一种单胺氧化酶及其在合成手性氮杂双环化合物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域，具体涉及一种单胺氧化酶，含有该酶编码基因的重组 表达载体和重组表达转化体，表达的重组酶和该重组酶的制备方法，以及该单胺氧化酶作 为催化剂在合成博西普韦中间体中的应用。
【背景技术】
[0002] 博昔普韦（boceprevir)及特拉匹韦（telaprevir)是丙型肝炎病毒（HCV)蛋白酶 抑制剂，其化学结构式如下所示：
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[0004] III期SPRINT-2研究显示，与标准治疗相比，24周的博昔普韦标准治疗可提高HCV 基因1型初治患者的SVR率。博昔普韦标准治疗24周与博昔普韦标准治疗44周的抗病毒 疗效相似。
[0005] 片段A是合成博昔普韦的关键中间体之一，片段A的结构如下：
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[0007] 目前关于片段A主要有如下合成路线：
[0008] 路线1 :TO2007075790公开了利用6, 6-二甲基-3-氧杂双环[3. 1. 0]己 烷-2, 4-二酮将内酯内酰胺化、羰基还原、还原加成氰基、水解、拆分等得到片段A的盐，具 体反应路线如下所示：
[0009] 123456 由于此路线中的氰基加成利用了硝酸银、氰化钾和盐酸，成本较高，对于后处理和 三废处理也带来了很大困难，不利于工业化生产。 2 路线 2 :文献（Journal of Medicinal Chemistry, 2006, Vol. 49, No. 20, 6074-6086 )中公开了一种以3-苯基四氢吡咯[l，2-c]恶唑-5(1H)_酮为原料，经过去氢、环丙烷化、 开环、还原、氧化等一系列反应得到关键片段A，具体反应路线如下所示： 3 4 由于此路线中的还原反应采用了氢化锂铝和钯碳，反应条件苛刻，后处理较为繁 琐，也不利于工业化生产。 5 路线3 :TO2004113295公开了使用6, 6-二甲基-3-氧杂双环[3. 1. 0]己 烷-2, 4-二酮为原料，经过醇解、酰胺化、还原酰胺基和酯基、将氨基保护后氧化醇成醛、成 环、氰基化、水解、去保护得到片段A的盐酸盐，具体反应路线如下： 6
[0016] 虽然此路线具有起始原料价廉易得优点，但该路线在制备（lR，3S)-3-氨甲 基-2, 2-二甲基环丙烷基甲醇时需采取二级还原反应，即，首先利用选自铝烷、在三甲基硅 烷基氯存在下的硼氢化锂或硼氢化钠还原酯基，再使用氢化铝锂或三乙酰氧基硼氢化钠还 原酰胺基，上述还原反应条件剧烈，温度要求苛刻，反应时间较长，后处理繁琐，安全性低， 以致影响了该路线的工业化应用。
[0017] 路线 4 :文献（J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 6467-6472)公开了 利用来自黑曲 霉（Aspergillus niger)的单胺氧化酶的消除-加成反应制备（1S，2S, 5R)-6, 6-二甲 基-3-氮杂-双环[3. 1. 0]己烷-2-腈的方法，如下所示：
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[0019] 该方法通过单胺氧化酶将前手性的胺氧化为手性亚胺，在NaHS03存在的条件下生 成加成产物；后者与NaCN反应得到手性的亚胺加成产物（如上图），后者甲醇解得到氨基 酸甲酯盐酸盐。该法立体选择性地构建了 3个手性中心，比化学方法简便、易于操作、对环 境友好；但是亚胺产物易挥发且闪点较低，需要额外加入NaHS03，步骤较为繁琐。
[0020] 片段B是合成特拉匹韦的关键中间体之一，片段B的结构如下：
[0021] 123 目前关于片段B的合成路线主要有如下路线： 2 路线1 :EP0600741公开了如下路线： 3
[0025] 由于由该路线合成得到的目标物存在于油状混合物中，需经过硅胶柱层析分离才 能得到纯品，不仅后处理繁琐，而且无法实现规模化生产。
[0026] 路线2 :TO0218369公开了如下路线：
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[0028] 由于该路线采用DIBAL-H还原，不仅试剂成本较高，而且制备条件苛刻（需 在-78°C下反应），因此此路线也不适合于工业化生产要求。
[0029] 路线3 :CN101463001中公开了如下路线：
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[0031] 该路线使用了剧毒的羰基钴，不仅成本太高，而且无法满足环保要求，因此该路线 也不能满足产业化要求。
[0032] 路线4 :W02008090819公开了如下路线：
[0033] 12 由于该路线的起始原料难以合成、不能批量购得，因此也不适合工业化生产要求。
【发明内容】
2 本发明所要解决的技术问题是，针对已报道的制备博西普韦中间体片段A和特 拉匹韦中间体片段B的反应中收率低、原料成本昂贵、反应不完全、对应选择性不高或 者对环境不友好等问题，提供了一种催化活性高、对映选择性强、底物耐受性好的单胺 氧化酶进行酶催化合成（lS，2S，5R)-6,6-二甲基-2-取代-3-氮杂双环[3. 1.0]己烷 或（lS，3aR，6aS)-1-取代-八氢环戊[c]吡咯，进而进一步合成（13,23,51?)-6,6-二甲 基-3-氮杂双环[3. 1.0]己烷-2-腈及其水解产物（1S，2S，5R)-6, 6-二甲基-3-氮杂双 环[3. 1.0]己烷-2-甲酸甲酯，或进一步合成（lS，3aR，6aS)_八氢环戊[c]吡咯-1-腈的 酶-化学合成方法。还提供了编码该单胺氧化酶的基因，含有该基因的重组表达载体、重组 表达转化体及其高效制备方法，以及该单胺氧化酶在催化胺氧化反应中的用途。
[0036] 本发明通过下述技术方案以解决上述技术问题：
[0037] 本发明的第一方面提供了一种分离的单胺氧化酶，其是如下（a)、（b)或（c)的蛋 白质：
[0038] (a)由SEQ ID N0:2所示氨基酸序列组成的蛋白质。
[0039] SEQ ID N0:2所示氨基酸序列组成的蛋白质由来源于环境的DNA编码，具有单胺氧 化酶的功能，是一种新的单胺氧化酶。
[0040] (b)在（a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基衍生的 具有单胺氧化酶活性的蛋白质。
[0041] 其中，所述的"几个"是指2个至100个，更佳地小于30个，最佳地小于10个。t匕 如添加一个外分泌信号肽的融合蛋白，本发明人发现这样的融合蛋白同样具有单胺氧化酶 活性。也就是说，只要由（a)衍生的蛋白质具有单胺氧化酶活性，且衍生方式如上所述，都 可以达到本发明的发明目的。根据本发明，在如SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的蛋白质（a) 分子中进行1~5个氨基酸残基的突变，仍然保持单胺氧化酶活性。
[0042] (c)与（a)的氨基酸序列具有至少94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性且具 有单胺氧化酶活性的蛋白质。
[0043] 发明人将SEQ ID N0:2所示的单胺氧化酶序列与其他已知单胺氧化酶进行序列 比对，与土曲霉（Aspergillus terreus)单胺氧化酶之间的同一'丨生为93 %，与来自黑曲霉 (A. niger)的单胺氧化酶的同一性低于80%。本发明的单胺氧化酶与已知单胺氧化酶的氨 基酸序列具有显著差异性。
[0044] 在本文中，氨基酸序列之间的同一性是根据序列的全长进行计算，优选采用NCBI Blastp程序进行比对，默认参数。
[0045] 本发明的第二个方面提供了一种分离的核酸，其编码本发明的单胺氧化酶。优选 地，所述核酸是由SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列组成的。
[0046] SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列组成的核酸来源于环境DNA，其可以从土壤中分离 获得，也可以从含有该核酸的重组表达载体中或重组转化体中分离获得，也可以全基因人 工合成获得。
[0047] 本发明的单胺氧化酶基因命名为BYK-M0N，其编码序列（⑶S)长1479bp，起始密 码子为ATG，终止密码子为TAA，全长编码序列如SEQ ID NO: 1所示，其编码的氨基酸序列如 SEQ ID N0:2 所示。
[0048] 如本领域技术人员所知，由于密码子的简并性，编码SEQ ID N0:2的氨基酸序列的 核苷酸序列不仅仅局限于SEQ ID N0:1。本发明的单胺氧化酶基因的核苷酸序列也可以是 编码序列表中SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的其他任何核苷酸序列。另外，还可以通过适 当引入替换、缺失或插入来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物 可以通过对核酸序列SEQ ID NO: 1的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换、缺失 或增加来制得。
[0049] SEQ ID NO: 1的同系物也指启动子变体。在所述的核酸序列之前的启动子或信号 序列可通过一个或多个核酸的替换、插入或缺失而改变，但这些改变对启动子的功能没有 负面影响。而且通过改变启动子的序列或甚至用来自不同种生物体的更有效的启动子完全 替换，可提商目标蛋白质的表达水平。
[0050] SEQ ID NO: 1的同系物还指在标准条件下能够与SEQ ID NO: 1所示序列的多聚 核酸进行杂交的多聚核酸。在标准条件下进行杂交可根据《分子克隆实验指南》中描述的 方式进行：Cold Sp