用于预防和/或治疗丙型肝炎的氮杂环丁酮化合物及其组合物的制作方法与工艺

本发明涉及医药领域，具体涉及一种可用于预防和/或治疗丙型肝炎的氮杂环丁酮化合物及其药物组合物、以及使用它们来预防和/或治疗丙肝病毒感染的方法。

背景技术：
HCV指的是丙型肝炎病毒，属于黄病毒科，是一种单股正链RNA病毒，是导致肝脏疾病的主要原因之一。尽管急性感染的病人表现为无症状，但是大约80％病人因无法清除病毒，从而转变为慢性肝炎并伴随其它肝脏疾病，包括肝脂肪变形，胰岛素抵抗，肝纤维化，肝硬化和肝细胞性肝癌(Alter&Seeff(2000)semin.LiverDis.20：17-35)。目前，HCV的全球感染人数达到1.7亿，中国地区HCV感染率大约为3.2％。慢性感染者中约50％～75％有活跃的病毒复制和肝脏炎症，部分慢性肝炎可进展为肝硬化、肝衰竭或原发性肝癌，成为主要的疾病死亡因素之一。尽管HCV感染已成为严重的公共卫生问题，但是目前依然没有有效的疫苗预防HCV的感染。HCV感染宿主细胞首先是病毒颗粒与细胞表面的一系列受体结合，然后由受体介导的内吞作用来完成的。这些受体包括四分子交联细胞膜蛋白CD81(Pileri，etal.(1998)Science282：938-41)，B族I型清道夫受体(SR-BI)(Scavenger，et，al.(2002)EMBOJ.21：5017-25)，紧密连接蛋白claudin-1(Evants，et，al.(2007)Nature446：801-5)和紧密连接蛋白claudin-6(Liu，et，al.(2009)J.Virol.83：2011-4；Ploss，etal.(2009)Nature457：882-6)。病毒颗粒与这些受体结合后，通过在HCV病毒包膜和核膜之间的网格蛋白介导内吞作用(Blanchard，etal.(2006)J.Virol.80：6964-72；meertens，etal.(2006)J.Virol.80；11571-8)和∏类蛋白融合来侵染宿主细胞。此外，低密度脂蛋白受体(Agnello，etal.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA96：12766-12771；Monazahian，etal.(1999)J.Med.Virol.57：223-229；Wunschmann，etal.(2000)J.Virol.74：100055-10062)，去唾液酸糖蛋白受体(Saunier，etal.(2003)J.Virol77：546-559)，原钙粘蛋白β5(Womg-staal，etal.(2008)15thinternationalsymposiumonHepatitisCVirus&RelatedViruses.SanAntonio，TX)，和糖胺聚糖(heparansulfate)(Barth，etal.(2003)J.Biol.Chem.278：41003-41012；Barth，etal.(2006)J.Virol.80：10579-10590；Bartosch，etal.(2003)J.Exp.Med.197：633-642)参与病毒的侵染，但是目前还没有足够的证据证明这些蛋白是HCV侵染宿主细胞所必需的。研究已证明HCV病毒颗粒并不是只在胆固醇上富集(Aizaki，etal.(2008)J.Virol.82：5715-24)，但胆固醇的缺失会降低病毒对细胞的侵染(Aizaki，etal.(2008)supra；Kapadia，etal.(2007)J.Virol.81：374-83)。在临床上还没有批准的HCV病毒侵入抑制剂，但是已有制剂能够抑制HCV病毒在体内的复制。例如，目前采用干扰素和利巴韦林联合治疗HCV，但是该联合治疗有一定的毒副作用、边际效应而使其适用范围受限(Firpi&Nelson(2007)Arch.Med.Res.38：678-690；Foster&Mathurin(2008)Antivir.Ther.13：3-8)。此外，在US2008/0161324中描述了一系列抑制病毒复制的HCV病毒抑制剂。但是，这些化合物不能阻止HCV病毒的侵染和传播。因此，从病毒生命周期的其它方面(如抑制病毒的侵入)寻找新型且有潜力的抗病毒药物势在必行。

技术实现要素：
专利文献WO2011017907A1公开了具有下式(I)结构的氮杂环丁酮化合物及其制备方法与用途，数据显示该式(I)化合物是一种降血浆胆固醇剂，用于降低血浆胆固醇含量，可治疗与血浆胆固醇含量高相关的疾病。经本发明的发明人长期研究，令人惊讶地发现，该文献中公开的式(I)化合物可以有效防治丙肝病毒感染。因此，根据本发明的第一方面，本发明提供了一种用于预防和/或治疗肝炎病毒感染，尤其是丙型肝炎病毒的式(I)化合物或其药学上可接受的盐：其中R1独立地选自1-3个以下基团：氢、卤素、三氟甲基、氰基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C3-C6环烷基、羟基、C1-C6烷氧基、苄氧基和-OCOR7；R2独立地选自1-3个以下基团：氢、卤素、三氟甲基、氰基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C3-C6环烷基、羟基、C1-C6烷氧基、C6-C10芳氧基、C6-C10芳基甲氧基和-OCOR7；R3独立地选自1-3个以下基团：氢、卤素、三氟甲基、氰基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C3-C6环烷基、C1-C6烷氧基和苄氧基；R4为氢、C1-C6烷基、C2-C6烯基和C3-C6环烷基；R5为氢、C1-C6烷基、C2-C6烯基和C3-C6环烷基；R6为氢或者-COR7；R7为C1-C10烷基、苯基或者取代苯基，所述取代基选自：卤素、三氟甲基、氰基、羟基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C3-C6环烷基和C1-C6烷氧基、苯氧基和苄氧基；m为0、1、2或者3；n为1、2或者3；其中，碳碳双键为Z构型或者E构型。在本发明的一个实施方案中，式(I)化合物中R2独立地选自1-3个以下基团：氢、卤素、三氟甲基、氰基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C3-C6环烷基、羟基、C1-C6烷氧基、苄氧基和-OCOR7；R7为C1-C10烷基、苯基或者取代苯基，所述取代基选自：卤素、三氟甲基、氰基、羟基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C3-C6环烷基和C1-C6烷氧基。在优选的实施方案中，式(I)化合物中R1独立地优选自1-3个卤素原子，更优选自1-3个氟或氯原子，最优选氟原子。在优选的实施方案中，式(I)化合物中R2独立地优选自1-3个羟基、C1-C6烷氧基或-OCOR7其中R7具有如上所述的定义；更优选独立地选自1-3个羟基，甲氧基、苯氧基或-OCOR7。在优选的实施方案中，式(I)化合物中R3独立地选自1-3个卤素原子，更优选自1-3个氟或氯原子，最优选氟。在优选的实施方案中，式(I)化合物中R4优选为氢或C1-C6烷基，更优选为氢或甲基。在优选的实施方案中，式(I)化合物中R5优选为氢或C1-C6烷基，更优选为氢或甲基。在优选的实施方案中，式(I)化合物中R6优选为氢。在优选的实施方案中，式(I)化合物中R6优选为-COR7；其中R7具有如上所述的定义，更优选为C1-C10烷基，最优选甲基。在优选的实施方案中，式(I)化合物中，m优选为0或1。在优选的实施方案中，式(I)化合物中，n优选为1。在优选的实施方案中，式(I)化合物优选自：(3R，4S)-4-(4-羟基苯基)-3-[3-对氟苯基-4-羟基丁基-2(Z)-烯]-1-(4-氟苯基)-2-氮杂环丁酮(I-1Z)；(3R，4S)-4-(4-羟基苯基)-3-[3-对氟苯基-4-羟基丁基-2(E)-烯]-1-(4-氟苯基)-2-氮杂环丁酮(I-1E)；(3R，4S)-4-(4-甲氧基苯基)-3-(3-对氟苯基-4-羟基丁基-2(Z)-烯)-1-(4-氟苯基)-2-氮杂环丁酮(I-2Z)；(3R，4S)-4-(4-甲氧基苯基)-3-(3-对氟苯基-4-羟基丁基-2(E)-烯)-1-(4-氟苯基)-2-氮杂环丁酮(I-2E)；(3R，4S)-4-(4-苯氧基苯基)-3-(3-对氟苯基-4-羟基丁基-2(Z)-烯)-1-(4-氟苯基)-2-氮杂环丁酮(I-3Z)；(3R，4S)-4-(4-苯氧基苯基)-3-(3-对氟苯基-4-羟基丁基-2(E)-烯)-1-(4-氟苯基)-2-氮杂环丁酮(I-3E)；(3R，4S)-4-(4-苄氧基苯基)-3-(3-对氟苯基-4-羟基丁基-2(Z)-烯)-1-(4-氟苯基)-2-氮杂环丁酮(I-4Z)；(3R，4S)-4-(4-苄氧基苯基)-3-(3-对氟苯基-4-羟基丁基-2(E)-烯)-1-(4-氟苯基)-2-氮杂环丁酮(I-4E)；(3R，4S)-4-(4-苯甲酰氧基苯基)-3-(3-对氟苯基-4-羟基丁基-2(Z)-烯)-1-(4-氟苯基)-2-氮杂环丁酮(I-5Z)；(3R，4S)-4-(4-乙酰氧基苯基)-3-(3-对氟苯基-4-羟基丁基-2(Z)-烯)-1-(4-氟苯基)-2-氮杂环丁酮(I-6Z)；(3R，4S)-4-(4-苯甲酰氧基苯基)-3-(3-对氟苯基-4-羟基戊基-2(Z)-烯)-1-(4-氟苯基)-2-氮杂环丁酮(I-7Z)；(3R，4S)-4-(4-羟基苯基)-3-(3-对氟苯基-4-羟基戊基-2(Z)-烯)-1-(4-氟苯基)-2-氮杂环丁酮(I-8Z)；(3R，4S)-4-(4-羟基苯基)-3-(3-对氟苯基-4-羟基戊基-2(E)-烯)-1-(4-氟苯基)-2-氮杂环丁酮(I-8E)；(3R，4S)-4-(4-苯甲酰氧基苯基)-3-(3-对氟苯基-4-甲基-4-羟基戊基-2(Z)-烯)-1-(4-氟苯基)-2-氮杂环丁酮(I-9Z)；(3R，4S)-4-(4-羟基苯基)-3-(3-对氟苯基-4-甲基-4-羟基戊基-2(Z)-烯)-1-(4-氟苯基)-2-氮杂环丁酮(I-10Z)；(3R，4S)-4-(4-乙酰氧基苯基)-3-(3-对氟苯基-4-乙酰氧基丁基-2(Z)-烯)-1-(4-氟苯基)-2-氮杂环丁酮(I-11Z)；(3R，4S)-4-(4-羟基苯基)-3-(3-对氟苯基-4-乙酰氧基丁基-2(Z)-烯)-1-(4-氟苯基)-2-氮杂环丁酮(I-12Z)；(3R，4S)-4-(4-羟基苯基)-3-(3-对氟苯基-4-苯甲酰氧基丁基-2(Z)-烯)-1-(4-氟苯基)-2-氮杂环丁酮(I-13Z)；(3R，4S)-4-(4-羟基苯基)-3-(3-对氟苯基-4-对氟苯甲酰氧基丁基-2(Z)-烯)-1-(4-氟苯基)-2-氮杂环丁酮(I-14Z)；(3R，4S)-4-(4-羟基苯基)-3-(3-对氟苯基-4-对甲苯甲酰氧基丁基-2(Z)-烯)-1-(4-氟苯基)-2-氮杂环丁酮(I-15Z)；(3R，4S)-4-(4-苯甲酰氧基苯基)-3-(3-对氟苯基-4-乙酰氧基丁基-2(Z)-烯)-1-(4-氟苯基)-2-氮杂环丁酮(I-16Z)；(3R，4S)-4-(4-甲氧基苯基)-3-(3-对氟苯基-4-乙酰氧基丁基-2(Z)-烯)-1-(4-氟苯基)-2-氮杂环丁酮(I-17Z)；(3R，4S)-4-(4-甲氧基苯基)-3-(3-对氟苯基-4-乙酰氧基丁基-2(E)-烯)-1-(4-氟苯基)-2-氮杂环丁酮(I-17E)。最优选以下化合物：或本发明所使用的部分术语定义如下：“卤素”是指氟、氯、溴和碘。“烷基”当作一基团或一基团的一部分时是指直链或者带有支链的脂肪烃基团。最优先选择为C1-C6的烷基，除非另有指明。直链或带有支链的C1-C6烷基的实例包括，但不限于：甲基、乙基、正丙基、2-丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、己基等。“烯基”作为一基团或一基团的一部分时是指至少含有一个碳碳双键的脂肪烃基团，可为直链也可以带有支链。最为优先选择的是C2-C6的烯基。该基团可在其主链中含有多个双键且其几何构型可各自为E或Z。烯基基团的例子包括，但不限于：乙烯基、丙烯基、烯丙基、丙烯基等。“环烷基”是指饱和或部分饱和的单环、稠环或螺环之碳环。以3-6个碳原子组成的环为优先选择。实例包括，但不限于：环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。“烷氧基”是指(烷基-O-)的基团。其中，烷基见本文有关定义。C1-C6的烷氧基为优先选择。其实例包括，但不限于：甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基等。本发明包括式(I)所表示的化合物及其可能的各种异构型式。包括：非镜像异构体、镜像异构体和“Z”或“E”构型的几何异构体等。此外，术语“药学上可接受的盐”是指上述化合物能保持原有生物活性并且适合于医药用途的某些盐类。式(I)所表示的化合物的药学上可接受的盐是与金属形成的盐。与式(I)所表示的化合物形成药学上可接受的盐的金属包括：锂、钠、钾、镁、钙、铝、锌等。根据本发明的第二方面，本发明提供了一种含有上述式(I)化合物的药物组合物，其包括预防和/或治疗有效剂量的式(I)化合物或其药学上可接受的盐，以及任选的，药学上可接受的载体。根据本发明的另一方面，在上述药物组合物中，还包含一种或多种其它能够抑制肝炎病毒感染的活性成分，比如I型干扰素、利巴韦林、病毒唑、核甘酸类似物R1479、核甘酸抑制剂R1626、二苯基杂环化合物等，其中所述的I型干扰素是IFN-α或IFN-β。根据本发明的另一方面，本发明提供了上述式(I)化合物或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗肝炎病毒，尤其是丙型肝炎病毒感染的药物中的用途。根据本发明的另一方面，本发明提供了上述式(I)化合物或其药学上可接受的盐在制备减少或防止肝炎病毒，尤其是丙型肝炎病毒进入细胞的药物中的用途。根据本发明的另一方面，本发明提供了一种预防和/或治疗肝炎病毒，尤其是丙型肝炎病毒感染的方法，该方法包括给需要治疗的受试者施用有效剂量的如上所述的式(I)化合物或其药学上可接受的盐，或含有它们的药物组合物。根据本发明的另一方面，本发明提供了一种减少或防止肝炎病毒，尤其是丙型肝炎病毒进入细胞的方法，该方法包括使细胞与有效剂量的上述式(I)化合物或其药学上可接受的盐，或含有它们的药物组合物接触。本发明描述了一种阻止肝病毒感染的方法。该方法通过给予受试者有效剂量的式(I)化合物或者其药学上可接受的盐来阻止或降低肝病毒对细胞的侵入。在本专利的一个具体实施方案中，所述受试者是肝移植者。本发明作为治疗肝病毒感染协同药物组合物同样也适用。此组合物含有式(I)化合物或其药学上可接受的盐，以及至少一种其它能抑制肝病毒感染的药物。其中所述的其它抑制肝病毒感染药物选自I型干扰素、利巴韦林、病毒唑、核甘酸类似物R1479、核甘酸抑制剂R1626、二苯基杂环化合物等。在一个具体实施方案中，其它抑制肝炎病毒感染药是I型干扰素，而该I型干扰素是IFN-α或IFN-β。本发明也适用与一定有效剂量的其它药物或药物组合物联合用药，协同作用于被肝病毒感染的细胞，有效地清除细胞内的肝病毒。本发明描述的方法也适用于治疗肝病毒感染者。本发明也适用与一定有效剂量的其它药物或药物组合物联合用药，协同作用于肝病毒感染者，使得肝病毒感染者得到治疗。因此，本发明的具体实施是提供一种预防肝炎病毒感染的方法，它主要是通过给予需要预防的“受试者”一定有效剂量的本发明的式(I)化合物或其药学上可接受的盐，或含有它们的药物组合物从而降低或防止肝病毒感染细胞。此处的“受试者”可以指任何动物(例如，包括像人类这样的哺乳动物)。此处的“肝炎病毒感染”主要是指肝炎病毒的吸附和内化，已经通过病毒复制和病毒持续感染得到证实。本发明中的“预防”是指防止或延缓HCV相关临床症状的预防性治疗。在具体实施例中(图3)，本发明的化合物(I-1Z)与干扰素显示出协同作用，本发明的协同组合物指的是式(I)化合物或者其药学上可接受的盐联合至少一种抑制肝病毒感染的抑制剂(例如：抑制病毒基因的表达、复制或抑制病毒颗粒的组装和释放)的组合物。本发明与其它药物组合物联合使用时总的治疗效果大于它们单独使用时的治疗效果的总和。因此，根据本发明的一个具体实施方案，联合至少一种其它的抑制肝病毒感染的抑制剂指的是病毒复制抑制剂。抑制肝病毒复制的药物，可以是已公布的、针对病毒复制各个环节的抑制剂。如，通过降低病毒各个复制环节效率的抑制剂，或通过抑制病毒复制过程中所需因子来抑制HCV病毒复制的抑制剂，这些过程包括但不限于病毒基因组复制，病毒RNA转录，和蛋白水解过程。在本发明联合使周抑制肝病毒感染的抑制剂的药物组合物中，或者在预防和/或治疗的方法中，所使用的肝病毒感染的抑制剂包括但不限于亚氨基噻唑酮类(US，专利号7183302)、I型干扰素(Zeuzem，etal，(1996)，Hepatology，23(2)：366-71)，病毒唑(Gish(2006)，JAntimicrobChemother，5(1)：8-13)，核甘酸类似物R1479(klumpp，etal，(2006)JBiolChem，281(7)：3793-3797)，Telaprevir(Weisberg&Jacobson(2009ClinLiverDis，13(3)：441-52；Serrazin，etal.(2007)Gastroenterology132(5)：1767-77)，Boceprevir(Mederacke，etal.(2009)CurrOpin.Investig.Drugs10(2)：181-9)，核甘酸抑制剂R1626(Toniutoo，etal.(2008)IDrugs11(10)：738-49)，ITMN-191(R7227；Seiwert，etal.(2008)Antimicrob.AgentsChemother.52(12)：4432-41)，可替代性的二苯基杂环化合物(Huang，etal.(2008)Antimicrob.AngentsChemother.52(4)：1419-29)，beta-D-2-Deoxy-2-fluoro-2-C-methylcytidiine(PSI-6130；Asif，etal.(2007)Antimicrob.AngentsChemother.51(8)：2877-82)，statins(Ikeda，etal.(2006)Hepatology44(1)：117-25)，bisindolylmaleimidesandindolocarbazoles(Murakami，etal.(2009)AntiviralRes.83：112-117)。在本发明的具体实施方案中，协同组合物，包括至少一种I型干扰素(如，IFN-α或IFN-β)、利巴韦林或I型干扰素与利巴韦林的组合物。本发明具体例中协同组合物包括：1)式(I)化合物或者其药学上可接受的盐；2)I型干扰素或利巴韦林；3)丙肝病毒感染抑制剂。本发明所描述的I型干扰素为一类蛋白干扰素家族，该家族蛋白可抑制病毒复制、细胞增殖及调节免疫应答。其中有效的α干扰素，包括但不限于RoferonA干扰素(Hoffman-LaRoche，NutleyNJ)，干扰素α-2(BoehringerIngelheimPharmaceutical，Inc.，Ridgefield，CT)，rDNA-α干扰素(Sumitomo，Japan)。目前，α干扰素2b通过世界多数国家批准，广泛用于治疗HCV。美国专利文献US4530901已对α干扰素2b进行了介绍。本发明在使用中，将所需的式(I)化合物或其药学上可接受的盐，或含有它们的药物组合物，优选协同组合物制成制剂给予受试者。在制剂的配制中，可根据需要任选使用药学上可接受的载体。这些载体是我们广泛熟知的，如生理盐水、纤维素、乳糖、焦糖、甘露醇、山梨醇和磷酸钙。选择性添加物包括润滑剂、粘合剂，如硅酸、二氧化硅、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酸钙、PEG；崩解剂，如淀粉、羧甲基淀粉、交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸及其盐；色素；调味剂及融合剂。色素或天然色素添加到药片或糖衣上，如用于区分活性成分或活性成分不同剂量。在一个优选的实施方案中，式(I)化合物或其药学上可接受的盐和其它至少一种抑制丙肝病毒感染的药物可以按适当比例用一种或多种载体制成制剂。一般来说，药物有效成分占治疗给药总质量的1-95％。药物的剂型要适合不同给药方式，如口服、注射(静脉注射、肌肉注射)、直肠给药、人体附属物给药、透皮给药、滴鼻、阴道给药、吸入给药、皮肤局部给药(贴剂)、滴眼。因此，药物的剂型包括片剂、胶囊剂、丸剂、粉针剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、凝胶剂、糊剂、软膏剂、乳青剂、透皮贴剂、栓剂、注射剂、输液、吸入剂及气雾剂。制剂的制备可采用传统工艺(如，Remington：TheScienceandPracticeofPharmacy，20thedition，2000，ed.A.R.Gennaro，LippincotWilliams&Wilkins，Philadelphia，andEncyclopediaofPharmaceuticalTechnology，eds.J.SwarbrickandJ.C.Boylan，1988-1999，MarcelDekker，NewYork)。式(I)化合物或者其药学上可接受的盐和其它至少一种抑制丙肝病毒感染的药物可以制成单方，也可制成在一定时间内(分钟、小时或一天)多次连续给药的复方剂型。给药剂量及联合给药方案取决于以下因素，包括治疗方案、肝炎病毒类型、病毒传染性强度、是以肝炎治疗还是预防病毒传染为主以及病患的年龄、体重、身体健康状况。本发明协同组合物可同时靶向作用于病毒的入侵和病毒基因的表达、复制以及病毒颗粒的组装和释放，所以协同组合物可以用效的从细胞内清除肝炎病毒和治疗肝病毒感染。因此，本专利适应症包括清除细胞内的丙肝病毒。采用本发明的一定有效剂量的协同组合物作用于病毒感染的细胞，可以有效地从细胞中清除丙肝病毒。通过合理的治疗方案预期可降低20％、30％、50％、70％、80％、90％、95％、99％的肝细胞内的病毒负载量。在本发明的一个具体实施方案中，采用肝细胞进行试验，丙肝病毒能有效地从其宿主细胞中清除出去，因此，本发明适用于丙肝病毒感染。本发明的另一个具体实施方案通过给予感染丙肝病毒患者有效剂量的协同组合物用来治疗丙肝病毒感染，可显著阻止或降低病毒复制及传播速率、减少病毒负载量(如文中提到的病毒，包括肝病毒A，B，C，D，E)，至少减轻患者肝病感染后的一种症状。通过合理的治疗方案(如前文提及抑制病毒在细胞内复制或抑制感染的方案)预期可减慢病毒的复制和降低至少20％、30％、50％、70％、80％、90％、95％、99％病毒负载量。治疗受益者包括被诊断为感染丙肝病毒的患者(如通过丙肝病毒标记物证实)。文献中报道有多种丙肝病毒检测标记物，且专业人员可对这些标记物进行检测。例如，可通过检测肝脏或血液中的丙肝病毒核酸或蛋白来确诊丙型病毒感染。文中提到的本发明式(I)化合物在预防和/或治疗肝炎病毒感染中的应用，其中“有效剂量”指的是一定剂量的药物能够降低病毒负载量或清除病毒，进而减少、缓解或消除可导致的癌症或肝硬化的慢性感染(症状表现为肝肿大、脾肿大、黄疸、肌无力、肝腹水、脚踝浮肿)。本发明中，有效治疗剂量可通过参考文献报道的相关剂量和方法进行确定。例如，根据文献报道选用适宜的动物模型进行试验确定有效剂量，如通过体内试验检测药物对HCV的抑制作用。文献中已详实报道了大量此类模型试验的优势和具体应用。一旦药物在动物体内的实验被证实有效，临床研究即可依据该动物实验安全给药剂量和量效关系进行剂量设计。此类临床实验可根据Spilker((2000)GuidtoClinicalTrials.LippincottWilliams&Wilkins：Philadelphia)临床实验指导方案进行设计。本发明所述治疗方案的用药剂量可依据式(I)化合临床I期实验数据结果，其它干扰素或丙肝病毒抑制剂可采用其临床用药的药理学、毒理学方案作为参考。用药剂量因病患个人差异而不同，谨遵医嘱。如果需要，本发明化合物可用于机制研究来验证其它药物组合物或单一药物是否具有与本发明化合物或组合物相同的治疗病毒感染的作用(文献报道方法检测)。例如，候选药物可单独给药或联合给药(如式(I)化合物或者其药学上可接受的盐)，然后进行细胞(如Huh7、Huh2、Huh8、Sk-Hep-1、Huh7lunet、HepG2、WRL-68、FCA-1、LX-1、LX-2、Hunh7-derived等干细胞系)水平检测。经适当时间，病毒侵入细胞、复制，然后检验细胞内病毒数量。如果受试化合物或组合物具有抑制病毒侵入(如采用集落形成实验检测)、复制或减少病毒数量的作用，该化合物或组合物就可用作治疗病毒感染疾病的有效药物。本发明可作为研究阐明病毒类疾病生物信号通路的工具药。这类研究可进一步开发治疗、预防或减少病毒感染类疾病联合用药或单一用药的药物。采用文献报道的生物信号通路研究方法，本发明可用于确定病毒感染细胞(如肝细胞)的信号通路或感染信号网络。这些方法包括对本发明给药组与阴性对照组、阳性对照组或与其它单一药物联合、复方药物联合给药组细胞组分进行检测分析，亦可对细胞或病毒活力(如酶活力、营养吸收和增殖)进行检测。细胞组分分析包括基因转录和蛋白表达。通常使用的方法包括标准生化技术，本发明专利的放射标记，以及化合物与蛋白结合检测，如二维凝胶电泳或基因表达谱。一旦确定效果，该化合物可进行体内试验(如基因敲除或转基因小鼠)来进一步验证化合物作为工具药研究的有效性，以及用于开发治疗病毒疾病的新药物、研究新的治疗方案的有效性。具体试验方法包括但不限于实施例所述方法：附图说明图1化合物(I-1Z)预防HCV侵入Huh7细胞：根据实施例2感染HCV的Huh7细胞经不同浓度的化合物(I-1Z)预处理6小时后，感染病毒8h和24h后细胞内病毒含量。显示化合物(I-1Z)在10uM～40uM/L浓度下能有效抑制HCV在细胞内的内化。单层人肝癌细胞株HuH7分别加入不同浓度的化合物(I-1Z)预处理，经浓度为0.1FFU/CELL的源于JFH-1的HCV病毒感染，细胞感染病毒。病毒在感染8h和24h后，洗涤细胞并分离RNA，测定病毒的含量。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的方法来测定HCVRNA的含量，含量周HCVRNA拷贝数/ug细胞总RNA来表示，GAPDH作为内参。三次试验的实验结果用means±s.e.m.表示，阴性对照(HCVRNA含量在未感染的细胞中的检测)大约为0.5-1.0×102拷贝数/ug细胞总RNA。相对于对照组，化合物(I-1Z)能够显著性降低HCVRNA在细胞总RNA中的含量(P＜0.05，单因素方差对结果分析，并t检验)。图2化合物(I-1Z)、化合物(I-12Z)、化合物(I-6Z)预防HCV侵入Huh7细胞：根据实施例2感染HCV的Huh7细胞经20uM的化合物(I-1Z)、化合物(I-12Z)、化合物(I-6Z)预处理6小时后感染病毒24h细胞内病毒含量。显示化合物(I-1Z)、化合物(I-12Z)、化合物(I-6Z)能够有效抑制HCV在细胞内的内化。单层人肝癌细胞株Huh7分别加入20uM/L化合物(I-1Z)、化合物(I-12Z)、化合物(I-6Z)预处理6小时后，经浓度为0.1FFU/CELL的源于JFH-1的HCV病毒感染(JFH-1，从日本一名丙型肝炎患者体内分离出一株HCV全长基因序列)，培养24h，洗涤细胞并分离RNA，测定病毒的含量。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的方法来测定HCVRNA的含量，含量用HCVRNA拷贝数/ug细胞总RNA来表示，GAPDH作为内参。三次独立实验的实验结果用means±s.e.m.表示，阴性对照(HCVRNA含量在未感染的细胞中的检测)大约为0.5-1.0×102拷贝数/ug细胞总RNA。相对于对照组，浓度为20uM/L的化合物(I-1Z)、化合物(I-12Z)、化合物(I-6Z)能够显著性降低HCVRNA在细胞总RNA中的含量(P＜0.05，单因素方差对结果分析，并t检验)。图3化合物(I-1Z)与干扰素-α协同治疗慢性HCVcc感染：根据实施例2慢性HCVcc感染实验，Huh7细胞感染HCV后经药物作用不同时间细胞内病毒含量。显示化合物(I-1Z)与干扰素-α具有协同作用，能够降低HCV慢性感染的人肝癌细胞株Huh7的RNA含量，连续给药60天后，细胞内HCVRNA含量接近于未感染HCV细胞的HCV11RNA背景值。Huh7与含有HCV感染性病毒颗粒的JFH-1株共培养，病毒浓度为0.1FFU/CELL。感染后继续培养10天，使HCVRNA含量达到一个持续稳定的状态。试验分为四组分别为模型组，化合物(I-1Z)(20μM)组，干扰素-α(100U/ml)组，化合物(I-1Z)(20μM)和干扰素-α(100U/ml)联合用药组。给药期间继续保持细胞传代。在实验过程中，细胞开始给药治疗后，等量收集三份细胞，用实时定量PCR对HCVRNA进行定量检测，GAPDH作为内参，含量用HCVRNA拷贝数/ug细胞总RNA来表示，三个复孔，实验结果用means±s.e.m.表示。图4慢性HCVcc感染实验，IFN-α移除后化合物(I-1Z)持续抑制HCVcc增殖：根据实施例2慢性HCVcc感染实验，IFN-α移除后Huh7细胞内HCVRNA含量变化，显示干扰素-α单独给药组，化合物(I-1Z)和干扰素-α联合用药组给药60天后，维持干扰素-α或移除干扰素-α，继续治疗到80天，干扰素-α单独给药组细胞内HCVRNA含量显著性上升，而化合物(I-1Z)联合给药组无论是维持干扰素-α或移除干扰素-α，细胞内HCVRNA含量未见上升，接近于未感染HCV细胞的HCV背景值。在实验过程中，细胞开始给药治疗后，等量收集三份细胞，用实时定量PCR对HCVRNA进行定量检测，GAPDH作为内参，含量周HCVRNA拷贝数/ug细胞总RNA来表示，三个复孔，实验结果用means±s.e.m.表示。图上的实验结果分别代表两次独立试验。图5化合物(I-1Z)预防HCV对树鼩感染第四周血液HCVRNA含量：根据实施案例4的树鼩预防HCV感染实验，树鼩15只，每组5只，分别为未给药组，I-1Z1m/kg组，I-1Z5m/kg组。在HCV感染前，未给药组口服生理盐水，给药组每天给药1次(给药方式为口服给药)，持续给药2周，两周后对树鼩进行感染，感染后停止给药。感染后第二周至第六周抽血测定HCVRNA，实验结果表明，与未给药的动物相比，在第4周时，I-1Z1m/kg组，5只树鼩体内HCVRNA的含量低于检测限，I-1Z5m/kg组仅有一只树鼩体内HCVRNA的含量检测到浓度极低的HCVRNA。图6化合物(I-1Z)预防HCV感染树鼩第二周至第六周HCV感染阳性检出频次：根据实施案例4的树鼩预防HCV感染实验，树鼩15只，每组5只，分别为未给药组，I-1Z1m/kg组，I-1Z5m/kg组。在HCV感染前，未给药组口服生理盐水，给药组每天给药1次(给药方式为口服给药)，持续给药2周，两周后对树鼩进行感染，感染后停止给药。感染后第二周至第六周抽血测定HCVRNA，第二周至第六周血液HCVRNA阳性检测显示，I-1Z1m/kg组，I-1Z5m/kg组的体内阳性感染检出频次显著性低于未给药组，未给药组阳性感染共检出12次，I-1Z1m/kg组阳性感染检出3次，I-1Z5m/kg组阳性感染检出2次。图7树鼩感染HCV同时化合物(I-1Z)给药抑制HCV对树鼩的感染：根据实施案例4的树鼩同时给药试验：实验树鼩10只，每组5只，在HCV感染时同时给药，未给药组每天口服生理盐水，给药组每天给药1次(给药方式为口服给药)，I-1Z3mg/kg，持续给药2周，给药两周后停止给药。在HCV感染前一天，感染后连续4周每周抽血，在第4周时，与未给药的动物相比，60％树鼩体内HCVRNA的含量低于检测限。具体实施方式式(I)化合物按照WO2011017907A1中所述的制备方法进行制备。实施例1：方法HCVcc病毒培养。Huh7细胞(CCTCC)；丙型肝炎复制子JFH-1，sg2a，sg1b(由浙江大学附属医院馈赠)；JFH-1经XbaI酶切线性化，体外用TRANSCRIPTT7(ROCH，US，)试剂盒转录，采用改良电转化的方法转染细胞(Krieger，etal.(2001)J.VIRO；.75(10)：4614-24)。所有细胞以DMEM完全培养基培养(Gibco，Invitrogen，Carlsbad，CA)，10％胎牛血清(Gibco)，100单位的青霉素和链霉素，2mML-谷氨酰胺(Gibco)。HCVcc病毒保存通过用0.1FFU/细胞的感染复数(MOI)病毒感染无病毒的Huh7细胞，18天后，收集经电转体外转录的JFH-1RNA的Huh7细胞上清所得。试剂：重组人干扰素2α(ROCH，US)和β因子(MERK，GM)用含有10％胎牛血清的DMEM重悬使浓度到达50U/μl。全部转移到试管中，-80℃保存。化合物(I-1Z)用DMSO稀释到20mM，4℃保存。急性HCV病毒感染实验。细胞生长组：Huh7细胞以4×103/孔接种于96孔板(CORNING，US)，培养24小时。细胞不生长组：Huh7细胞接种于96孔BIOCOAT培养板中(BDBiosciences)，细胞密度为8×103/孔。当细胞汇合度达到90％，将培养基换成200μl含有1％(v/v)DMSO(Sigma)的DMEM完全培养基，继续培养20天，每2天换一次培养基(Saniz，Jr.&Chisari(2006).J.Virol.80：10253-7；Choi，etal.(2009)xenobiotica39：205-17)。细胞用感染复数为1或0.1FFU的HCVcc电转感染，感染12小时。实验设计三组，1)细胞在感染之前用浓度分别为40、20、10、5μM的化合物(I-1Z)处理6小时(感染前给药)，设置阴性对照；2)在细胞感染病毒同时立即加入浓度分别为40、20、10、5μM的化合物(I-1Z)，共同培养12小时(同时感染同时给药)；3)细胞在感染HCVcc病毒后立即加入浓度分别为40、20、10、5μM化合物(I-1Z)处理60小时(感染后给药)。指标检测：1)HCVRNA含量分析，总RNA用1×核酸裂解纯化试剂(Invitrogen)在感染之后裂解三个孔，提取RNA进行RT-qPCR分析。2)HCV病毒包膜蛋白E2检测，移除培养基，用4％的多聚甲醛(w/v)(sigma)固定72小时，对HCV病毒E2包膜蛋白免疫组化分析。慢性HCVcc感染实验。细胞生长组：Huh7细胞接种于T75(Corning)细胞培养瓶中，接种量为1×106个，以0.01FFU/细胞感染复数的HCVcc(JFH-1)感染细胞，继续培养12天使HCVRNA达到稳态水平。第12天，细胞按1∶4比例接种于4个T25(Corning)细胞培养瓶中，培养24小时后，4瓶细胞分别用DMEM完全培养基、含IFN-α(100U/ml)的DMEM完全培养基、含化合物(I-1Z)(20μM)的DMEM完全培养基、同时包含IFN-α(100U/ml)和化合物(I-1Z)(20μM)的DMEM完全培养基培养。实验中每两天更换培养基，细胞长满前，用胰蛋白酶消化，1∶3传代，保持细胞活力。每次传代时，收集细胞，1200转/min，离心5分钟，总RNA用核酸提取试剂(Invitrogen)提取，反转录后，进行RT-qPCR检测。细胞不生长组：Huh7细胞，接种于48孔BIOCOAT培养板中(BD)，细胞接种密度为1×104个/孔，在含1％DMSO环境中培养20天，细胞用0.01FFU/细胞感染复数的JFH-1HCVcc进行侵染，14天后使HCVRNA达到稳态水平。在侵染后第14天，同细胞生长组，细胞用DMEM完全培养基、含IFN-α(100U/ml)的DMEM完全培养基、含化合物(I-1Z)(20μM)的DMEM完全培养基、同时包含IFN-α(100U/ml)和化合物(I-1Z)(20μM)的DMEM完全培养基培养。每两天更换培养基。培养至设定时间，从三平行孔中用RNA核酸提取试剂(InVitrogen)提取总RNA，反转录后，进行RT-qPCR检测。RNA提取和RT-qPCR检测。细胞总RNA用核酸提取试剂(InVitrogen)提取总RNA，操作步骤如说明书所示。每微克纯化RNA用K1622反转录试剂盒(Thermo)进行cDNA合成，随后用CFXCONNECT(BIO-rad)定量PCR仪进行SYBRgreen定量RT-qPCR。PCR循环包括95℃10分钟的变性，随后40个扩增循环(95℃，15s)以及退火/延伸(60℃，1min)。HCVJFH-1和GAPDH转录水平的测定是依据JFH-1HCVcDNA或人GAPDH基因的质粒的各自系列稀释后制备的标准曲线算出。用于检测GAPDH和HCV的PCR引物是：人GAPDH，5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’(正向引物)(Seq.ID.No.1)和5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’(反向引物)(Seq.ID.No.2)；JFH-1HCV，5’-TCTGCGGAACCGGTGAGTA-3’(正向引物)(Seq.ID.No.3)和5’-TCAGGCAGTACCACAAGGC-3’(反向引物)(Seq.ID.No.4)。细胞外病毒感染滴度实验。Huh7细胞上清液用DMEM完全培养基10倍梯度稀释，取100μl用来浸染接种于96孔板(BDBiosciences)中的细胞，细胞密度为4×103/孔，每个浓度3个复孔。37℃孵育24h，然后加入150μl含0.4％甲基纤维素(w/v)(FlukaBioChemika，Switzerland)的DMEM完全培养基，甲基纤维素终浓度为0.25％。浸染72h后，吸出培养基，细胞用4％多聚甲醛(Sigma)进行固定，然后对HCVE2包膜蛋白进行免疫组织化学染色。免疫组化步骤：细胞先用含有0.3％(v/v)过氧化氢(Fisher，Fairlawn，NJ)的1×磷酸盐缓冲液PBS(pH7.2)进行孵育，封闭内源性过氧化物酶。随后用1×磷酸盐缓冲液PBS(pH7.2)漂洗三次，细胞用含0.5％(v/v)TRITONX-100(Fisher)、3％(w/v)牛血清蛋白(BSA)(Sigma)和10％(v/v)胎牛血清封闭1小时。随后用1×含0.5％(v/v)TRITONX-100、3％(w/v)BSA及1∶500稀释的人抗HCVE2单克隆抗体C1的PBS室温孵育。结合的C1用1∶1000稀释的HRP偶联的抗人抗体(Pierce，IL)孵育1小时，接着与AEC检测底物(BDBiosciences)孵育30分钟。细胞用蒸馏水清洗，然后在OnlympusIX5显微镜下观察，病毒的感染滴度用FFU每毫升上清液(FFU/ml)表示，即最高稀释水平检测到HCVE2阳性的三个复孔平均数。WesternBlot检测。收集细胞，用含有蛋白酶抑制剂的Cocktail(Roch，IPA)的TRITONX-100裂解液(TRITONX-100，50mMTRis-HCl，PH7.5，150mMNaCl，2mMEDTA)裂解细胞。取50微克蛋白质进行SDS-PAGE电泳中，然后转印到尼龙硝基纤维素膜(BIO-RAD电泳仪，US)上。接着用5％脱脂奶粉封闭2小时，然后用1∶1000稀释的小鼠抗HCVNS3单克隆抗体(9-G2Clone，ViroGen，Watertown，MA)孵育，用含0.05％吐温20的PBS清洗3次，用辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠抗体(Pierce，Rockford，Illinois)孵育，然后再次清洗。用SUPERSIGNAL化学发光底物(Pierce)检测蛋白抗体复合物。细胞增殖和细胞毒性生物荧光检测。细胞增殖ATP检测试剂盒(Peomega，US)，它是检测细胞内ATP含量作为细胞活力和增殖的检测方法。按照说明书方法使用celltiter-glo@luminesentcellviabilityassay试剂盒进行检测。实验步骤：加入100ul的ATP检测试剂到100ul培养的阴性对照组和药物处理组细胞振荡15分钟，进行荧光检测。为评价药物引起的细胞毒性，使用了一种检测受损细胞释放的人丙氨酸转移酶(ALT)的ELISA试剂盒(上海索宝来生物科技有限公司)，按照试剂盒使用说明书的操作方法进行检测，结果表明，在1-40μM浓度范围内化合物(I-1Z)处理Huh7细胞12h无细胞毒作用。数据统计。用平均值±平均值的标准误差(sem)表示数据。通过图氏检验(GRAPHPAD，SanDiego，CA)的单方向分析(ANOVA)差异确定显著性差异。实施例2：化合物(I-1Z)、化合物(I-12Z)、化合物(I-6Z)阻止HCV病毒侵入细胞式(I)化合物为氮杂环丁酮类药物，是一种抗高血脂，降低胆固醇的药物，实验结果表明它可在体内抑制胆固醇的吸收，在金黄地鼠，猴子上具有降低血浆低密度脂蛋白(LDL)和总胆固醇(WO2011017907A1)的作用，在人上同样具有降低血浆低密度脂蛋白(LDL)和总胆固醇的作用。感染的HCV病毒颗粒富集在细胞内的胆固醇中(Aizaki，etal.(2008)J.Virol.82：5715-24)，推测式(I)化合物具有抑制HCV病毒侵入细胞的作用。同样，化合物(I-1Z)抑制HCV进入细胞的活性可通过检测细胞内HCV病灶的数量来进行评价。Huh7细胞接种感染复数(MOI)为1.0或0.1FFU/cell的源自细胞培养的HCV(HCVcc)，设感染前给药，感染同时给药，感染后给药三个组，用递增浓度为(0，5，10，20和40μM)化合物(I-1Z)进行处理。感染前6h给药处理然后去除化合物再感染病毒6h或不去除化合物感染病毒6h，相对于未处理细胞(0μMI-1)，化合物(I-1Z)显著性降低HCV病灶数，并存在剂量效应。特别是与未处理的培养相比，分别用10，20，40μM化合物(I-1Z)预先处理细胞时，感染病毒24小时后检测细胞内病毒含量，分别抑制30％，89.9％和97％的HCV病灶形成(图1)，而当用HCVcc分别和10，20，40μM化合物(I-1Z)共同孵育细胞时，观察到分别为92％，95％，99％的抑制率。然而，当感染后(感染后给药)在细胞中加入化合物(I-1Z)时，抑制程度显著性降低。感染前6h分别用20μM化合物(I-1Z)、化合物(I-12Z)、化合物(I-6Z)预先处理细胞，感染病毒24小时后检测细胞内病毒含量，化合物分别抑制88.3％、73.2％和23.5％的HCV病灶形成(图2)。与前给药再感染组一样，定量检测感染后给药组24、48和72h时的HCVRNA水平，HCV感染抑制作用呈现剂量效应和感染时间效应。细胞病毒感染前6h用20μM化合物(I-1Z)处理后，至少在48h内化合物(I-1Z)能够保护细胞免受病毒的感染。感染同时给药组也有效的抑制HCV感染，与阻止病毒侵入细胞实验结果一致。感染后加入化合物(I-1Z)不能有效保护细胞免受病毒的感染，仅在感染后72小时检测到HCVRNA水平轻微降低。为确保观察到的抑制作用不是因为化合物(I-1Z)诱导的细胞增殖或细胞毒性所导致，化合物(I-1Z)梯度浓度处理细胞后，测定细胞内的ATP，计算Huh7细胞活力、增殖，检测培养液ALT水平，评价化合物对细胞的毒性。这些结果证明使用任何剂量的化合物(I-1Z)处理细胞不能抑制细胞增殖或引起细胞内毒性。此外，用不生长组的Huh7细胞培养进行了相似的实验，得到了类似的结果，这种不生长组的Huh7细胞更好的模拟了体内肝细胞的未分裂状态。此外，为测定观察的HCV抑制作用的特异性，评价了化合物(I-1Z)抑制另一种黄病毒登革热病毒(DNV，中国科学院武汉病毒研究所)进入细胞的作用。与HCV不同，用10，20，40μM化合物(I-1Z)处理细胞，未观察到明显的DNV斑形成的减少。因此，以上结果表明，化合物(I-1Z)是HCVcc感染早期阶段的一种有效的和特异性的抑制剂。化合物(I-1Z)未抑制HCVRNA复制实验。已知的其它抗高血脂降胆固醇药物是作用于胆固醇生物合成途径而不是抑制游离的胆固醇摄取，化合物(I-1Z)抑制HCV复制实验直接通过用剂量递增的化合物(I-1Z)处理转染了HCV基因2a或者1b亚属(sg)的复制子的Huh7细胞，平行实验阳性对照：洛伐他汀，胆固醇生物合成抑制剂，能够降低HCVsg1bRNA复制(Kapadia&Chisari(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA102：2561-6；Ye，etal.(2003)Proc.Natq.Acad.SCi.USA100：15865-70；Tobert(2003)Nat.Rev.DrugDiscov.2：517-26)和抑制HCVcc颗粒分泌(Kapadia&Chisari(2005)supra)。与前文所述，进行RT-qPCR检测，感染病毒的细胞经72小时后药物处理后，洛伐他汀降低sg1bRNA水平22倍，但对sg2aRNA水平无效。相比之下，用化合物(I-1Z)递增剂量处理，未观察到细胞sg1b或sg2aHCVRNA定显著性降低。药物处理24h和48h得到了相似的结果。另外，当对HCVcc灶形成抑制剂评价时，感染前给药，感染同时给药，感染后给药组加入洛伐他汀没有影响。因此，这些结果同时表明胆固醇生物合成抑制剂，如洛伐他汀，抑制HCVRNA复制和颗粒外出，不像化合物(I-1Z)那样，它们不影响HCV侵入。为证明化合物(I-1Z)是否抑制HCV与细胞结合或随后的内化，检测了HCVcc感染的细胞未处理组和化合物(I-1Z)处理组的细胞内HCVRNA和相关蛋白质。与化合物(I-1Z)不能抑制病毒颗粒结合的细胞一样，在细胞感染病毒后，8h未经或经式(I)化合物处理后，各组细胞所检测的HCVRNA水平相近。不同的是，就阻止HCV侵入细胞作用上，在化合物(I-1Z)处理组后面时间点未观察到HCVRNA扩增和NS5A蛋白质的表达，试验结果表明虽然HCV能有效的与化合物(I-1Z)处理的Huh7细胞结合，但结合后进一步感染启动步骤被阻断了。自从1980年度以来，IFN-α已经作为慢性HCV治疗的基础药物，我们考察了干扰素和化合物(I-1Z)对慢性感染HCVcc病毒的Huh7细胞的联合作用。具体步骤：感染了HCVcc病毒的Huh7细胞培养12天，使HCVRNA达到稳定状态水平。平行实验，阴性对照组(除未加药物外，其他处理方式与给药组一致)，式(I)化合物给药组，IFN-α组，IFN-α和化合物(I-1Z)联合给药组组，细胞达到90％汇合度时1∶3传代，维持培养大约60天。与阴性对照组，单独加入化合物(I-1Z)没有降低细胞内的HCV稳态的RNA水平，而单独加入IFN-α(100U/ml)组第30天后细胞内的HCVRNA水平降低2个数量级。尤其当IFN-α和20μM化合物(I-1Z)联合应用时(图3)，表现出强大的协同效应。通过处理后培养30天，IFN-α和20μM化合物(I-1Z)联合应用有效降低HCVRNA至背景值(≥4数量级减少量)，该结果表明联合给药治愈了慢性病毒感染的细胞。为证实药物对HCV清除率，在60天时，终止药物治疗，并开始连续监测HCVRNA水平20天。在加入100U/mlIFN-α组的细胞HCVRNA水平立即反弹到阴性对照组的水平(图4)，而在100U/mlIFN-α和化合物(I-1Z)(20μM)联合给药组的细胞HCVRNA未出现反弹(图4)，HCV蛋白免疫组化染色试验也证实了这一点。与IFN-α单独给药组相比，IFN-α与化合物(I-1Z)联用给药慢性感染HCV的不生长的Huh7细胞后，第60天后，变现出显著的协同作用，降低HCVRNA水平一个数量级以上。我们也进行了单独使用IFN-β(20U/ml)或联合给药(20或40μM化合物(I-1Z)和20U/mlIFN-β联合给药)的药效学研究。药物处理感染HCV的细胞8周，每周收集3个复孔的细胞内RNA，RT-qPCR方法检测HCVRNA。实验结果表明，化合物(I-1Z)单独给药组未减少HCV感染(即稳定状态下的细胞内HCVRNA水平)。与阴性对照组比较，IFN-β单独给药组从第3周到第8周，显著性降低细胞内HCVRNA水平(大约100倍)，证明了IFN-β具有抑制慢性HCV感染的药理学活性。值得注意的是，当IFN-β和20或40μM化合物(I-1Z)联合给药时观察到了显著性的协同效应。与HCV培养组(阴性对照组)相比，尤其是IFN-β(20U/ml)和40μM化合物(I-1Z)联合给药，在加药后第4周，协同显著性降低HCVRNA水平(＞10000倍)，在加药后第6周到第8周，协同降低HCVRNA水平到＞50000倍。检测的HCVRNA拷贝数水平与正常细胞的本底值相近，表明药物治愈了因HCV感染的细胞。这说明观察到的抑制作用不是因治疗引起的细胞毒作用的所致，而是药物发挥了治疗作用。总之，这些数据表明，无论宿主肝细胞增殖水平如何，在体外实验中，化合物(I-1Z)与IFN-α或IFN-β的能够协同显著性减少慢性HCV的感染。因此，不论是单独治疗，还是作为目前的HCV干扰素治疗方案的一种辅助疗法，式(I)化合物均可应用在HCV感染的预防或治疗中。实施例3：化合物(I-1Z)的体内活性丙型肝炎病毒感染及相关预防或治疗感染的丙型肝炎病毒感染的药物研究，因缺乏丙型肝炎病毒感染的小动物模型的缺乏而受到限制和阻碍。虽然开发了几种小动物感染模型：树鼩(Xie，etal.(1998)Virology244：513-520，Zhao，etal.(2002)J.Clin.Invest.109：221-232)，狨猴/绢毛猴(Feinstone，etal.(1982)J.Infect.Dis.144：588-598；Karayiannis，etal.(1983)J，Med.Virol.11：251-256；Watanabe，etal.(1987)J.Med.Virol.22：143-156)，和其他灵长类动物(Abe，etal.(1993)J.Med.Primatol.22：433-434)，然而丙型肝炎病毒仅能在黑猩猩上成功感染。最近，肝异种植入的方法已经成为构建丙型肝炎病毒感染的小鼠模型的一种公认的方法(Knetman&Mercer(2005年).Hapatology41：703-706；Kneteman&Toso(2009)MethodsMol.Biol.510：383-399；Grompe，etal.(1999)Semin.Liv.Dis.19：7-14)。这种方法将人原代肝细胞移植到具有内源性肝细胞致死缺陷的免疫缺陷小鼠肝脏上。随着小鼠内源性肝细胞死亡，移植的人原代肝细胞可以重新填充小鼠肝脏，导致小鼠形成嵌合肝脏，允许HCV感染。因此，为证明化合物(I-1Z)的体内活性，实验使用三重突变体(包括Fag-/-/RAG2-/-/I12rg-/-小鼠)的小鼠进行实验，这种小鼠被证明能够接受肝异种植入(Azuma，etal(2007)Nat.ImmunolBiotechnol.：25：903-910；Schultz，etal.(2007)Nat.Rev，Immunol.7：118-130)。当然，也可以使用免疫缺陷(SCID)/尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)同时缺陷的小鼠。人原代肝细胞移植小鼠，按常规方法(Azuma，etal(2007)Nat.ImmunolBiotechnol.：25：903-910；Bissig，etal.Proc.Natl.Sci.Acad.USA104：20507-20511)，移植后监测2个月，通过测量人血清白蛋白水平来评估移植效果。使用这些模型，可以评估药物对小鼠的丙型肝炎病毒感染的预防或对已经感染丙肝病毒的抑制效果。为证明预防作用，小鼠在感染丙肝病毒前，给予下列2种给药方式：1)小鼠在被感染前一天口服10mg/kg/天化合物(I-1Z)，2)小鼠在被感染前口服1mg/kg/天，3mg/kg/天的化合物(I-1Z)7天。小鼠被注射任何HCV基因型HCV阳性的人血清，同时定量检测血清HCVRNA含量(每天和/或每周)，以评估药物在降低扩增HCVRNA水平方面的效果。实验结果表明，与未给药的动物相比，化合物(I-1Z)降低了感染HCV动物体内的HCV增殖水平，提示化合物(I-1Z)对人类是一种有效的HCV治疗药物。因此，可以预期，化合物(I-1Z)可以有效抑制丙型肝炎病毒感染。为证明治疗作用，小鼠感染HCV阳性的人血清(任何HCV基因型)。对血清HCVRNA进行定期监测，确认成功感染，建立稳定的体内慢性感染模型。慢性丙型肝炎病毒感染的小鼠分别进行以下平行给药处理(1)I型干扰素(例如，皮下注射派罗欣30μg/kg，每周两次)，(2)口服化合物(I-1Z)(单用)，剂量为10mg/kg/天(3)I型干扰素(例如，派罗欣(30μg/kg，每周两次)和化合物(I-1Z)(10mg/kg/天)联合用药。在治疗期间，每周对血清HCVRNA进行定量检测，评估各组给药方案对稳态HCVRNA水平减少的疗效。实验结果表明，化合物(I-1Z)单独或与IFN联用均可降低体内HCV水平，提示化合物(I-1Z)能够有效治疗感染HCV的患者。因此，可以预期，与I型干扰素或化合物(I-1Z)单独治疗相比，I型干扰素和化合物(I-1Z)联合给药将协同增强HCV感染的清除。实施例4：化合物(I-1Z)的体内活性为了进一步检测化合物(I-1Z)对HCV的体内侵入抑制效果，本发明在已培育完善的丙肝易感模型品系-树鼩(Tupaiabelangeri，Lietal-2011)上对化合物(I-1Z)进行了药效学研究。预防实验：实验树鼩15只，每组5只，分别为未给药组，I-1Z1m/kg组，I-1Z5m/kg组。在HCV感染前，未给药组口服生理盐水，给药组每天给药1次(给药方式为口服给药)，持续给药2周，两周后对树鼩进行感染。感染后第二周至第六周抽血测定HCVRNA。实验结果表明，与未给药的动物相比，在第4周时，I-1Z1m/kg组，5只树鼩体内HCVRNA的含量低于检测限，I-1Z5m/kg组仅有一只树鼩体内HCVRNA的含量检测到浓度极低的HCVRNA，说明化合物(I-1Z)能有效预防HCV对树鼩的感染(图5)；第二周至第六周血液HCVRNA的检测显示，I-1Z1m/kg组，I-1Z5m/kg组的体内阳性感染检出频次显著性低于未给药组(图6)，未给药组阳性感染共检出12次，I-1Z1m/kg组阳性感染检出3次，I-1Z5m/kg组阳性感染检出2次。I-1Z预防实验结果提示化合物(I-1Z)对人类是一种有效的HCV感染预防药物。同时给药实验：实验树鼩10只，每组5只，在HCV感染时同时给药，未给药组每天口服生理盐水，给药组每天给药1次(给药方式为口服给药)，I-1Z3mg/kg，持续给药2周。在HCV感染前一天，感染后连续4周每周抽血，在第4周时，与未给药的动物相比，60％树鼩体内HCVRNA的含量低于检测限，表明化合物(I-1Z)能有效预防或治疗HCV对树鼩的感染(图7)，结果提示化合物(I-1Z)在感染同时给药同样能有效抑制HCV感染。