轮菜总黄酮单给药组(TFCC，80mg/kg);阿霉素模型组(D0X，3mg/kg);阿霉素与风轮菜总黄酮联合给药组(20、40、80mg/kg)。正常组及模型组口服给予纯净水，其他各组给予同体积相应浓度的TFCC。15天后，模型组及联合给药组腹腔注射阿霉素隔天注射，共3次，其他组注射同体积的生理盐水。最后一次给药14天后，进行处理。
[0025]实施例1.2心脏重量及体重比较及心肌三酶检测
[0026]称量体重，在水合氯醛麻醉下腹主动脉取血。血样在采集后一小时内在3000g下离心10分钟，随后血衆中LDH, AST, CK的活性根据厂商说明书，通过从JianchengBio-engineering Institute (南京，中国)购买的商业检测试剂盒来测定。
[0027]结果如图1-A所示，与正常组相比，阿霉素组心脏重量及体重明显下降，而联合给药组可以显著上升。如图1-B，阿霉素组血液中的心肌三酶含量显著上升，而联合给药组可以显著降低。[0028]实施例1.3形态学检查
[0029]心脏组织用4%的多聚甲醛固定。5mm的组织切片用苏木精和曙红染色。在光学显微镜下进行形态学检查。
[0030]结果如图1-C所示，正常组和风轮菜但给药组:组织结构基本正常。模型组:大面积心肌纤维溶解断裂，多量出血。阿霉素+风轮菜总黄酮组:少量心肌纤维溶解断裂。
[0031]实施例2:风轮菜总黄酮对体外心肌细胞的保护作用
[0032]实施例2.1阿霉素诱导的H9c2细胞损伤模型
[0033]大鼠心肌细胞H9C2 (胚胎期BDlX大鼠心脏组织的亚克隆细胞系)(中国科学院上海细胞库)在添加胎牛血清的达尔贝克改良的Eagle’ s培养基中，于37°C下5%C02的条件下培养。细胞经常地传代并在实验前继代培养到90%的集合。细胞以1*105的密度接种于96孔板培养36h。风轮菜总黄酮(O, 0.25, 0.5, I, 2, 3 μ mol)预处理4h后，每孔加入5mg/mlMTT (0.1mg/每孔)并孵育4h.。弃上清,每孔加150 μ I DMSO溶解,570nm酶标仪(Spectraf luor, TECAN, Sunrise, Austria)检测吸光度。
[0034]结果如图2-A所示，阿霉素浓度依赖性的降低细胞存活率，其中阿霉素I μ mol作用24h，细胞存活率为50.97%，确定为模型条件。
[0035]实施例2.2风轮菜总黄酮对H9c2心肌细胞的影响
[0036]H9c2心肌细胞以1*105的密度接种于96孔板培养36h。风轮菜总黄酮(0，
6.25, 12.5, 25, 50 μ g/ml)预处理 4h 后，每孔加入 5mg/ml MTT (0.1mg/ 每孔)并孵育 4h.。弃上清，每孔加 150 μ I DMSO 溶解，570nm 酶标仪(Spectraf luor, TECAN, Sunrise, Austria)检测吸光度。
[0037]结果如图2-B所示，风轮菜总黄酮(0，6.25，12.5，25, 50 μ g/ml)对心肌细胞无增殖及毒性作用。
[0038]实施例2.3风轮菜总黄酮对阿霉素诱导的H9c2心肌细胞毒性的保护作用
[0039]大鼠心肌细胞H9C2 (胚胎期BDlX大鼠心脏组织的亚克隆细胞系)以1*105的密度接种于96孔板.风轮菜总黄酮(0，6.25，12.5，25，50 μ g/ml)预处理4h后，阿霉素I μ M作用24h,之后每孔加入5mg/ml MTT (0.1mg/每孔)并孵育4h。弃上清，每孔加150 μ I DMSO溶解，570nm 酶标仪(Spectraf luor, TECAN, Sunrise, Austria)检测吸光度。
[0040] 结果如图2-C所示，风轮菜总黄酮可以浓度依赖性的保护阿霉素诱导的心肌细胞死亡。其中风轮菜总黄酮剂量25 μ g/ml达到最大保护作用。
[0041 ] 实施例2.4LDH释放测定
[0042]大鼠心肌细胞H9C2 (胚胎期BDlX大鼠心脏组织的亚克隆细胞系)以1*105的密度接种于96孔板。风轮菜总黄酮(0，6.25，12.5，25，5(^8/1111)预处理411后，阿霉素14皿作用24h，，之后收集上清。LDH水平根据LDH试剂盒说明书测定。
[0043]结果如图2-D所示，I μ M DOX可以显著提高LDH释放。而加入25 μ g/ml TFCC预处理后，LDH活性可以显著降低。LDH是细胞出现死亡的标志，结果证明TFCC能够保护DOX诱导的心肌细胞死亡。
[0044]实施例3风轮菜总黄酮及阿霉素对心肌组织及心肌细胞抗氧化能力的影响测定
[0045]心肌组织与生理盐水按1:9匀浆，4000d离心IOmin,保留上清；H9C2心肌细胞药物处理完成后，用超声仪破碎，离心取上清。随后按说明书检测组织及细胞中GSH-PX，MDA，SOD, CAT 的活性,通过从 Jiancheng Bio-engineering Institute (南京，中国)购买的商业检测试剂盒来测定。
[0046]结果如图3所示，阿霉素可以引起心肌组织和细胞MDA水平升高，SOD, CAT，GSH-PX的水平降低，而风轮菜总黄酮则可以减轻MDA水平，提高SOD，CAT, GSH-PX水平。
[0047]实施例4H9C2心肌细胞ROS产生测定
[0048]ROS水平根据总ROS检测试剂盒操作说明书进行检测。TFCC(25 μ g/ml)预处理4h后，阿霉素ΙμΜ作用24h，之后收集`细胞并用IX洗液洗一次，之后用100 μ I的carboXy-H2DCFDA(终浓度25μΜ)在黑暗中37°C孵育30min。流式细胞仪检测。细胞点于玻片上，处理同上，最后至于荧光显微镜下观察。
[0049]结果如图4所示，与正常组相比，TFCC预处理可以降低DOX诱导的ROS释放，而DOX处理组可以提高ROS水平。ROS产生会促使细胞损伤和凋亡进程，结果证明TFCC能够保护DOX诱导的心肌细胞氧化应激损伤。
[0050]实施例5风轮菜总黄酮减少阿霉素诱导的心肌凋亡
[0051]实施例5_lHoechst33342 染色
[0052]利用Hoechst33342染色，并通过荧光显微镜检测细胞死亡水平。H9c2细胞于玻片36小时。TFCCB(25 μ g/ml)预处理4h后，阿霉素I μ M作用24h，之后细胞于5mg/mlHoechst33342避光孵育15分钟，并用PBS洗2次，用正置荧光显微镜获取图像。
[0053]结果如图5-A所示，通过正置荧光显微镜成像，正常组细胞被染成低蓝色，阿霉素组可观察到亮蓝色荧光，而TFCC预处理组可以明显改善阿霉素导致的形态变化。
[0054]实施例5-2CASPASE-3活性分析
[0055]Caspase-3 活性通过突光激活的 caspase-3 染色试剂盒(BioVision, CA, USA),按操作说明进行测定。TFCCB (25 μ g/ml)预处理4h后，阿霉素I μ M作用24h，之后300yL(lX106cells/mL)细胞液加入 I μ L FITC-DEVD-FMK 底物在黑暗中 37°C孵育 Ih0 荧光通过酶标仪在激发波长485nm和发射波长535nm下进行测定。
[0056]结果如图5-B所示，I μ M DOX可以提高caspase-3活性，而加入TFCC后可以抑制阿霉素诱导的caspase-3活化。
[0057]实施例5-3TUNEL染色
[0058]心肌组织固定切片，心肌细胞处理如5-2，按照说明书进行TUNEL染色，正置荧光显微镜下获取照片。
[0059]结果如图5-C所示，DOX组心肌组织及H9C2心肌细胞凋亡明显，而加入TFCC预处理后明显减少心肌凋亡。
[0060]实施例6风轮菜总黄酮与阿霉素联用对阿霉素抗肿瘤作用的影响
[0061]分别采用口腔癌、肝癌、乳腺癌细胞，按1*105点于96孔板，培养36h，TFCC (25 μ g/ml)预处理4h后，阿霉素I μ M作用24h,之后每孔加入5mg/ml MTT (0.1mg/每孔)并孵育4h。弃上清，每孔加 150 μ I DMSO 溶解，570nm 酶标仪(Spectraf luor, TECAN, Sunrise, Austria)检测吸光度。
[0062]结果如图6，相比于正常组，阿霉素组细胞生存率明显下降，具有显著意义，风轮菜总黄酮与阿霉素联用组与阿霉素组没有差异。即风轮菜总黄酮对阿霉素抗肿瘤作用没有影响。
[0063]显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发明的精 神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
【权利要求】
1.风轮菜总黄酮在制备心肌细胞保护作用的药物中的应用。
2.风轮菜总黄酮在制备用于阿霉素诱导心脏毒性的保护作用药物中的应用。
3.权利要求1~2任一所述的应用，其中风轮菜总黄酮为风轮菜总黄酮的药物组合物，是由风轮菜总黄酮与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂组成。
4.根据权利要求3所述的应用，其中所述药物组合物最小单元所含活性成分风轮菜总黄酮的量为2.5-100mgo
5.根据权利要求3所述的应用，其中所述的风轮菜总黄酮药物组合物为临床上任何可接受的剂型形式。
6.根据权利要求1-4之一所述的应用，其中所述的剂型形式包括口服及肠胃外给药形式的各种剂型；用于口服时，可以是片剂、胶囊、软胶囊、口服液、糖浆、颗粒、滴丸、口崩片、缓释片、缓释胶囊、控释片、控释胶囊；用于肠胃外给药途径时，可以是水针、冻干粉针、无菌粉针、输液。
7.根据权要求1-4之一所述的应用，其中所述的药学上可接受的载体或赋形剂可选自适用于口服制剂的药用赋形剂，包括填充剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、表面活性剂、吸附载体等；也可选自适用于注射剂的药用赋形剂，包括溶剂、抗氧剂、助溶剂、吸附剂、渗透压调节剂、PH调节 剂。
【文档编号】A61K31/704GK103816218SQ201410026172
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年1月20日 优先权日:2014年1月20日
【发明者】孙晓波, 孙桂波, 许旭东, 陈荣昌 申请人:中国医学科学院药用植物研究所