Smc的应用及用于防治阿尔茨海默病的药物和保健品的制作方法
【专利摘要】本发明公开SMC的应用及用于防治阿尔茨海默病的药物和保健品，其中，将SMC用于制备防治阿尔茨海默病的药物或保健品。SMC是一个具有很好的抗氧化、抗炎症、抗恶性细胞增殖的作用的化合物，同时具有低毒性，结构明确，含量稳定、人体内代谢机理清晰等优点。因此，SMC能用于开发一种新型治疗和预防AD的药物或保健品。
【专利说明】SMC的应用及用于防治阿尔茨海默病的药物和保健品
【技术领域】
[0001]本发明涉及医疗保健领域，尤其涉及一种SMC的应用及用于防治阿尔茨海默病的药物和保健品。
【背景技术】
[0002]阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease, AD)是一组病因尚未明确的原发性退行性脑变性疾病。目前全球已经有超过3500万的AD患者。随着社会人口老龄化逐步加剧，AD发病率呈逐渐上升趋势，65岁人群中发病率大约为10%，而85岁人群中这一比例可高达50%。中国这方面情况更为严重，目前60岁以上的人口已达1.78亿，预测到2050年将达到
4.37亿，届时AD将成为老年人的第一杀手。由于AD的致残率较高，对人类健康造成严重危害。同时，对AD的医疗和照料还耗费了大量人力和财力，因此AD已成为除心脑血管病、糖尿病、癌症外严重影响人类健康的第4号杀手，成为一个棘手的社会和医疗卫生问题。AD的病理特征主要包括两方面:一是神经细胞外以淀粉样蛋白(Αβ)沉积为核心形成老年斑(senile plaques, SP), SP 是 A β 前体(amyloid precursor protein, APP)异常降解形成的不溶解性Αβ 42斑块，对神经元有毒性作用；另一方面则是神经细胞内Tau蛋白过度磷酸化形成的神经纤维缠结 (NFT)。AD的发病机理十分复杂，可能是多种因素相互作用的结果，迄今为止其确切的发病机制尚不清楚。
[0003]近年来对AD的治疗研究已取得一定的进展，研发出不少新的药物，归纳目前临床上常用的药物主要有以下几类:影响胆碱系统功能药物(包括胆碱酯酶抑制剂、Ach受体激动剂)；脑血循环改善剂；脑代谢激活剂；纠正钙稳态失调、抗氧化、抗炎药物；神经营养因子等。这些药物多存在疗效不确切或毒副作用大、口服吸收差的缺点，并且它们均是依据相应发病机理假说而进行的尝试，都是一些“治标”的方法，不能有效防止AD的迅速发展。正处于临床研究中的具有防治AD作用的降脂药、激素类物质则由于特异性不强或不易透过血脑屏障而预测不到良好的应用前景。
[0004]硒作为一种微量元素，其抗癌作用已被广泛研究。硒在自然界以有机硒和无机硒两种形式存在。实验证明，无机硒化合物具有蓄积性毒性和致突变作用，而有机硒化合物因为其经过甲基化等脱毒过程，不但能够更好地发挥硒的抗癌作用，而且在激发免疫反应上也比无机硒显著。L-硒-甲基硒代半胱氨酸(L-Se-methylselenocysteine, SMC)属于天然有机硒化物，广泛存在于多种食物中，能够有效抑制肿瘤细胞的增殖、诱导其凋亡，并能抑制多种癌基因的表达，因而是一较好的肿瘤化学预防剂。
【发明内容】
[0005]鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种SMC的应用及用于防治阿尔茨海默病的药物和保健品，旨在提供一种新的防治阿尔茨海默病的药物和保健品。
[0006]本发明的技术方案如下:
SMC的应用，其中，将SMC用于制备防治阿尔茨海默病的药物或保健品。[0007]—种用于防治阿尔茨海默病的药物，其中，所述用于防治阿尔茨海默病的药物的组成成分包括SMC。
[0008]所述的用于防治阿尔茨海默病的药物，其中，所述用于防治阿尔茨海默病的药物将SMC和药学上可接受的载体制成片剂、注射剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、微丸、散剂、滴丸剂、汤剂、糖浆剂、合剂、煎膏剂或浸膏剂剂型的药物。
[0009]一种用于防治阿尔茨海默病的保健品，其中，所述用于防治阿尔茨海默病的保健品的组成成分包括SMC。
[0010]有益效果:本发明所提供一种SMC的应用及用于防治阿尔茨海默病的药物和保健品，在本发明中，将SMC用于防治AD疾病的开发与研究，并在原代神经细胞和AD模型鼠两个水平上验证了 SMC对AD的预防和治疗效果。因此，本发明中提供一种SMC的新应用，将SMC用于制备防治阿尔茨海默病的药物或保健品。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1是本发明实施例1中以CCK-8法检测SMC对神经细胞活力的影响的结果。
[0012]图2是本发明实施例2中SMC抑制神经细胞内活性氧自由基(ROS)水平的结果。
[0013]图3是本发明实施例3中SMC促进原代神经细胞生长的结果。
[0014]图4是本发明实施例3中SMC促进原代神经细胞突触后蛋白的表达水平的结果。 [0015]图5是本发明实施例3中SMC促进原代神经细胞突触前蛋白的表达水平的结果。
[0016]图6是本发明实施例3中SMC抑制原代神经细胞tau蛋白磷酸化(PS404)水平的结果。
[0017]图7是本发明实施例4中SMC抑制原代神经细胞tau蛋白磷酸化(PS396)水平的免疫印迹实验结果。
[0018]图8是本发明实施例4中SMC抑制原代神经细胞tau蛋白磷酸化(PS396)水平的
定量结果。
[0019]图9是本发明实施例4中SMC抑制原代神经细胞APP蛋白水平的免疫印迹实验结
果O
[0020]图10是本发明实施例4中SMC抑制原代神经细胞APP蛋白水平的定量结果。
[0021]图11是本发明实施例5中SMC提高AD模型小鼠的空间探索和记忆能力的结果。
【具体实施方式】
[0022]本发明提供一种SMC的应用及用于防治阿尔茨海默病的药物和保健品，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0023]AD作为公认的发病率及危害性最高的老年性疾病之一，目前尚无有效的治疗药物。L-硒-甲基硒代半胱氨酸(L-Se-methylselenocysteine, SMC)是一种新型硒源类的食品营养强化剂，与无机硒相比具有更低的生物毒性，而与其它有机硒相比，具有结构明确，含量稳定、人体内代谢机理清晰等优点。富硒酵母、硒化卡拉胶、硒蛋白、富硒食用菌粉等产品中硒的含量不是固定的，因为硒的有效补充剂量与中毒计量比较接近，所以富硒酵母、硒化卡拉胶、硒蛋白、富硒食用菌粉的食用安全性存在一定的风险。SMC与硒代蛋氨酸是自然界仅有的两种含硒氨基酸，与硒代蛋氨酸相比，SMC具有较高的食用安全性。SMC在过去一直作为抗癌药物作为研究以及开发。
[0024]而本发明中，则将SMC用于防治AD疾病的开发与研究。在原代神经细胞和AD模型鼠两个水平上验证了 SMC对AD的预防和治疗效果。发现:(I) SMC促进原代神经细胞生长，并降低细胞内的氧化压力；(2)SMC提高突触相关蛋白的表达水平；(3)SMC抑制tau蛋白的磷酸化；(4) SMC降低APP的蛋白水平；(5) SMC提高小鼠的学习记忆能力。因此，SMC可在多靶点抑制AD的发生，发展，有望成为一种稳定、安全、有效的AD治疗药物。因此，本发明中提供一种SMC的新应用，将SMC用于制备防治阿尔茨海默病的药物或保健品。
[0025]本发明中还提供一种用于防治阿尔茨海默病的药物，所述用于防治阿尔茨海默病的药物的组成成分包括硒甲基硒代半胱氨酸。所述用于防治阿尔茨海默病的药物可以将硒甲基硒代半胱氨酸和药学上可接受的载体制成片剂、注射剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、微丸、散剂、滴丸剂、汤剂、糖浆剂、合剂、煎膏剂或浸膏剂剂型的药物。
[0026]本发明中还提供一种用于防治阿尔茨海默病的保健品，所述用于防治阿尔茨海默病的保健品的组成成分包括硒甲基硒代半胱氨酸。
[0027]以下通过实施例对本发明做进一步说明。
[0028]实施例1:以CCK-8法(细胞活性与增殖检测试剂盒)检测SMC对神经细胞活力的影响
CCK-8试剂中含水溶性四唑盐-WST-8，它在电子载体1-Methoxy PMS存在的情况下能够被还原成水溶性的甲臜染料，该物质生成量与活细胞的数量成正比。细胞增殖越多越快，则颜色越深，细胞毒 性越大，则颜色越浅。因此可直接用于细胞增殖和毒性分析，具体步骤如下:
(1)取对数生长期N2A细胞消化成单细胞悬液，调节细胞浓度为5X IOVmL,按每孔100UL接种于96孔细胞培养板中，37°C，5 % CO2培养箱中培养24 h ；
(2)弃去旧的培养液，用无血清培养基重复洗三次，再分别加入200UL含有各药物浓度梯度的无血清DMEM培养基，使SMC终浓度分别为O μ mol/L、l μ mol/L、3 μ mol/L、5 μ mol/L、7 μ mol/L、10 μ mol/L，每组3个复孔。不含PBS无血清DMEM培养基作为对照组，继续培养24 h ；
(3)每孔加20μ L的CCK-8试剂，放入培养箱培养2-4 h (分别在0.5、1、2、4 h检测)后，用酶标仪于波长为450 nm及650 nm测定各孔吸光度值(OD)；
(4)细胞活力定义:以450nm的光吸收值/650 nm的光吸收值，作为细胞活力。
[0029]检测结果如图1所示，检测范围内的各浓度SMC对细胞的存活率均有一定的促进作用，其中以3 μ mol/L的作用效果最好。说明SMC对神经细胞的生长具有一定的促进作用。
[0030]实施例2:以流式细胞技术检测SMC对神经细胞内活性氧自由基(ROS)水平的影响 活性氧检测试剂盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit)是一种利用突光探针
DCFH-DA来进行活性氧的检测的试剂盒。DCFH-DA探针本身是不能发荧光的，但是可以自由穿过细胞膜。而细胞内的酯酶能够将进入细胞内DCFH-DA探针水解生成DCFH。产生的DCFH不能自由透过细胞膜，因此该探针很容易被装载到细胞内。而在细胞内，ROS可以将无荧光的DCFH氧化生成有荧光的DCF。因此可以通过检测细胞内DCF的荧光强度来检测细胞内ROS水平。具体操作步骤如下:
(1)取对数 生长期的N2a细胞消化成单细胞悬液，调节细胞浓度为2.5 X 105/mL,按每孔2 mL接种于6孔细胞培养板中，37°C，5% CO2培养箱中培养24h ;
(2)弃去旧的培养液，用无血清培养基重复洗三次，再分别加入2mL含有各药物浓度梯度的无血清DMEM培养基，使SMC终浓度分别为O μ mol/L、I μ mol/L,3 μ mol/L,5 μ mol/L、7 μ mol/L、10 μ mol/L每组3个复孔，继续培养24 h ；
(3)用无血清DMEM培养基按照1:1000比例稀释DCFH-DA，使其终浓度为10μ m/L。去除培养皿里的细胞培养液，加入2 mL稀释好的DCFH-DA。然后在37°C细胞培养箱内，孵育20 min,再用无血清的DMEM培养基洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA ；
(4)胰酶消化后收集细胞，1000rpm，4°C离心3 min，弃上清，用预冷的PBS洗涤3次。用PBS重悬细胞，400目细胞筛过滤，流式细胞仪进行检测。使用488 nm激发波长，525 nm发射波长。
[0031]检测结果如图2所示，以检测范围内的各浓度SMC处理N2a细胞后，细胞内的ROS水平均明显降低，说明SMC具有显著抑制神经细胞内ROS水平的作用。
[0032]实施例3:以免疫荧光检测SMC对原代神经细胞各AD相关蛋白表达水平的影响
a、原代细胞培养
本发明中所用的原代神经细胞取自3XTg AD模型小鼠，该小鼠转入APPswe、PSlM146V和TauP301L三种AD相关基因，表现出典型的AD病理特征。
[0033]从出生一天的3XTg AD胎鼠大脑中分别获取上皮层组织，经过木瓜酶消化吹打后得到原代神经细胞，培养在放有细胞爬片的24孔板中。细胞培养到第七天后以终浓度为3μΜ的SMC处理24小时后进行免疫荧光检测。以相同培养条件下无SMC处理的原代神经细胞作为对照组。
[0034]实验前准备工作:制备4%PFA、0.2%Triton、10%山羊血清封闭液、DAP1、封片剂(甘油/PBS)、指甲油、Timer，PBS预冷，准备冰盒与冰袋。具体操作步骤如下:
(1)提前半小时将4%PFA解冻，60°C水浴溶解；
(2)加4%PFA固定15min，每孔1ml，冰上进行；
(3)预冷PBS洗3次,每孔lml，分别洗5min、10 min、15 min,冰上进行；
(4)0.2%Triton 透膜 lOmin，每孔 500 μ 1，冰上进行；
(5)封闭液封闭Ih以上，每孔300μ 1，置于4°C冰箱/冰上；
(6)加一抗4°C过夜，母液300μ I封闭液；
(7)一抗回收，PBS洗3次，每孔I ml，每次5min，冰上进行；
(8)加二抗1:200，母液300 μ I封闭液，常温下避光放置Ih以上；
(9)回收二抗，？83洗3次，分别洗511^11、101^11、151^11，在冰上避光进行；
(10)5μ g/mlDAPI染色2min (1:500)，每孔500 μ 1，在冰上避光进行；
(11)PBS洗3次，分别洗5min、IOmin、15min,在冰上避光进行；
(12)甘油/PBS封片，指甲油固定；
(13)避光4°C保存，待拍片；
(14)最后在激光共聚焦显微镜下观察。
[0035]b.SMC对原代神经细胞生长状况的影响以DAPI (4’，6-二脒基-2-苯基吲哚)染细胞核，以抗MAP-2抗体染神经细胞骨架，结果如图3所示，该图为红色通道的显微镜下观察的黑白示意图，其只显示MAP-2，而在显微镜下观察的细胞为红色，从图3可以看出，原代神经细胞经SMC处理后，细胞丝更多更长，表明SMC促进了神经细胞的生长和神经丝的发育。
[0036]c.SMC提高原代神经细胞突触蛋白的表达水平
突触功能障碍及缺失是AD的重要神经病理改变之一，是与认知能力下降关系最为密切的病理变化。突触前膜囊泡蛋白突触素(synapsin)和突触后膜蛋白PSD-95是突触的代表性蛋白。突触蛋白在调节神经递质的释放及参与神经元早期发育等方面起着重要的作用。在AD中，突触蛋白表达水平降低，突触传递和突触可塑性受损。免疫荧光实验表明，以SMC处理后，细胞的突触后膜蛋白PSD-95 (如图4，其为绿色通道的显微镜下观察的黑白示意图，只显示PSD-95，而在显微镜下观察的细胞为绿色)和突触素(如图5所示，该图为绿色通道的显微镜观察的黑白示意图，只显示突触素，而在显微镜下观察的细胞为绿色)表达水平均明显升高，表明SMC可抑制突触损伤，提高神经突触地可塑性。
[0037]d.SMC抑制原代神经细胞tau蛋白磷酸化(PS404)水平
微管结合蛋白tau的结构功能异常是诱发阿尔茨海默症的一个重要因素。微管系统是神经细胞骨架的主要成分，在维持细胞功能上起了重要作用，微管由α、β微管蛋白和微管相关蛋白组成。tau蛋白是一种微管相关蛋白，可与微管相结合并保持微管的稳定性。AD病例状态下，tau过度磷酸化，并与其它的tau蛋白纤维配对结合。这种过度结合最终会在神经细胞胞体内形成神经纤维缠结，进而导致神经细胞微管骨架系统瓦解。这不但会影响神经细胞间正常的信号传导，最终必然还会引起神经细胞的死亡。关于AD病理状态下，微管结合蛋白tau的细胞毒性的机理，目前主要有两种观点。一种认为是由于过度磷酸化的tau与微管骨架分离从而 失去其生理功能；另一种认为过度磷酸化tau组成的神经纤维缠结会破坏正常tau蛋白的生理功能，并直接成为胞浆运输的障碍。因此抑制tau蛋白的过度磷酸化，是抑制AD发展的一个重要策略。
[0038]从图6 (该图为绿色通道的显微镜下观察的黑白示意图，只显示PS404，而在显微镜下观察的细胞为绿色)中可以看出，SMC处理后，原代神经细胞tau蛋白在其Ser404位点的磷酸化水平显著降低，表明SMC可抑制tau蛋白在该位点的过度磷酸化，抑制神经纤维缠结的形成，维护神经细胞微管骨架的稳定性，保护神经细胞。
[0039]实施例4:以免疫印迹(western blot)检测SMC对原代神经细胞各AD相关蛋白表达水平的影响
蛋白质印迹法即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。一般由凝胶电泳、样品的印迹和免疫学检测三个部分组成。第一步是做SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，使待测样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成带。第二步把凝胶中已分成条带的蛋白质转移到一种固相支持物上，用得最多的材料是硝酸纤维素膜(NC膜)和PVDF膜，蛋白转移的方法多用电泳转移，它又有半干法和湿法之分，现在大多用湿法。第二步是用特异性的抗体检测出已经印迹在膜上的所要研究的相应抗原。免疫检测的方法可以是直接的和间接的。现在多用间接免疫酶标的方法，在用特异性的第一抗体杂交结合后，再用酶标的第二抗体(碱性磷酸酶(AP)或辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗第一抗的抗体)杂交结合，再加酶的底物显示或者通过膜上的颜色或X光底片上暴光的条带来显示抗原的存在。该技术被广泛应用于蛋白表达水平的检测中。具体步骤如下:
1、组织蛋白样品的制备:
I)以浓度为3 μ M的SMC处理24小时后的细胞为实验组，以无SMC处理的细胞为对照
组；
2)提蛋白，按一定比例加入RIPA裂解液，并加入蛋白酶及磷酸酶抑制剂；
3)超声破碎细胞，按照超声IS停1S，超声2min；
4)4°C、12000rpm离心lh，取上清蛋白，分装其余样品冻存置_80°C冰箱；
5)在蛋白中加入适量蛋白4Xloading buffer,沸水煮5min使蛋白变性。样品制好后，保存于_20°C备用。
[0040]2、蛋白定量:
1)标准曲线的制作:取一块酶标板，按下表加入试剂 表2-5:蛋白的浓度梯度
【权利要求】
1.SMC的应用，其特征在于，将SMC用于制备防治阿尔茨海默病的药物或保健品。
2.一种用于防治阿尔茨海默病的药物，其特征在于，所述用于防治阿尔茨海默病的药物的组成成分包括SMC。
3.根据权利要求2所述的用于防治阿尔茨海默病的药物，其特征在于，所述用于防治阿尔茨海默病 的药物将SMC和药学上可接受的载体制成片剂、注射剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、微丸、散剂、滴丸剂、汤剂、糖浆剂、合剂、煎膏剂或浸膏剂剂型的药物。
4.一种用于防治阿尔茨海默病的保健品，其特征在于，所述用于防治阿尔茨海默病的保健品的组成成分包括SMC。
【文档编号】A61P25/28GK103976991SQ201410207086
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月13日 优先权日:2014年5月13日
【发明者】都秀波, 郑友标, 刘琼 申请人:深圳大学