肽和其用途的制作方法

本发明大体上涉及抗微生物肽和它们的使用方法。
背景技术：
：尽管在过去一个世纪中生活标准和生物医学技术有了显著的改善，但传染病的全球负担仍然极高，并且是公共卫生、经济和社会问题的主要原因。根据世界卫生组织(WHO)的统计，传染病和寄生虫病如肺炎、结核病、脑膜炎、腹泻病、HIV和疟疾是全世界第二大死亡原因。在工业化国家中广泛和经常不加区别地使用抗生素通过促进抗药性病原体的快速出现使得传染病越来越难以用现有类别的抗生素加以控制而进一步加剧了该问题。抗生素抗性感染的爆发危机加上新的小分子抗生素开发的持续缺乏，已引起相当大的努力来发现和开发膜活性抗微生物肽(AMP)作为替代类别的抗微生物剂。天然存在的抗微生物肽也被称为“宿主防御肽”，首先作为先天免疫的组成部分被发现，在所有活生物体中形成针对侵入的病原体的第一道防线。与抑制特定生物合成途径如细胞壁或蛋白质合成的常规抗生素不同，大多数阳离子抗微生物肽通过物理破坏带更多负电荷的微生物膜脂质双层来诱导细胞质组分的渗漏，从而导致细胞死亡而发挥其活性。据认为膜破坏的物理性质使药物产生抗性的可能性较低，因为对于微生物来说以与正遭受损伤时相同的速率突变或修复其膜组分在代谢上变得“代价更高”。尽管在过去30年中已分离并表征了来自各种来源(包括微生物、植物和动物)的超过1700种天然存在的抗微生物肽，但仅有极少数AMP如多粘菌素和短杆菌肽正在临床上被使用；并且由于它们的高全身毒性而主要用于局部制剂中。对于应用抗微生物肽作为药物所确定的主要挑战在于合成长肽序列的高成本、差的稳定性和在全身施用后未知的毒性。在增强抗微生物活性和使非特异性毒性最小化的努力中，更多的研究人员越来越多地利用天然存在的抗微生物肽或蛋白质序列作为模板来进行化学修饰，如环化、序列截短和用D-氨基酸、β-氨基酸或氟化氨基酸取代，以产生对于体内局部或全身感染具有更广泛应用的新的肽类似物。然而，目前优化天然存在的抗微生物肽序列的方法充其量在很大程度上仍然是经验性的，使得极难以描述一般结构-活性关系，尤其是针对大量序列和结构多样性的背景。此外，许多新的肽类似物保持较长(20个氨基酸或更多)，这可能诱导显著的免疫原性并最终增加大规模制造的成本。更重要的是，已提出了使用具有与宿主防御抗微生物肽非常接近的序列的抗微生物肽可触发对于先天AMP的抗性的发展，这可能不可避免地损害针对感染的天然防御，引起显著的健康和环境风险。同时，抗生素抗性细菌和真菌在医院和社区环境中的快速出现已对世界各地的保健系统造成显著压力。尽管抗生素抗性病原体如抗甲氧西林的金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(MRSA)、抗万古霉素的肠球菌(Enterococci)(VRE)以及多重抗药性肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)和不动杆菌属种(Acinetobacterspp.)的全球性发生率已达到流行水平，但进入临床开发渠道的新抗生素的数量是令人沮丧的；自2000年以来仅有三种新结构类别的抗生素，包括恶唑烷酮(利奈唑胺)、脂肽(达托霉素)和截短侧耳素(瑞他莫林)进入市场。鉴于病原菌如金黄色葡萄球菌(S.aureus)、肠杆菌属(Enterobacter)和克雷伯氏菌属(Klebsiella)正在对万古霉素和碳青霉烯类产生抗性，这一开发尤其令人担忧，万古霉素和碳青霉烯类是在医院中传统上作为易感患者的最后一道防线保留的强效抗生素。随着小分子抗生素开发的持续缺乏，具有可有效克服抗药性机制的新作用模式的替代类别的抗微生物剂的设计和鉴别比以往更加迫切。由于大多数抗微生物肽通过快速和直接的膜溶解机制发挥它们的抗微生物活性，因此它们在克服微生物针对靶向特异性生物合成途径的小分子抗生素获得的常规抗生素抗性机制如微生物膜上药物外排泵的增加表达、药物降解酶的产生或药物相互作用位点的改变等方面具有固有的优势。然而，限制抗微生物肽的成功临床转化的显著障碍包括由于差的微生物膜选择性所致的高全身毒性、相对高的制造成本(对于长肽序列)和对存在于生物体液如血清、伤口渗出物或泪液中的蛋白酶降解的敏感性。角膜炎一直是眼部发病的重要原因，并且它也是导致失明的主要眼部疾病。角膜炎的症状包括眼中的疼痛和发红、视力模糊、对光的敏感性和多泪或过多分泌物。它可导致严重的视力丧失和角膜上的创伤。此外，角膜炎的发病率在过去30年里已增加，主要是由于在治疗患有角膜炎的患者中频繁使用局部皮质类固醇和抗细菌剂，以及由于免疫功能不全的患者数量的上升。角膜炎的原因包括单纯疱疹病毒1型、水痘带状疱疹和腺病毒、细菌、寄生虫、真菌和维生素A缺乏。2005年和2006年在美国以及法国、香港和新加坡报道了角膜炎的爆发。在美国的大多数病例涉及软性角膜接触镜佩戴，其主要由真菌感染引起。由于几个原因，角膜炎对于眼科医生仍然是诊断和治疗挑战。主要的挑战是快速和准确的诊断。角膜炎的诊断通常通过培养或角膜活检进行。然而，在实验室中分离和鉴别生物体的物种耗费时间，常常导致延误诊断。此外，由于角膜炎可由各种微生物引起，因此不同类型的角膜炎经常被误诊为彼此。例如，真菌性角膜炎经常被误诊为细菌性角膜炎，因为临床医生经常仅在假定的细菌性角膜炎在抗生素疗法期间恶化后才考虑真菌性角膜炎。此外，抗真菌敏感性测试是不可靠的，并且与临床功效差相关。即使准确地进行诊断，由于角膜渗透性差以及用于治疗角膜炎的药剂的商业可用性有限，因此对病况的管理仍然是一个挑战。大多数市售药物仅仅是抑制真菌的或杀细菌的，并且为了使该病况成功消退，它们需要完整的免疫系统和延长的疗程。此类微生物特异性药物是有缺点的，因为在可提供治疗前需要对角膜炎原因进行特异性诊断。此外，市售的抗真菌药物没有处理以下事实：真菌角膜炎感染经常作为生物膜存在，生物膜特别难以去除，因为真菌细胞被包封在保护性和不可渗透的细胞外基质(ECM)中。因此，通常，为了力图清除生物膜，治疗需要显著更高剂量的抗真菌剂。此外，目前的商业药物包括唑类化合物(如氟康唑(funconazole))和聚烯(如两性霉素B(amphopterinB)、制霉菌素和那他霉素)。唑类是抑制真菌的，其通过酶抑制起作用并且易于产生抗药性。然而，本领域内可用的唑类是极不稳定的；它们的局部溶液必须保持冷藏不超过48小时并避光。本领域内已知的另一抗真菌药物是通过破坏穿过细胞膜的离子渗透性而起作用的聚烯，其相当昂贵，水溶性差并且在水性、酸性或碱性介质中或者在暴露于光和过热时相当不稳定。所有这些限制了它们的临床应用。鉴于上述情况，需要提供可用于治疗由各种微生物引起的角膜炎的替代药剂。还需要提供可用于治疗角膜炎的使用起来稳定且安全的替代药剂。技术实现要素：在一个方面，提供了包含(X1Y1X2Y2)n(式I)的两亲性肽在制造用于治疗受试者的角膜炎的药物中的用途，其中所述肽的C-末端被酰胺化；X1和X2彼此独立地为疏水性氨基酸；Y1和Y2彼此独立地为阳离子氨基酸，并且其中n为至少1.5，其中所述肽能够自组装成b-折叠结构。在另一方面，提供了用于治疗受试者的角膜炎的如本文所述的肽。在另一方面，提供了治疗受试者的角膜炎的方法。所述方法包括施用药学有效量的如本文所述的肽。在另一方面，提供了从受试者的角膜去除生物膜的方法。所述方法包括施用如本文所述的肽。附图说明当结合非限制实施例和附图考虑时，参考具体实施方式将更好地理解本发明，其中：图1显示合成的形成β-折叠的肽的设计特征。A)显示本公开的示例性肽。B)显示呈现为线性分子的本公开的肽的示例。C)显示由本公开的肽引起的可能的膜破坏的示意图。简单地说，在水溶液中，由于质子化的Arg和/或Lys残基之间的静电排斥，因此肽以单体无规卷曲形式存在。然而，在微生物细胞膜存在下，肽容易组装成通过带正电荷的残基和带负电荷的磷脂之间的静电相互作用而稳定的β-折叠二级结构，随后它们的疏水残基插入脂质双层中以介导膜破坏。图2显示(a)(VRVK)2-NH2(SEQIDNO:11)、(b)(IRIR)2-NH2(SEQIDNO:12)、(c)(IKIK)2-NH2(SEQIDNO:13)、(d)(IRIK)2-NH2(SEQIDNO:17)、(e)(IRVK)2-NH2(SEQIDNO:14)、(f)(FRFK)2-NH2(SEQIDNO:15)、(g)(VRVK)3-NH2(SEQIDNO:20)、(h)(IRIK)3-NH2(SEQIDNO:21)、(i)(IRVK)3-NH2(SEQIDNO:22)在去离子水和25mMSDS胶束溶液中的圆二色谱。图2证实在微生物膜模拟条件(25mMSDS溶液)下本公开的肽如何容易自组装成β-折叠二级结构。图3显示合成的抗微生物肽的溶血活性。图3显示本公开的肽在不同的最小抑制浓度(MIC)值下诱导对大鼠红细胞的最小溶血或无溶血。图4显示在用不同浓度(即0、0.5×最小抑制浓度(MIC)、MIC和2×MIC)的代表性肽(IRIK)2-NH2(SEQIDNO:17)处理后的活微生物菌落形成单位(CFU)的图。图4图3显示本公开的肽在MIC值和MIC值以上是杀菌的。图5显示用含有10％(以体积计)水的液体培养基(作为对照)和代表性肽(IRIK)2-NH2(SEQIDNO:17)和(IRVK)3-NH2(SEQIDNO:22)的液体培养基处理2h的(a)大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)和(b)金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的FE-SEM图像。图5显示本公开的肽可引起大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌的膜溶解。图6显示使用XTT法所测定的在用不同浓度的(IRIK)2-NH2(SEQIDNO:17)和(IRVK)3-NH2(SEQIDNO:22)处理24h的生物膜中的金黄色葡萄球菌的细胞活力。*P<0.01，相对于(IRVK)3-NH2。图6显示本公开的肽显示出对驻留在生物膜中的金黄色葡萄球菌的剂量依赖性杀死。图7显示通过结晶紫染色所测定的用不同浓度的(IRIK)2-NH2(SEQIDNO:17)和(IRVK)3-NH2(SEQIDNO:22)处理24小时的预形成的金黄色葡萄球菌生物膜的生物量变化。图7证实本公开的肽可用于去除生物膜。图8显示具有(a)两个重复单元(n＝2)和(b)三个重复单元(n＝3)的本公开的肽对FITC标记的LPS聚集体的稳定性的影响。图8证实本发明的肽在破坏脂多糖(LPS)聚集体方面有效。图9显示本公开的肽对大鼠巨噬细胞系NR8383中LPS刺激的NO产生的抑制作用。图9证实本公开的肽在中和LPS的作用方面有效。图10显示在与不同浓度的本公开的肽培养18h后大鼠巨噬细胞系NR8383的细胞活力。图10显示本公开的肽的抗炎性质独立于它们对细胞活力的影响，并且所述肽在抗微生物活性和抗炎活性所需的浓度下是无细胞毒性的。图11显示在微生物膜模拟条件(25mMSDS胶束溶液)下(a)IK8对映异构体、(b)IK12对映异构体、(c)IK8立体异构体和(d)对照肽的圆二色谱。图11显示在微生物膜模拟条件下本公开的肽容易自组装以形成β-折叠二级结构。图12显示在兔红细胞中(a)IK8立体异构体、(b)IK12对映异构体和(c)IK8非形成β-折叠的肽对照的溶血活性。图12显示本公开的肽的D-立体异构体在MIC值下表现出最小溶血或无溶血，对微生物膜具有高选择性。图13显示在用蛋白酶(a)胰蛋白酶和(b)蛋白酶K处理6h后IK8-全部L和IK8-全部D针对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌和绿脓假单胞菌的抗微生物活性。图13显示本公开的肽的所有D对映异构体均为蛋白酶抗性的。图14显示在用不同浓度(即0、0.5×最小抑制浓度(MIC)、MIC和2×MIC)的IK8-全部D处理18h后的(a)表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、(b)金黄色葡萄球菌、(c)大肠埃希氏菌、(d)绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和(e)白色念珠菌(Candidaalbicans)的活菌落形成单位(CFU)的图。对每种微生物在MIC值和2×MIC值所设计的肽实现菌落计数超过3个对数减少(>99.9％杀死)，表明杀菌作用机制。图14证实与L-对映异构体类似，本公开的肽的D-对映异构体具有杀菌机制。图15显示用125mgL-1IK8-全部D和含有10％(以体积计)HPLC水的MHBII处理2h的(a)金黄色葡萄球菌和(b)绿脓假单胞菌的FE-SEM图像。图15证实本公开的肽的D-对映异构体可引起金黄色葡萄球菌和绿脓假单胞菌的膜溶解。图16显示暴露于次最小抑制浓度(MIC)的IK8-全部D和不同的临床使用的抗生素的(a)大肠埃希氏菌和(b)金黄色葡萄球菌的抗药性产生曲线。图16表明在所测试的时间范围内本公开的肽不诱导任何抗药性的产生。图17显示在受感染的小鼠巨噬细胞系RAW264.7(MOI10)中由IK8-全部D介导的金黄色葡萄球菌的细胞内杀死。图17证实本公开的肽具有针对受感染的细胞内存在的细菌的强效的抗微生物性质。图18显示在去离子水中(a)IK8对映异构体、(b)IK8立体异构体、(c)IK12对映异构体和(d)对照肽的圆二色谱。图18证实本发明的肽的对映异构体和立体异构体在去离子水中保持为无规卷曲，并且不采用任何二级结构。图19显示证实胰蛋白酶和蛋白酶K对(a)(IRIK)2-NH2(SEQIDNO:17)和(b)(irik)2-NH2(SEQIDNO:18)的蛋白质水解活性的MALDI-TOF质谱。箭头指示主要的酶切割位点。图19显示，与L-对映异构体相反，蛋白酶对本公开的D-对映异构体肽的处理不会导致D-对映异构体肽的降解。图20显示在用合成的抗微生物肽IK8-全部D处理18h后，对(a)抗环丙沙星的大肠埃希氏菌和(b)抗庆大霉素的大肠埃希氏菌的最小抑菌浓度(MIC)测定。图20显示本公开的肽的D-对映异构体能够以与野生型(非抗药性)大肠埃希氏菌相同的浓度抑制抗庆大霉素的大肠埃希氏菌和抗环丙沙星的大肠埃希氏菌。图21显示针对小鼠肺泡巨噬细胞RAW264.7和人胎儿肺纤维母细胞WI-38细胞系的K8-全部D的细胞毒性研究。图21证实本公开的肽的D-对映异构体仅在远高于抗微生物浓度的浓度下是细胞毒性的。图22显示本公开的肽选择性地杀死癌细胞(HeLa)并且对非癌性大鼠肺泡巨噬细胞(NR8383)和人真皮纤维母细胞系的细胞毒性较小。图23显示图解说明肽(IKIK)2-NH2对白色念珠菌的杀死动力学的图。图23显示在MIC水平处理2小时后白色念珠菌数目的显著降低。大多数真菌在MIC4小时和在2×MIC或4×MIC1小时被根除。因此，图23图解说明本公开的肽是针对白色念珠菌的有用抗真菌剂。图24显示示出在用肽(IKIK)2-NH2处理24小时后白色念珠菌的细胞活力百分比的图。图24A显示90％的白色念珠菌细胞在500mg/L的肽(IKIK)2-NH2的单次处理后24小时内被杀死。图24B显示在相同浓度的相同肽的处理后显著降低的白色念珠菌生物量。因此，图24显示本公开的肽可用于诱导白色念珠菌的死亡和降低白色念珠菌生物量。图25显示在用肽(IKIK)2-NH2处理之前和之后白色念珠菌生物膜的形态状态的场发射扫描电子显微图像。在24小时处理后，白色念珠菌细胞形态变形并且生物量显著降低。因此，图25显示本公开的肽可用于使白色念珠菌的形态变形和降低白色念珠菌生物量。图26显示在局部施用肽(IKIK)2-NH2(即肽1)和肽(IRIK)2–NH2(即肽2)后角膜的组织学图像。在局部施用所述肽后，使用苏木精和曙红的小鼠角膜的组织切片。比例尺：200μm。在局部施用3000mg/L肽1和肽2后角膜的组织学图像未显示角膜上皮侵蚀的显著迹象，并且施加所述肽未导致基础基质中的明显病理变化。因此，图26显示本公开的肽在用作滴眼剂时对眼是无毒的。图27显示在用H2O(对照)、两性霉素B(AMB)(1000mg/L)、肽(IKIK)2-NH2(即肽1)(3000mg/L)和肽(IRIK)2–NH2(即肽2)(3000mg/L)处理后患有白色念珠菌角膜炎的小鼠眼的拍摄图像。与对照组相比，在处理后观察到角膜炎感染的显著消退，角膜变得更透明并且虹膜可见。因此，图27显示本公开的肽的治疗功效与两性霉素B的治疗功效相当。图28显示描绘用以下四种局部滴眼剂治疗之前和之后角膜炎的临床裂隙灯评分(±标准偏差)的条形图：H2O(对照)、两性霉素B(AMB)(1000mg/L)、肽(IKIK)2-NH2(即肽1)(3000mg/L)和肽(IRIK)2–NH2(即肽2)(3000mg/L)。两性霉素B治疗的眼和肽治疗的眼的临床评分显著低于对照组中的眼的临床评分(P<0.01)。因此，图28显示两性霉素B治疗的眼和肽治疗的眼的评分没有显著差异。图29显示用指定溶液处理的角膜的组织学图像。将角膜样品包埋在石蜡中，并连续切片以用PAS染色；真菌被染成粉红色。比例尺：200μm。在对照组中，真菌菌丝延伸到角膜基质中，而用两性霉素B(AMB)、肽1和肽2的处理减小了菌丝侵入角膜的最大深度。因此，图29证实本公开的肽显著降低了真菌在患有角膜炎的角膜中的浸润。图30显示描绘在用两性霉素B(AMB)、肽(IKIK)2-NH2(即肽1)和肽(IRIK)2–NH2(即肽2)处理后小鼠角膜中白色念珠菌的微生物学计数的条形图。收集来自每组的六个角膜样品(来自每只小鼠的一只眼)并分析。所述肽在减少眼球中白色念珠菌菌落的数目方面与两性霉素B一样有效，并且与未处理的对照组相比，约90％的真菌细胞在处理后从生物膜中被根除。因此，图30显示本公开的肽在根除小鼠眼中的固着性角膜炎相关真菌和它们的生物膜方面是有效的。附表简述表1显示本公开的肽的表征。表2显示本公开的肽的最小抑制浓度(MIC)和选择性指数。表3显示本公开的肽的设计和表征。表4显示本公开的肽的最小抑制浓度(MIC)和选择性指数。表5显示本公开的肽针对临床分离的抗药微生物的最小杀微生物浓度(MBC)。表6显示本公开的肽针对临床分离的结核分枝杆菌的最小抑制浓度(MIC)。表7显示体内角膜炎治疗的临床分级和评分。表8显示本公开的肽的最小抑制浓度(MIC)。具体实施方式与天然存在的肽序列具有最小相似性的短合成肽的设计和优化是用于开发用于临床使用的安全且有效的抗微生物肽的有用策略。除了具有净电荷在+2到+9之间的阳离子特征以及包含约30-50％的疏水性氨基酸残基之外，不同天然存在的和合成的抗微生物肽的一个共同性还在于两亲性肽经常在与微生物膜接触时折叠以形成二级结构。在折叠结构的两种主要形式(包括α-螺旋肽(例如抗菌肽cathelicidin、天蚕抗菌肽cecropin、爪蟾抗菌肽magainin)和β-折叠肽(例如防御素和抗菌肽protegrin))之间，已发现两亲性β-折叠肽的溶血性较低，同时具有与它们的相等电荷和疏水性的α-螺旋对应物相当的抗微生物活性。因此，本公开的目的是提供具有β-折叠可折叠结构的短合成肽，其具有抗微生物活性并且具有较低的溶血性。角膜炎是眼部发病的主要原因。角膜炎的不同原因常常被误诊为彼此，由此导致适当治疗的延误。此外，由于缺乏用于临床使用的安全且有效的抗角膜炎药剂，因此角膜炎的治疗仍然是一个挑战。近年来，抗微生物肽(AMP)作为具有克服抗生素抗性的潜力的强效且广谱的抗微生物剂已受到相当大的关注。在本公开中，本发明人发现，与形成非β-折叠的肽和市售的两性霉素B相比，合成的形成β-折叠的肽可用于体内角膜炎治疗。因此，在一个方面，提供了包含(X1Y1X2Y2)n(式I)的两亲性肽在制造用于治疗受试者的角膜炎的药物中的用途，其中所述肽的C-末端被酰胺化；X1和X2可分别选自由疏水性氨基酸所组成的组；Y1和Y2可单独地选自由阳离子氨基酸组成的组；并且n可以是至少1.5，其中所述肽能够自组装成β-折叠结构。在一个示例中，本公开的发明人基于若干基本设计原理由天然存在的β-折叠可折叠AMP设计了由短重复的(X1Y1X2Y2)n-NH2序列组成的短合成β-折叠可折叠肽，所述基本原理包括但不限于：1)跨膜β-折叠中通常存在两亲性二分体重复，2)需要疏水残基(例如但不限于Val、Ile、Phe和Trp)和阳离子残基(例如但不限于Arg和Lys)以与微生物细胞壁和膜相互作用并使其混乱，以及3)Val、Ile、Phe和Trp的强β-折叠可折叠倾向。如本文所用的术语“两亲性肽”是指同时具有亲水性能和亲脂性能的肽，这两种性质由具有连接到疏水性氨基酸的阳离子氨基酸的肽赋予。如本文所用的术语“疏水性氨基酸”是指不溶于水的氨基酸残基。在一个示例中，术语“疏水性氨基酸”可包括但不限于丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、色氨酸(W)、半胱氨酸(C)、酪氨酸(Y)、组氨酸(H)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)、脯氨酸(P)和甘氨酸(G)。在一个示例中，疏水性氨基酸可以是丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、色氨酸(W)和半胱氨酸(C)。在一个示例中，疏水性氨基酸可以是异亮氨酸(I)或缬氨酸(V)。如本文所用的术语“阳离子氨基酸”是指可溶于水的氨基酸残基。在一个示例中，阳离子氨基酸可包括但不限于精氨酸(R)、赖氨酸(K)和组氨酸(H)。在一个示例中，两亲性肽是分离的肽。如本文所用的术语“分离的”是指不含或基本上不含例如与其天然缔合的蛋白质、脂质、核酸的肽。在一个示例中，两亲性肽可由(X1Y1X2Y2)n(式I)组成，其中X1和X2可彼此独立地为疏水性氨基酸；Y1和Y2可彼此独立地为阳离子氨基酸。因此，X1和X2可以是相同或不同的氨基酸并且Y1和Y2可以是相同或不同的氨基酸。在本公开中，n不可以是1，因为如本文所述的具有四个氨基酸的肽(例如X1Y1X2Y2(SEQIDNO：1))不具有抗微生物活性并且在微生物膜环境中不形成β-折叠。因此，n可以是约1.5到5。在一个示例中，n可以是1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5。在一个示例中，两亲性肽可包括但不限于X1Y1X2Y2X3Y3(SEQIDNO:2)、X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4(SEQIDNO:3)、X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5(SEQIDNO:4)、X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5X6Y6(SEQIDNO:5)、X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5X6Y6X7Y7(SEQIDNO:6)、X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5X6Y6X7Y7X8Y8(SEQIDNO:7)、X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5X6Y6X7Y7X8Y8X9Y9(SEQIDNO:8)和X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5X6Y6X7Y7X8Y8X9Y9X10Y10(SEQIDNO:9)。在一个示例中，X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7和X8可以是相同的或独立地不同的氨基酸，并且Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7和Y8可以是相同的或独立地不同的氨基酸。在一个示例中，本公开的肽可具有被酰胺化的C-末端。术语“C-末端”根据其在本领域内通常已知的定义在本文中使用，即可与以下任何术语互换使用，如羧基端、羧基末端、C-尾端、C端或COOH-末端，其是指由游离羧基(-COOH)封端的氨基酸链的末端。如本文所写出的，如本文所述的肽呈现为右侧的C-末端和左侧的N-末端。因此，如本文所使用的短语“C-末端被酰胺化”是指用伯胺基或仲胺基对本发明肽的C-末端的羟基的取代。在一个示例中，如本文所述的肽可以是(X1Y1X2Y2)n，其可以是(X1Y1X2Y2)n-NH2。在一个示例中，本公开的肽可通过本领域内通常已知的方法酰胺化。不希望受限于理论，据认为由于阳离子特性的增强C-末端酰胺化可能增强抗微生物活性；为本研究所设计的肽在C-末端被酰胺化以赋予高净正电荷。本公开的肽无需二级结构稳定剂。短语“二级结构稳定剂”是指能够保持多肽的主链原子的局部空间排列而不考虑其侧链的构象的分子。如本文所用的二级结构稳定剂可包括但不限于疏水效应、静电相互作用和化学交联，如多肽链内和之间的二硫键或金属离子内部交联。在一个示例中，本公开的肽不同于本领域内已知的现有β-折叠肽，因为它们无需二硫桥或其它共价键约束来稳定二级结构。在水溶液中，由于质子化的Arg和/或Lys残基之间的静电排斥，因此可预期本公开的肽以单体形式存在。在微生物细胞膜存在下，本公开的肽容易折叠成通过带正电荷的残基和带负电荷的磷脂之间静电相互作用随后其疏水残基插入脂质双层中而稳定的二级β-折叠结构。因此，在一个示例中，所述肽可能能够自组装成β-折叠结构。如本文所使用的术语“自组装”是指这样一种类型的过程，其中在没有外部引导的情况下预先存在的组分的无序体系由于组分本身之间的特定的局部相互作用而形成有组织的结构或图案。在本公开中，所述肽可在微生物膜环境中自发形成β-折叠结构。如本文所用的短语“微生物膜环境”是指靶微生物的膜中的微环境。在一个示例中，该环境可通过阴离子表面活性剂SDS的存在来模拟。在一个示例中，所述肽在去离子水或水溶液中可能不会自发形成β-折叠结构。如本文所用的“β-折叠”或“β-折叠片结构”是指可包含至少一条β-链的肽的规则二级结构，该β-链是长度为3-12个氨基酸的一段多肽链，具有几乎完全延伸的形式的主链。在一个示例中，本发明的β-折叠结构由至少一条β-链组成。此外，形成β-折叠的序列内的阳离子氨基酸和疏水性氨基酸的排列不可改变。在一个示例中，本公开的肽可包括：1)阳离子氨基酸残基的选择(即Arg相对于Lys相对于两者的组合)、2)疏水侧链的极性程度和庞大程度以及3)肽序列的具体长度。在本公开中，系统地研究了本公开的肽的各种可能构型对抗微生物活性和溶血活性的影响。在一些示例中，已发现含有Arg的肽与含有Lys的肽相比具有更强的抗微生物性能。不希望受限于理论，据认为本公开的富含Arg的肽的更强的抗微生物性能可能归因于胍侧链的更大的电荷密度。然而，本领域内通常认为肽序列内存在大量精氨酸残基与较高程度的溶血和细胞毒性相关。因此，Arg和Lys两者都包括于肽设计中，以利用Arg的高电荷密度来改善抗微生物作用，同时使用毒性较小的Lys残基来调节合成肽的毒性。同时，为了增强本公开的肽在生物体液中的稳定性，本公开的发明人研究了立体化学对合成肽的抗微生物活性的作用。因此，在一个示例中，提供了本公开的肽，可具有式I的每个重复单元n，彼此独立地包含1个或2个或3个或4个D-氨基酸且其余氨基酸是L-氨基酸。在一个示例中，式I的重复单元n可彼此独立地包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个或19个D-氨基酸且其余氨基酸是L-氨基酸。在一个示例中，式I的重复单元n可彼此独立地包含2个或4个或8个D-氨基酸且其余氨基酸是L-氨基酸。如本文所用的“L-氨基酸”和“D-氨基酸”是指可在每种氨基酸中存在的两种异构体。如本文所写出的，小写加下划线的残基表示D-氨基酸，而大写未加下划线的表示L-氨基酸。“L-氨基酸”是指在细胞中制造并且掺入蛋白质中的氨基酸异构体。“D-氨基酸”是指对本公开的肽的氨基酸的异构体修饰。有利地，“D-氨基酸”可不被人蛋白酶和微生物蛋白酶识别。因此，如图13和图19中所图解说明的，可防止本公开的肽在体内发生过早的蛋白质水解降解。然而，如本公开的发明人所发现的，在四个位置的选择性D-氨基酸取代导致二级结构的完全丧失。因此，在一个示例中，式I的每个重复单元n可彼此独立地包含1个或2个D-氨基酸且其余氨基酸是L-氨基酸。在一个示例中，式I的每个重复单元n中的D-氨基酸的分布可彼此相同或不同。在一个示例中，如本文所述的肽，其中n可以是2，并且第4位和第6位的氨基酸可以是D-氨基酸且其余氨基酸是L-氨基酸。如实验部分所说明的，在第4位和第6位的选择性D-氨基酸取代使得能够保留形成二级结构的倾向(参见图11c)。在一个示例中，如本文所述的肽可包含序列(IY1IY2)n-NH2或由序列(IY1IY2)n-NH2组成。在一个示例中，如本文所述的肽可包含序列(IRX2K)n-NH2或由序列(IRX2K)n-NH2组成。在一个示例中，如本文所述的肽当由通式X1Y1X2Y2X3Y3(SEQIDNO:2)表示时，可包括但不限于irikir-NH2(SEQIDNO:10)，其中小写加下划线的残基表示D-氨基酸。在一个示例中，如本文所述的肽当由通式X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4(SEQIDNO:3)表示时，可包括但不限于VRVKVRVK-NH2(SEQIDNO:11)、IRIRIRIR-NH2(SEQIDNO:12)、IKIKIKIK-NH2(SEQIDNO:13)、IRVKIRVK-NH2(SEQIDNO:14)、FRFKFRFK-NH2(SEQIDNO:15)、WRWKWRWK-NH2(SEQIDNO:16)、IRIKIRIK-NH2(SEQIDNO:17)、irikirik-NH2(SEQIDNO:18)和IRIkIrIK-NH2(SEQIDNO:19)，其中小写加下划线的残基表示D-氨基酸，而大写未加下划线的表示L-氨基酸。在一个示例中，如本文所述的肽当由通式X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5X6Y6(SEQIDNO:5)表示时，可包括但不限于VRVKVRVKVRVK-NH2(SEQIDNO:20)、IRIKIRIKIRIK-NH2(SEQIDNO:21)、IRVKIRVKIRVK-NH2(SEQIDNO:22)和irvkirvkirvk-NH2(SEQIDNO:23)，其中小写加下划线的残基表示D-氨基酸，而大写未加下划线的表示L-氨基酸。在一个示例中，如本文所述的肽可选自由以下组成的组：VRVKVRVK-NH2(SEQIDNO:11)、VRVKVRVKVRVK-NH2(SEQIDNO:20)、IRIRIRIR-NH2(SEQIDNO:12)、IKIKIKIK-NH2(SEQIDNO:13)、IRVKIRVK-NH2(SEQIDNO:14)、FRFKFRFK-NH2(SEQIDNO:15)、WRWKWRWK-NH2(SEQIDNO:16)、IRIKIRIK-NH2(SEQIDNO:17)、IRIKIRIKIRIK-NH2(SEQIDNO:21)、irikir-NH2(SEQIDNO:10)、irikirik-NH2(SEQIDNO:18)、IRIkIrIK-NH2(SEQIDNO:19)、IRVKIRVKIRVK-NH2(SEQIDNO:22)和irvkirvkirvk-NH2(SEQIDNO:23)，其中小写加下划线的残基表示D-氨基酸，而大写未加下划线的表示L-氨基酸。在另一方面，提供了用于治疗受试者的角膜炎的两亲性肽，其中所述肽包含：(X1Y1X2Y2)n(式I)，其中所述肽的C-末端被酰胺化；X1和X2彼此独立地是疏水性氨基酸；Y1和Y2彼此独立地为阳离子氨基酸；并且n为至少1.5，其中所述肽能够自组装成β-折叠结构。本公开的发明人发现如本公开中所公开的两亲性肽可用作广谱抗微生物剂，可用于治疗由微生物引起的角膜炎。如本文所用的术语“细菌或“微生物”以其最广泛的含义被使用，因此在范围上不限于原核生物体。而是，术语“微生物”在其范围内包括细菌、古细菌、病毒、酵母、真菌、原生动物和藻类。因此，在一个示例中，如本公开中所公开的角膜炎是真菌性角膜炎、病毒性角膜炎或细菌性角膜炎。在一个示例中，细菌可以是革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。因此，可被治疗的细菌感染包括但不限于由来自以下属的细菌引起的那些细菌感染：醋酸杆菌属(Acetobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、放线菌属(Actinomyces)、土壤杆菌属种(Agrobacteriumspp.)、根瘤菌属(Azorhizobium)、固氮菌属(Azotobacter)、红孢子虫属种(Anaplasmaspp.)、芽孢杆菌种(Bacillusspp.)、拟杆菌属种(Bacteroidesspp.)、巴尔通体属种(Bartonellaspp.)、博德特氏菌属种(Bordetellaspp.)、包柔氏螺旋体属(Borrelia)、布鲁氏菌属种(Brucellaspp.)、伯克霍尔德菌属种(Burkholderiaspp.)、鞘杆菌属(Calymmatobacterium)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、衣原体属种(Chlamydiaspp.)、嗜衣原体属种(Chlamydophilaspp.)、梭菌属种(Clostridiumspp.)、棒状杆菌属种(Corynebacteriumspp.)、柯克斯体属(Coxiella)、埃立克体属(Ehrlichia)、肠杆菌属(Enterobacter)、肠球菌属种(Enterococcusspp.)、埃希氏菌属(Escherichia)、弗朗西斯氏菌属(Francisella)、梭杆菌属(Fusobacterium)、加德纳菌属(Gardnerella)、嗜血杆菌属种(Haemophilusspp.)、螺杆菌属(Helicobacter)、克雷伯氏菌属、乳杆菌属种(Lactobacillusspp.)、乳球菌属(Lactococcus)、军团杆菌属(Legionella)、李斯特菌(Listeria)、扭脱甲烷杆菌(Methanobacteriumextroquens)、多形微杆菌属(Microbacteriummultiforme)、藤黄微球菌属(Micrococcusluteus)、卡他莫拉菌属(Moraxellacatarrhalis)、分枝杆菌种(Mycobacteriumspp.)、支原体属种(Mycoplasmaspp.)、奈瑟氏菌属种(Neisseriaspp.)、巴氏杆菌种(Pasteurellaspp.)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、根瘤菌属(Rhizobium)、立克次氏体种属(Rickettsiaspp.)、罗卡利马体属种(Rochalimaeaspp.)、罗氏菌属(Rothia)、沙门氏菌属种(Salmonellaspp.)、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏菌属(Shigella)、葡萄球菌属种(Staphylococcusspp.)、寡养单胞菌(Stenotrophomonas)、链球菌属种(Streptococcusspp.)、密螺旋体属种(Treponemaspp.)、弧菌属种(Vibriospp.)、沃尔巴克氏体属(Wolbachia)和耶尔森氏菌属(Yersiniaspp.)。在一个示例中，细菌可包括但不限于橙黄醋酸杆菌(Acetobacteraurantius)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)、衣氏放线菌(ActinomycesIsraelii)、放射形土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter)、根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobiumcaulinodans)、维氏固氮菌(Azotobactervinelandii)、嗜吞噬细胞无形体(Anaplasmaphagocytophilum)、边缘边虫(Anaplasmamarginale)、炭疽杆菌(Bacillusanthracis)、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)、梭形芽孢杆菌(Bacillusfusiformis)、地衣形芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、蕈状芽孢杆菌(Bacillusmycoides)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)、龈拟杆菌(Bacteroidesgingivalis)、产黑色素拟杆菌(Bacteroidesmelaminogenicus)(产黑色素普雷沃氏菌(Prevotellamelaminogenica))、汉赛巴尔通体(Bartonellahenselae)、五日热巴尔通体(BartonellaQuintana)、支气管炎博德特氏菌(Bordetellabronchiseptica)、百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)、伯氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)、流产布鲁氏菌(Brucellaabortus)、羊布鲁氏菌(Brucellamelitensis)、猪布鲁氏菌(Brucellasuis)、鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderiamallei)、类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderiapseudomallei)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderiacepacia)复合体、新洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderiacenocepacia)、肉芽肿荚膜杆菌(Calymmatobacteriumgranulomatis)、大肠弯曲杆菌(Campylobactercoli)、胎儿弯曲杆菌(Campylobacterfetus)、空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)、幽门弯曲杆菌(Campylobacterpylori)、沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)、嗜衣原体(Chlamydophila)(如肺炎嗜衣原体(C.pneumoniae)、鹦鹉热嗜衣原体(Chlamydophilapsittaci))、肉毒梭状芽胞杆菌(Clostridiumbotulinum)、艰难梭状芽胞杆菌(Clostridiumdifficile)、产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridiumperfringens)、破伤风梭状芽孢杆菌(Clostridiumtetani))、白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)、梭形棒状杆菌(Corynebacteriumfusiforme)、贝氏柯克斯体(Coxiellaburnetii)、查菲埃立克体(Ehrlichiachaffeensis)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、鸟肠球菌(Enterococcusavium)、耐久肠球菌(Enterococcusdurans)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)、莫洛特斯肠球菌(Enterococcusmaloratus)、大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)、土拉弗朗西斯菌(Francisellatularensis)、具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)、阴道加德纳氏菌(Gardnerellavaginalis)、杜克雷嗜血杆菌(Haemophilusducreyi)、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、副流感嗜血杆菌(Haemophilusparainfluenzae)、百日咳嗜血杆菌(Haemophiluspertussis)、阴道嗜血杆菌(Haemophilusvaginalis)、幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)、肺炎克雷伯氏菌、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、嗜肺军团杆菌(Legionellapneumophila)、单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、扭脱甲烷杆菌(Methanobacteriumextroquens)、多形微杆菌(Microbacteriummultiforme)、藤黄微球菌(Micrococcusluteus)、卡他莫拉菌(Moraxellacatarrhalis)、鸟分枝杆菌(Mycobacteriumavium)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、白喉分枝杆菌(Mycobacteriumdiphtheriae)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、麻风分枝杆菌(Mycobacteriumleprae)、鼠麻风分枝杆菌(Mycobacteriumlepraemurium)、草分枝杆菌(Mycobacteriumphlei)、耻垢分枝杆茵(Mycobacteriumsmegmatis)、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、发酵支原体(Mycoplasmafermentans)、生殖支原体(Mycoplasmagenitalium)、人型支原体(Mycoplasmahominis)、穿通支原体(Mycoplasmapenetrans)、肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae)、淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)、多杀巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)、土拉巴斯德氏菌(Pasteurellatularensis)、消化链球菌(Peptostreptococcus)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)、绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、放射状根瘤菌(RhizobiumRadiobacter)、普氏立克次氏体(Rickettsiaprowazekii)、鹦鹉热立克次氏体(Rickettsiapsittaci)、五日热立克次氏体(RickettsiaQuintana)、立氏立克次氏体(Rickettsiarickettsii)、沙眼立克次氏体(Rickettsiatrachomae)、亨氏罗卡利马氏体(Rochalimaeahenselae)、五日热罗卡利马氏体(RochalimaeaQuintana)、龋齿罗氏菌(Rothiadentocariosa)、肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)、伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、志贺氏痢疾杆菌(Shigelladysenteriae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、鸟链球菌(Streptococcus.Avium)、牛链球菌(Streptococcusbovis)、仓鼠链球菌(Streptococcuscricetus)、屎链球菌(Streptococcusfaceium)、粪链球菌(Streptococcusfaecalis)、野鼠链球菌(Streptococcusferus)、鹑鸡链球菌(Streptococcusgallinarum)、乳酸链球菌(Streptococcuslactis)、草绿色链球菌(Streptococcusmitior)、缓症链球菌(Streptococcusmitis)、变异链球菌(Streptococcusmutans)、口腔链球菌(Streptococcusoralis)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、大鼠链球菌(Streptococcusrattus)、唾液链球菌(Streptococcussalivarius)、血链球菌(Streptococcussanguis)、远缘链球菌(Streptococcussobrinus)、梅毒密螺旋体(Treponemapallidum)、齿垢密螺旋体(Treponemadenticola)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、逗号弧菌(Vibriocomma)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、创伤弧菌(Vibriovulnificus)、沃尔巴克氏体属、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersiniapestis)和假结核耶尔森氏菌(Yersiniapseudotuberculosis)。在一个示例中，细菌可包括但不限于大肠埃希氏菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌属种、肺炎克雷伯氏菌、鲍曼不动杆菌、绿脓假单胞菌和结核分枝杆菌。在一个示例中，细菌感染可引起以下诸如但不限于以下的病况：肺炎、结核病、脑膜炎、腹泻性疾病、生物膜形成、脓毒症、李斯特菌病、肠胃炎、中毒性休克综合征、出血性结肠炎；溶血性尿毒综合症、莱姆病、胃溃疡和十二指肠溃疡、人埃立克体病、伪膜性结肠炎、霍乱、沙门氏菌病、猫抓热、坏死性筋膜炎(GAS)、链球菌中毒性休克综合症、医院和社区相关的感染、动脉粥样硬化、婴儿瘁死综合症(SIDS)、耳部感染、呼吸道感染、尿路感染、皮肤和软组织感染、甲床感染、伤口感染、败血症、胃肠疾病、医院获得性心内膜炎和血流感染。在一个示例中，所述细菌可以是抗药性细菌。如本公开中所公开的两亲性肽可用于治疗可由绿脓假单胞菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌引起的细菌性角膜炎。在一个示例中，病毒传染性疾病可由病毒引起，包括但不限于由以下病毒引起的感染或传染性疾病：腺病毒、疱疫病毒、痘病毒、细小病毒、呼肠科病毒、小核糖核酸病毒、外衣病毒、正粘液病毒、弹状病毒、副粘液病毒、乳头瘤病毒、逆转录病毒(如人免疫缺陷病毒)和嗜肝病毒。在一个示例中，病毒传染性疾病可包括但不限于普通感冒、流感、水痘、唇疱疹、埃博拉、AIDS、禽流感、SARS、登革热、疱疹、带状疱疹、麻疹、腮腺炎、风疹、狂犬病、人乳头瘤病毒、病毒性肝炎、柯萨奇病毒、EB病毒等。如本公开中所公开的两亲性肽还可用于治疗可由水痘带状疱疹、腺病毒、单纯疱疹病毒-1(HSV-1)引起的病毒性角膜炎。如本文所用的术语“真菌”(和其衍生词，如“真菌感染”)包括但不限于，提及以下属的生物体(或生物体导致的感染)：犁头霉菌属(Absidia)、阿耶罗菌(Ajellomyces)、节皮菌属(Arthroderma)、曲霉菌属(Aspergillus)、芽生菌属(Blastomyces)、念珠菌属(Candida)、孢瓶霉属(Cladophialophora)、球孢子菌属(Coccidioides)、隐球菌属(Cryptococcus)、小克银汉霉属(Cunninghamella)、表皮癣菌属(Epidermophyton)、外瓶霉属(Exophiala)、线黑粉菌属(Filobasidiella)、着色真菌属(Fonsecaea)、镰刀菌(Fusarium)、地霉属(Geotrichum)、组织胞浆菌属(Histoplasma)、何德霉属(Hortaea)、伊萨酵母属(Issatschenkia)、马杜拉分枝菌属(Madurella)、马拉色霉菌属(Malassezia)、小孢子菌属(Microsporum)、微孢子虫属(Microsporidia)、毛霉菌属(Mucor)、丛赤壳菌属(Nectria)、拟青霉属(Paecilomyces)、副球孢子菌属(Paracoccidioides)、青霉菌属(Penicillium)、毕赤酵母属(Pichia)、肺囊虫属(Pneumocystis)、假阿利什菌属(Pseudallescheria)、根霉属(Rhizopus)、红酵母属(Rhodotorula)、赛多孢子菌属(Scedosporium)、裂褶菌属(Schizophyllum)、孢子丝菌(Sporothrix)、毛癣菌属(Trichophyton)和毛孢子菌属(Trichosporon)。例如，由诸如但不限于以下的种所引起的真菌感染：伞枝犁头霉(Absidiacorymbifera)、荚膜阿耶罗菌(Ajellomycescapsulatus)、皮炎芽生菌(Ajellomycesdermatitidis)、苯海姆节皮菌(Arthrodermabenhamiae)、粉节皮菌(Arthrodermafulvum)、石膏样节皮菌(Arthrodermagypseum)、内弯节皮菌(Arthrodermaincurvatum)、太田节皮菌(Arthrodermaotae)和万博节皮菌(Arthrodermavanbreuseghemii)、黄曲霉(Aspergillusflavus)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)和黑曲霉(Aspergillusniger)、皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitidis)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、光滑念珠菌(Candidaglabrata)、吉利蒙念珠菌(Candidaguilliermondii)、克柔念珠菌(Candidakrusei)、近平滑念珠菌(Candidaparapsilosis)、热带念珠菌(Candidatropicalis)和菌膜念珠菌(Candidapelliculosa)、卡氏枝孢霉(Cladophialophoracarrionii)、粗球孢子菌(Coccidioidesimmitis)和Coccidioidesposadasii、新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)、小克银汉霉属种(Cunninghamellasp.)、絮状表皮癣菌(Epidermophytonfloccosum)、皮炎外瓶霉(Exophialadermatitidis)、新型线黑粉菌(Filobasidiellaneoformans)、裴氏着色真菌(Fonsecaeapedrosoi)、腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)、白地霉(Geotrichumcandidum)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)、威尼克外瓶霉(Hortaeawerneckii)、东方伊萨酵母(Issatschenkiaorientalis)、灰色马杜拉菌(Madurellagrisae)、糠秕马拉色霉菌(Malasseziafurfur)、球形马拉色霉菌(Malasseziaglobosa)、钝形马拉色菌(Malasseziaobtusa)、厚皮马拉色霉菌(Malasseziapachydermatis)、限制性马拉色霉菌(Malasseziarestricta)、斯洛菲马拉色霉菌(Malasseziaslooffiae)、合轴马拉色霉菌(Malasseziasympodialis)、犬小孢子菌(Microsporumcanis)、粉小孢子菌(Microsporumfulvum)、石膏样小孢子菌(Microsporumgypseum)、微孢子虫属、卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)、红球丛赤壳(Nectriahaematococca)、宛氏拟青霉(Paecilomycesvariotii)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioidesbrasiliensis)、马尔尼菲青霉菌(Penicilliummarneffei)、异常毕赤酵母(Pichiaanomala)、季也蒙毕赤酵母(Pichiaguilliermondii)、耶氏肺孢子虫(Pneumocystisjiroveci)、卡氏肺孢子虫(Pneumocystiscarinii)、波氏假阿利什菌(Pseudallescheriaboydii)、米根霉(Rhizopusoryzae)、深红酵母(Rhodotorularubra)、尖端赛多孢子菌(Scedosporiumapiospermum)、裂褶菌(Schizophyllumcommune)、申克孢子丝菌(Sporothnxschenckii)、须毛癣菌(Trichophytonmentagrophytes)、红色毛癣菌(Trichophytonrubrum)、疣状毛癣菌(Trichophytonverrucosum)和紫色毛癣菌(Trichophytonviolaceum)和阿萨希毛孢子菌(Trichosporonasahii)、皮毛孢子菌(Trichosporoncutaneum)、墨汁毛孢子菌(Trichosporoninkin)和粘状毛孢子菌(Trichosporonmucoides)。在一个示例中，如本文所述的真菌感染可由白色念珠菌引起。在一个示例中，真菌感染可由抗药性真菌引起。表2和表4中提供了如本文所述的肽用于抑制、治疗或去除真菌的示例性用途。本公开的发明人还发现如本文所公开的两亲性肽可用于治疗可由丝状真菌和/或酵母样真菌引起的真菌性角膜炎。在一个示例中，酵母样真菌可以是白色念珠菌。在另一示例中，丝状真菌可包括黄曲霉、烟曲霉、镰刀菌(Fusariumspp.)、链格孢(Alternariaspp.)和淡紫色拟青霉(Paecilomyceslilacinus)。脓毒症是指全球范围内特护病房中的主要死亡原因，其由从革兰氏阴性细菌的外壁释放的脂多糖分子而引起。目前，除了静脉内施用广谱抗生素之外，仅给予支持疗法来防止脓毒性休克综合征的加重，而没有针对作为免疫应答的有害介质的微生物内毒素的有效疗法。多粘菌素B是内毒素结合和中和的“金”标准，然而，其高细胞毒性否定了其用于系统性应用的实用性。因此，需要提供可同时消灭致病微生物并中和内毒素且不具有针对哺乳动物细胞的细胞毒性活性的替代性抗微生物剂。因此，在一个示例中，本公开的肽可用于预防脓毒症。具有强效免疫刺激性质的脂多糖(LPS)内毒素是革兰氏阴性细菌的外膜叶的完整结构组分。LPS在微生物细胞生长和分裂期间不断流出，并且在细胞死亡(经常是由于针对细菌感染的抗生素治疗而引起)期间大量释放。在释放到血流中时，LPS聚集体被结合LPS的血浆蛋白质(LBP)解离而形成LPS-LBP复合物，其刺激宿主单核细胞和巨噬细胞分泌各种细胞因子(例如，TNF-α、IL-6、IL-8)和促炎性介质(例如，NO和活性氧物种)。先天免疫系统的活化引起级联放大的免疫应答，导致称为脓毒性休克的严重临床综合征，如果不治疗可快速地引起多器官衰竭或者则死亡。在多数革兰氏阴性细菌属中结构保守的阴离子两亲性脂质A结构域被公认为是LPS的活性部分。本公开的发明人证实，通过阳离子赖氨酸或精氨酸残基与阴离子头基的静电相互作用而结合并中和LPS，以及通过LPS的烷基链与非极性氨基酸侧链之间的疏水相互作用而解离LPS聚集体，如本文所述的阳离子抗微生物肽两亲物提供了特别有用的候选物。在一个示例中，提供了中和内毒素的方法，其包括施用药学有效量的本公开的肽。在一个示例中，内毒素可以是细菌内毒素或真菌内毒素。在一个示例中，内毒素可以是多糖、脂磷壁酸、脂多糖或脂寡糖。图9证实本公开的肽有效降低LPS对巨噬细胞的作用。细菌可对人造成的另一个问题是生物膜的形成。生物膜的形成是涉及各种医学领域和非医学领域的重大问题。当微生物细胞彼此粘附并嵌入表面上的细胞外聚合物质(EPS)的基质中时，出现生物膜。微生物在这种富含生物大分子(例如多糖、核酸和蛋白质)和营养物的受保护环境中生长使得微生物的交互作用增强以及使得微生物的毒力增加。因此，已经广泛地描述了特别是在截留在生物膜内的微生物的生长速率和基因转录模式方面的生理和表型改变。据认为抗生素不能穿过细胞外聚合物质和/或细胞外聚合物质的组分引起的抗生素失活是造成常规剂量的抗生素对抑制或杀死生物膜微生物无效的原因。该现象加上抗药性基因的上调经常导致生物膜中快速产生抗生素抗性，使得成功根除它们成为医疗环境中的巨大挑战。因此，需要提供去除生物膜的方法。鉴于以上原因，在另一方面，提供了去除生物膜的方法，其包括施用药学有效量的本公开的肽。在一个示例中，生物膜可存在于表面上。本文使用的术语“表面”是指提供流体如液体或空气和固体之间的界面的任何医学或工业表面。流体和固体之间的界面可以是间歇性的，并且可由流动或停滞的流体、气溶胶或用于经空气的流体暴露的其它方法引起。在一些示例中，表面是指其机械结构与细菌或真菌的粘附相容的平面。在本文所述的肽和方法的上下文中，术语“表面”涵盖各种一次性的和非一次性的、医疗的和非医疗的仪器和装置的内面和外面。非医疗应用的示例包括：船的船体、造船厂、食物加工器、混合器、机器、容器、水槽、滤水器、净化系统、食品行业中的防腐剂、个人护理用品如洗发水、面霜、润肤膏、洗手液、肥皂等。医疗用途的示例包括医疗装置的整个范围。此类“表面”可包括各种仪器和装置的内面和外面，不管所述仪器和装置为一次性的，还是用来重复使用。示例包括适用于医疗用途的物品的整个范围，包括：解剖刀、针、剪刀和用于侵入性手术、治疗或诊断程序的其他器械；植入式医疗装置，包括人工血管、导管和其他用于至患者的流体去除或递送的装置、人工心脏、人工肾、整形外科针、盘和移植物；导管和其它管(包括泌尿道和胆道导管、气管内套管、外周可插入式中心静脉导管、透析管、长期隧道式中心静脉导管、外周静脉导管、短期中心静脉导管、动脉导管、肺导管、气囊漂浮导管、泌尿导管、腹膜导管)、泌尿装置(包括长期泌尿装置、结合组织的泌尿装置、人工泌尿括约肌、泌尿扩张器)、分流器(包括心室或动脉-静脉分流器)；假体(包括乳房填充物、阴茎假体、血管移植物假体、心脏瓣膜、人造关节、人工喉、耳移植物)、血管导管口、伤口引流管、脑积水分流器、起搏器和可植入除颤器、牙种植体、填料、假牙等。对于这些领域的从业者来说，其它示例将是显而易见的。医疗环境中发现的表面还包括：医疗器械的零件、医疗保健环境中的人员穿戴或携带的医疗设备的内面和外面。此类表面可包括用于医疗程序或用于准备呼吸治疗中使用的医疗器械、导管和容器的区域中的案台和固定装置，所述呼吸治疗包括施用氧气、喷雾器中的溶解的药物和麻醉剂。还包括预期在医疗环境中作为传染性微生物的生物屏障如手套、围裙和面罩的那些表面。用于生物屏障的常用材料可以是基于乳胶的或非基于乳胶的。非基于乳胶的生物屏障材料的示例可包括乙烯基塑料。其他的此类表面可包括用于并非为无菌的医疗或牙科设备的手柄和电缆。另外，此类表面可包括通常会遇到血液或体液或其它有害生物材料的区域中发现的管和其它设备的那些非无菌的外表面。在一个示例中，在导管和医学植入物上可包含生物膜。在另一方面，提供了治疗受试者的角膜炎的方法，其包括施用药学有效量的本公开的肽。术语“处理”、“治疗(treatment)”和其语法变体是指治疗性治疗和预防性或防御性措施，其中目的是预防或减缓(减轻)不期望的生理病况、病症或疾病，或者获得有益的或期望的临床结果。此类有益或期望的临床结果包括但不限于症状的减轻，病况、病症或疾病的程度减小；病况、病症或疾病的稳定(即，不恶化)状态；病况、病症或疾病进展的延迟或减缓；病况、病症或疾病状态的改善；缓解(不论是部分的还是总体的)，不论是可检测的还是不可检测的；或者病况、病症或疾病的改进或改善。治疗包括诱发临床上显著且无过高水平副作用的细胞应答。治疗还包括，与不接受治疗时预期的存活相比，延长存活。鉴于以上原因，在另一方面，提供了从受试者的角膜中去除生物膜的方法，其包括施用药学有效量的本公开的肽。术语“降低”、“减少的”、“减少”、“降低”、“去除”或“抑制”在本文中全部通常用于意指降低了统计学上显著的量。然而，为了避免歧义，“减少的”、“减少”或“降低”、“去除”或“抑制”意指与参照水平相比降低至少10％，例如降低至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或多达100％并且包括降低100％(例如，与参照样品相比不存在的水平)，或者与参照水平相比10-100％的任何降低(例如，不存在如本文所述的肽)。本公开的发明人还发现如本文所述的肽可诱导癌细胞系的细胞死亡。因此，在另一方面，提供了治疗增殖性疾病的方法，其可包括施用药学有效量的如本文所述的肽。在一个示例中，增殖性疾病可包括但不限于肿瘤、癌症、恶性肿瘤或其组合。在一个示例中，增殖性疾病可包括但不限于结肠直肠癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管-内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、头颈鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、肝转移、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、甲状腺癌如甲状腺未分化癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、肺小细胞癌、肺非小细胞癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。图22中提供了如本文所述的肽用于诱导癌细胞死亡的示例性用途。在另一方面，提供了本公开的肽在制造用于治疗细菌感染、或去除细菌、或中和内毒素、或治疗基于病毒的传染性疾病、或治疗真菌感染或侵染、或去除真菌、或治疗增殖性疾病的药物中的用途。在一个示例中，所述用途可进一步包括提供用于施用给有需要的受试者的本公开的肽。在一个示例中，其中将向有需要的受试者施用所述药物待。在一个示例中，所述受试者或患者可以是动物、哺乳动物、人，包括但不限于动物，可分类为牛科、猪科、马科、犬科、狼科、猫科、鼠科、绵羊、鸟类、鱼类、山羊、鸦科、蛙科或海豚科。在一个示例中，患者可以是人。在一个示例中，如本文所述的肽可作为组合物或药物组合物提供。如本文所述的组合物可以多种方式施用，这取决于是期望局部治疗还是期望全身治疗。施用可以是局部的、肺部的(例如，通过吸入或吹入粉末或气溶胶，包括通过喷雾器；气管内、鼻内、表皮和透皮)或全身的，如口服和/或肠胃外。肠胃外施用包括：静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌肉内注射或输注；或颅内，例如，鞘内或脑室内施用。在一个示例中，施用途径可选自由全身施用、口服施用、静脉内施用和胃肠外施用组成的组。由于本公开涉及眼部角膜炎的治疗，因此在一个示例中，可施用所述组合物用于局部治疗。因此，在所述示例中，组合物可作为用于局部给药的组合物提供，如滴眼剂、霜剂、泡沫、凝胶、洗剂和软膏。由于本公开涉及眼部角膜炎的治疗，因此在一个示例中，可施用所述组合物用于局限或局部治疗。用于局部施用的组合物和制剂可包括无菌水溶液，其还可含有缓冲剂、稀释剂和其它合适的添加剂，诸如但不限于渗透促进剂、载体化合物和其它药学上可接受的载体或赋形剂。如本文所述的组合物包括但不限于溶液、糊剂、软膏、霜剂、水凝胶、乳液、含有脂质体的制剂、泡沫、滴眼剂和涂料。这些组合物可由各种组分产生，所述组分包括但不限于预成型液体、自乳化的固体和自乳化的半固体。可根据制药行业内熟知的常规技术制备可方便地以单位剂型呈现的如本文所述的制剂。此类技术包括将活性成分与药物载体或赋形剂结合的步骤。通常通过如下方式制备所述制剂：将活性成分与液体载体或磨碎的固体载体或二者均匀且紧密地结合，然后(如有必要)，使产品成形。可将如本文所述的组合物配制成许多可能的剂型中的任何一种，包括但不限于片剂、胶囊、液体糖浆、软凝胶、栓剂和灌肠剂。还可将如本文所述的组合物配制成水性介质、非水性介质或混合介质中的悬浮液。水性悬浮液可进一步含有增加悬浮液粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。所述悬浮液还可含有稳定剂。在一个示例中，可将所述药物组合物配制并用作泡沫。药物泡沫包括诸如但不限于乳剂、微乳剂、霜剂、凝胶剂和脂质体的制剂。虽然在性质上基本类似，但这些制剂在最终产品的组分和一致性上不同。如本文所述的组合物可另外含有药物组合物中常规发现的其它辅助组分。因此，例如，所述组合物可含有另外的相容的药物活性物质，例如止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂，或者可含有用于物理配制本发明的组合物的各种剂型的另外材料，如缓冲剂、染料、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂或其组合，所述材料适于与可以适用于滴眼剂的任何浓度添加到溶液中的药理活性剂一起使用。然而，在被添加时，此类材料不应过度干扰本公开的组合物的组分的生物活性。所述制剂可被灭菌，并且如果期望，可与不与所述制剂的肽有害地相互作用的助剂(润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味剂和/或芳香物质等)混合。如本文所用的术语“药学上有效量”在其含义内包括足够但无毒的量的如本文所述的化合物，用以提供预期效应，即使微生物数目的对数减少为至少1.0，这意味着10个微生物中留下小于1个。本公开的修饰肽可提供至少约2.0、或至少约3.0、或至少约4.0、或至少约5.0、或至少约6.0、或至少约7.0的微生物数目的的对数减少。所需的确切的量根据受试者不同而不同，这取决于诸如治疗的物种、受试者的年龄和总体状况、治疗的病况的严重性、施用的具体试剂、施用方式等因素。因此，不可能规定确切的“有效量”。然而，对于任何给定的情况，本领域普通技术人员仅使用常规实验即可确定适当的“有效量”。剂量取决于待治疗的疾病状态的严重性和响应性，治疗过程可持续几天至几个月，或者直到达到治愈或实现疾病状态的减轻。可由患者身体中的药物积累的测量来计算最佳的给药方案。施用医师可容易地确定最佳剂量、给药方法和重复频率。最佳的剂量可根据组合物的相对效力而变化，并且通常可基于在体外和体内动物模型中发现有效的EC50或基于本文所述的示例进行估算。通常，剂量为16mg/ml到5000mg/ml，并且可每天、每周、每月或每年给予一次或多次。在一个示例中，使用所得到的滴眼剂治疗或减轻眼部角膜炎症状的方案可包括每天3次向受影响的眼中滴滴眼剂，直到症状的严重性降低到可接受的水平。在特别严重的情况下，可能需要更频繁的施加，而在不太严重的情况下，单次日剂量可能是足够的。在一个示例中，所述组合物可以在以下的任一个之中的量施用：1mg、1.5mg、2mg、2.5mg、3mg、3.5mg、4mg、5mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg、16mg、17mg、18mg、19mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、75mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、550mg、600mg、650mg、700mg、750mg、800mg、850mg、900mg、950mg、1000mg、1050mg、1100mg、1150mg、1200mg、1250mg、1300mg、1350mg、1400mg、1450mg、1500mg、1550mg、1600mg、1650mg、1700mg、1750mg、1800mg、1850mg、1900mg、1950mg、2000mg、2050mg、2100mg、2150mg、2200mg、2250mg、2300mg、2350mg、2400mg、2450mg、2500mg、2550mg、2600mg、2650mg、2700mg、2750mg、2800mg、2850mg、2900mg、2950mg、3000mg、3050mg、3100mg、3150mg、3200mg、3250mg、3300mg、3350mg、3400mg、3450mg、3500mg、3550mg、3600mg、3650mg、3700mg、3750mg、3800mg、3850mg、3900mg、3950mg、4000mg、4050mg、4100mg、4150mg、4200mg、4250mg、4300mg、4350mg、4400mg、4450mg、4500mg、4550mg、4600mg、4650mg、4700mg、4750mg、4800mg、4850mg、4900mg、4950mg、5000mg/ml。在一个示例中，所施用的组合物的浓度为约1-约100mg/Kg患者体重、约5-约100mg/Kg患者体重、约10-约100mg/Kg患者体重、约20-约100mg/Kg患者体重、约30-约100mg/Kg患者体重、约1-约50mg/Kg患者体重、约5-约50mg/Kg患者体重和约10-约50mg/Kg患者体重。如本文所用的术语“约”在制剂的组分的浓度的背景下，通常意指所述值的+/-5％，更通常所述值的+/-4％，更通常所述值的+/-3％，更通常所述值的+/-2％，甚至更通常所述值的+/-1％，且甚至更通常所述值的+/-0.5％。本文所说明性地描述的发明可在不存在本文未明确公开的任何一种或多种要素、一种或多种限制的情况下被合适地实施。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应当被宽泛地解读并且没有限制。另外，本文所采用的术语和表达是以描述而非限制的术语被使用，并且使用这些术语和表达并不意在排除所显示和描述的特征或其部分的任何等同物，而应认识到可在所要求保护的发明范围内作出各种修改。因此，应当理解，虽然已经通过优选实施方案和任选特征具体地公开了本发明，但本领域技术人员可采用本文所公开的优选实施方案和任选特征中所体现的发明的修改和变更，并且认为此类修改和变更在本发明范围内。如本文所用的术语“基本上由……组成”是指给定实施例所需的那些元素。该术语允许存在不会实质上影响本发明的示例的基本和新颖或功能特征的另外要素。术语“由......组成”是指如本文所述的组合物、方法及其各自的组分，其不包括给定示例中未叙述的任何要素。本文已对本发明进行了宽泛的和一般性的描述。落入该一般公开的每个较窄的类和亚类的组合也构成本发明的一部分。这包括用将任何主题从一般性中去除的附带条件或负面限制来一般性地描述本发明，而不管被除去的内容是否在本文中明确述及。其它实施方案在以下权利要求书和非限制性实施例内。另外，在用马库什组描述本发明的特征或方面时，本领域技术人员将认识到，由此也是以马库什组的任何单个成员或成员亚组来描述本发明。实验部分实施例1本公开的肽(L-肽)的抗微生物性能的调查研究材料本研究中使用的肽由GLBiochem(中国上海)合成，并使用分析型反相(RP)-HPLC纯化到大于95％。采用α-氰基-4-羟基肉桂酸(4-HCCA)作为基质，使用基质辅助的激光解吸/电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOFMS，AutoflexII型，BrukerDaltonics公司，美国)进一步确认所述肽的分子量。4-HCCA购自Sigma-Aldrich(新加坡)，并在重新结晶后于饱和的乙腈/水(1:1体积比)中使用。磷酸盐缓冲盐水(10×PBS)购自1stBase(新加坡)，并在使用前稀释到所需浓度。Mueller-Hinton液体培养基II(MHBII)和酵母霉菌液体培养基(YMB)粉末购自BDDiagnostics(新加坡)，并根据制造商的说明书重新构建。从ATCC(美国)获得表皮葡萄球菌(ATCC编号12228)、金黄色葡萄球菌(ATCC编号29737)、大肠埃希氏菌(ATCC编号25922)、绿脓假单胞菌(ATCC编号9027)和酵母白色念珠菌(ATCC编号10231)，并根据推荐的方案培养。来自大肠埃希氏菌0111:B4的脂多糖(LPS)和FITC-缀合的LPS购自Sigma-Aldrich。从Promega(美国)获得格里斯(Griess)试剂系统并根据制造商的方案使用。圆二色(CD)光谱首先每种肽以0.5mg/mL-1溶解于单独的去离子(DI)水中或含有25mMSDS表面活性剂的去离子水中。使用具有1.0mm路径长度的石英小室，在室温下用CD分光偏振计(JASCOCorp.J-810)记录CD谱。，使用190-240nm的溶剂扣除以10nm/min扫描速度获得CD谱，并由每个肽样品的5次运行进行平均。使用以下方程式将获得的CD谱转化为平均残基椭圆率：其中θM是指平均残基椭圆率(deg·cm2·dmol-1),θobs是在给定波长下针对DI水校正的观察椭圆率(mdeg)，MRW是残基分子量(Mw/氨基酸残基数)，c是肽浓度(mg·mL-1)，并且l是路径长度(cm)。溶血测试用PBS25倍稀释新鲜的大鼠红细胞，以获得约4％(以体积计)悬浮液用于本实验。将300μL红细胞悬浮液添加到含有等体积(300μL)的PBS中的肽溶液的每个管中。在37℃培养所述管lh，然后以1000×g离心5min。将上清液的等分试样(100μL)转移到96孔板的每个孔中，并使用微板读数器(TECAN，瑞士)在576nm下针对血红蛋白释放分析等分试样。用PBS培养的红细胞悬浮液用作阴性对照。用0.1％v/vTritonX-100溶解的红细胞的吸光度用作阳性对照，并视为100％溶血。使用下式计算溶血百分比：溶血(％)＝[(处理样品的O.D.576nm-阴性对照的O.D.576nm)/(阳性对照的O.D.576nm-阴性对照的O.D.576nm)]×100。数据表示为4个重复的平均值±标准偏差。最小抑制浓度(MIC)测量使用液体培养基微量稀释法，针对革兰氏阳性表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌、革兰氏阴性大肠埃希氏菌和绿脓假单胞菌以及酵母白色念珠菌研究了聚合物的抗微生物活性。在300rpm的恒定振荡下在37℃在MHBII中培养细菌细胞，并且在300rpm的恒定振荡下在室温使酵母细胞在YMB中生长，以达到对数生长期中期。用适当的液体培养基稀释微生物悬浮液，并进行调整使得在微板读数器(TECAN，瑞士)上在600nm波长下的初始光密度(O.D.)读数为约0.07，其对应于McFarland标准1号(约3×108CFUmL-1)。肽溶解于经0.2μm过滤的HPLC级水中，并使用适当的液体培养液进行一系列的两倍稀释。将具有3×105CFUmL-1的初始加载水平的100μL微生物悬浮液添加到等体积(100μL)的肽溶液中，以获得3.9-500mgL-1范围的最终浓度，并且96孔板的每个孔中的水浓度固定在10％(以体积计)。细菌和酵母分别在37℃或室温振荡培养18h或42h后，MIC作为目视观察不到微生物生长并且从0h起O.D.读数没有变化的最低聚合物浓度。含有10％(以体积计)HPLC级水的液体培养基中的微生物细胞和单独的纯液体培养基中的微生物细胞用作阴性对照。为了确保无菌处理，在每个实验中都包括含有纯液体培养基且不含微生物的孔。在至少2个独立场合下每个测试进行6个重复。杀死效率的确定在0.5×MIC、MIC和2×MIC用不同浓度的肽处理微生物18h后，对各个样品进行一系列的10倍稀释，并平铺到LB琼脂板上。然后培养板过夜，并对菌落形成单位进行计数。含有用10体积％水处理的微生物的样品用作阴性对照。结果表示为Log(CFU/mL)和杀死％＝[(对照的细胞计数-聚合物处理的微生物的存活计数)/对照的细胞计数]×100。场发射-扫描电子显微镜(FE-SEM)成像在96孔板中，用含有20％(以体积计)水和致死剂量(250mgL-1)的代表性肽的等体积液体培养基培养约3×108CFUml-1(100μL)大肠埃希氏菌悬浮液2h。将每种条件的8个重复合并在微量离心管中，5000×g5min沉淀，并用PBS冲洗两次。然后在室温下用4％甲醛固定样品15min，随后用DI水冲洗。使用一系列梯度的乙醇溶液(35％、50％、75％、90％、95％和100％)进行细胞的脱水。对样品进行空气干燥，固定于碳桌上，并用钼进行溅涂以供使用FE-SEM设备(JEOLJSM-7400F，日本)进行成像。生物膜生长抑制和生物量测定将稀释到3×106CFUml-1的金黄色葡萄球菌的过夜培养物以每孔100μL的体积添加到96孔板的每个孔中，并在37℃、100rpm轻微振荡下使其粘附过夜。然后用100μLPBS冲洗孔一次，以去除浮游的细胞和松散附着的细胞，并补充100μL新鲜液体培养基。在用于实验前，使生物膜继续形成长达6-8天，每天进行冲洗并更换培养基。为了确定肽处理对生物膜中金黄色葡萄球菌的生活力的影响，在MIC、4×MIC和8×MIC水平下将100μL(IRIK)2-NH2(SEQIDNO:17)和(IRVK)3-NH2(SEQIDNO:22)溶液添加到每个孔中，并使其培养24h。随后，去除溶液，将120μL活化的XTT溶液添加到每个孔中。在培养4h后，将来自每个孔的100μL等分试样转移到新的96孔板中，以供使用微板读数器(TECAN，瑞士)分别测定在490nm测量波长和660nm参照波长下的吸光度。相对细胞活力表示为[(A490-A660)样品/(A490-A660)对照]×100％。数据表示为每个浓度4个重复的平均值土标准偏差。通过结晶紫染色法估算生物膜的生物量。简单地说，首先如上所述用所述肽处理形成的生物膜24h。在吸出培养基后，用PBS洗涤生物膜一次，在室温下用甲醇固定15min，并用100μL0.1％(体积重量比)结晶紫染色10min。通过用DI水冲洗孔5次来去除过量的结晶紫染料。使用每孔100μL33％冰乙酸提取与生物膜结合的染料，并通过使用微板读数器(TECAN，瑞士瑞士)测量570nm波长处的吸光度来进行定量。肽处理后残留的生物量的相对量表示为用含有10％(以体积计)水的液体培养基处理的对照的百分比。数据表示每个浓度4个重复的平均值±标准偏差。FITC-LPS结合测定在具有透明底部的黑色96孔板的每个孔中，用等体积的肽溶液(50μL)处理于PBS中的50μL1μg/mL-1FITC-LPS。在浓度递增的肽(3.9、7.8、15.6、31.3、62.5、125、250、500mgL-1)的存在下，在0h和2h，使用荧光微板读数器(TECAN，瑞士瑞士)，通过在480nm处激发FITC-LPS和监测在516nm处的FITC发射来研究肽与FITC-缀合的LPS的相互作用。含有10％体积水的100μLPBS作为空白被包含于其中。PBS中的100μLFITC-LPS(0.5μgmL-1)的荧光强度用作阴性对照。荧光强度的百分比变化按如下计算：％ΔF(AU)＝[((F样品-F空白)/(F对照-F空白))×100]–100。结果表示为4个重复的平均值±标准偏差。细胞培养大鼠巨噬细胞细胞系NR8383维持在补充有10％FBS、100UmL-1青霉素和100mgmL-1链霉素的FK15生长培养基中，并在37℃、5％CO2和95％湿润空气的气氛下培养。内毒素中和测定在96孔板的每个孔中，以4×104个的密度平铺NR8383细胞，并在肽存在(3.9、7.8、15.6、31.3、62.5、125、250、500mgL-1)或不存在下，用来自大肠埃希氏菌0111:B4的LPS(100ngmL-1)在37℃刺激18h。未处理的细胞和仅用LPS刺激的细胞分别用作阳性对照和阴性对照。根据制造商的方案，使用格里斯试剂(1％磺胺、0.1％N-1-萘基乙二胺二盐酸盐、5％磷酸)，通过对分离的上清液部分中稳定的NO代谢物亚硝酸盐的浓度进行定量来估算产生的NO的量。测量540nm处的吸光度，并使用从已知浓度的NaNO2溶液制备的标准参考曲线确定亚硝酸盐浓度。细胞毒性测试96孔板的每个孔以4×104个细胞的密度接种大鼠巨噬细胞细胞系NR8383，并在37℃用浓度递增的肽(3.9、7.8、15.6、31.3、62.5、125、250、500mgL-1)处理18h。随后，将20μL试剂添加到每个孔中，并再培养所述板4h。使用微板读数器测定在560nm激发波长和590nm发射波长处孔的荧光强度读数。含有不存在细胞的肽溶液的对照孔被包括在内以确定背景荧光。细胞活力％＝[(F处理的样品–F对应的背景)/(F10％水对照-F10％水对照背景)]×100。数据表示为4个重复的平均值±标准偏差。结果在本研究中，通过使极性面中的阳离子赖氨酸和/或精氨酸氨基酸和相对的非极性面中的各种疏水性氨基酸分离来设计含有8个或12个氨基酸残基的短的两亲性肽。通过MALDI-TOF质谱验证了合成的肽的分子量，并且将所观察到的分子量列在表1中。可以见到，实验确定的分子量与计算的质量接近一致，表明所述产物对应于所设计的序列。表1.合成的形成β-折叠的肽的设计和分子量表征[a]通过MALDI-TOFMS测量的，表观Mw＝[Mw+H]+在去离子水中，每种肽采用无规卷曲结构，其特征在于，由于质子化的赖氨酸和/或精氨酸残基之间的分子间静电排斥而在水溶液中在约195nm处具有最小值。然而，在模拟微生物膜的疏水环境(使用25mMSDS胶束溶液)中，合成的肽容易自组装成β-折叠二级结构，其特征CD谱显示在约200nm处的最大值且显示在约218nm处的最小值(图2)。针对临床相关微生物(包括革兰氏阳性表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌、革兰氏阴性大肠埃希氏菌和绿脓假单胞菌，以及酵母白色念珠菌)的代表性集合，测试了合成肽的抗微生物活性。如表2中所示，所设计的肽显示针对测试的微生物组的广谱抗微生物活性，其几何平均(GM)最小抑制浓度(MIC)范围为13.3-162.7mgL-1。总之，所有阳离子残基均为Arg的肽(IRIR)2-NH2(SEQIDNO:12)展现了最佳的抗微生物活性，其最低GMMIC值为13.3mgL-1。紧随其后的为(IRIK)2-NH2(SEQIDNO:17)和(IKIK)2-NH2(SEQIDNO:13)，其GMMIC值分别为23.4和38.3mgL-1。由这些结果可见，具有2个Arg和2个Lys残基的肽产生抗微生物效应，该抗微生物效应处于其4个Arg或4个Lys的相对物之间。被报道为具有高的形成β-折叠的倾向的非极性氨基酸，基于递增的疏水性程度和庞大程度同时保留2个Arg和2个Lys阳离子残基的组合而系统地变化(表1)。在包含Val、lie、Phe和Trp的肽中，(IRIK)2-NH2(SEQIDNO:17)显示了针对所测试的5种微生物的组最有效的抗微生物效应。用Val替代肽重复单元中的第二疏水性Ile残基以生成(IRVK)2-NH2(SEQIDNO:14)导致了抗微生物活性的轻微降低。该结果有力地表明，Ile残基为所观察到的强抗微生物效应所必需。使用含有Val和Ile的序列，研究了具有n＝3个重复单元的肽的生物效应。从表2中可见，(VRVK)3-NH2(SEQIDNO:20)显示了最佳的整体抗微生物效应，其次为(IRVK)3-NH2(SEQIDNO:22)和(IRIK)3-NH2(SEQIDNO:21)。与临床上使用的脂肽多粘菌素B相比，发现几种形成β-折叠的肽(包括(IRIR)2-NH2(SEQIDNO:12)、(IKIK)2-NH2(SEQIDNO:13)、(IRIK)2-NH2(SEQIDNO:17)和(VRVK)3-NH2(SEQIDNO:20))具有更广谱的抗微生物活性，如从它们较低的GMMIC值(13.3-34.6相对于41.4)所见。表2.合成的抗微生物肽的最小抑制浓度(MIC)和治疗指数[a]测试的5种微生物的MIC值的几何平均值(GM)。[b]溶血浓度10％(HC10)被定义为诱导≥10％溶血的最低肽浓度。[c]选择性指数(SI)以计算。[d]以2500除以250mgL-1计算。对于有资格作为合适的治疗候选物的形成β-折叠的肽，它们的抗微生物活性应当根据它们对微生物细胞膜的选择性加以考虑，以便使对哺乳动物细胞的毒性减到最小。如图3中所示，合成肽在各种MIC值下诱导最小的针对大鼠红细胞的溶血作用或无溶血作用。所述肽的选择性指数(SI)被进一步评估为，不同的肽序列的安全性和功效的比较(表2)。不同肽的SI以HC10值(定义为诱导10％或更多溶血的最低肽浓度)与GM(所测试的5种微生物菌株的几何平均MIC)的比值来计算。除了(IRIK)3-NH2(SEQIDNO:21)外，发现测试的所有肽均具有大于10的高SI，表明它们为适合外部应用和全身性应用于身体的具有高度吸引力的候选物。特别地，本公开显示(IRIK)2-NH2(SEQIDNO:17)中的Arg和Lys残基的组合使SI显著改善，单个阳离子氨基酸肽序列(IRIR)2-NH2(SEQIDNO:12)和(IKIK)2-NH2(SEQIDNO:13)的SI值分别从11.3和18.3增加到44.8的值。通过在小鼠中尾静脉静脉注射含有n＝2[(IRIK)2-NH2(SEQIDNO:17)]和n＝3[(IRVK)3-NH2(SEQIDNO:22)]重复单元的代表性肽的溶液进行急性体内毒性测试。选择前者是因为在具有n＝2个重复单元的肽中其具有更好的SI，而选择后者是因为在具有n＝3个重复单元的肽中其具有更好的抗微生物活性、选择性和内毒素中和性能(在下文讨论)。发现(IRIK)2-NH2(SEQIDNO:17)和(IRVK)3-NH2(SEQIDNO:22)分别具有致死剂量，50％(LD50；在特定测试时期后杀死50％的小鼠所需的剂量)值为35.2mg/kg。所设计的肽的LD50值与所报告的多粘菌素B(5.4g/kg)和短杆菌肽(1.5g/kg)的值有利地形成对比。为了阐明抗微生物机制，在用不同浓度的(IRIK)2-NH2(SEQIDNO:17)处理微生物的组后，进行了菌落计数实验。对于所测试的5种微生物中的每种，所述肽在各自MIC值实现了接近100％的杀死效率，因此支持杀细菌机制(图4)。在场-发射扫描电子显微镜(FE-SEM)下研究了以(IRIK)2-NH2(SEQIDNO:17)和(IRVK)3-NH2(SEQIDNO:22)处理后的大肠埃希氏菌的表面形态。如图5中所示，与用含有10％(以体积计)水的液体培养基处理的对照样品的相对光滑表面相比，用所述肽处理的大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌的表面看起来较粗糙且不均匀。该观察与文献中报道的各种天然存在和合成的AMP的膜溶解机制一致。与抑制微生物的生物合成途径中各种靶标的常规抗生素相比，由于发生赋予多重抗药性的突变的可能性降低，预期由所述肽引起的微生物细胞膜的物理破坏能在临床环境中提供固有的优势。抗生物膜能力接下来研究了合成的抗微生物肽对预先形成的生物膜的抗生物膜能力，这在本质上比防止生物膜形成更具挑战性。如图6中所示，肽(IRIK)2-NH2(SEQIDNO:17)和(IRVK)3-NH2(SEQIDNO:22)显示对生物膜中存在的金黄色葡萄球菌的剂量依赖性杀死。发现在3种浓度测试(P<0.01)中，(IRIK)2-NH2诱导显著更高水平的杀死，在4×MIC水平下细胞活力在24h内大幅下降到小于10％。为了确定以肽处理后残留的生物量的相对量，进行了生物膜的结晶紫染色和溶液化。与金黄色葡萄球菌细胞活力的降低一致，观察到在处理的生物膜中生物量的量以剂量依赖性方式降低(图7)。总之，这些结果直接证明，8个和12个氨基酸长度的肽在杀死生物膜中的微生物方面非常有效，并且能够有效介导生物膜基质的扩散。LPS和内毒素中和为了评估合成的肽结合和解离LPS聚集体的能力，将FITC-缀合的LPS与不同肽缀合，并监测2h内荧光强度的变化。在水溶液中，隐藏在LPS聚集体内的FITC显示出自淬灭，产生低荧光强度。相反，当FITC-LPS聚集体解离时，荧光由于去淬灭效应而增加。如图8a中所示，具有n＝2的形成β-折叠的肽似乎并未诱导FITC-LPS聚集体的可识别的破坏，如由在高达500mgL-1的肽浓度无荧光强度变化而证明。然而，具有3个重复单元的相应肽产生了FITC-LPS的荧光强度的强剂量依赖性增强(图8b)。在所述3种肽序列中(IRIK)3-NH2(SEQIDNO:21)和(IRVK)3-NH2(SEQIDNO:22)在较低浓度下诱导荧光强度的较大百分比改变，最后为(VRVK)3-NH2(SEQIDNO:20)。在大鼠巨噬细胞细胞系NR8383与100ngmL-1LPS和不同的肽共培养后，通过对细胞培养基中存在的稳定NO代谢物亚硝酸盐浓度进行定量来估算释放的促炎性氧化氮的量从而确定合成肽的内毒素中和能力。发现：与非肽处理的对照相比，所述肽甚至在15.6mgL-1的低肽浓度，能有效抑制LPS刺激的NO产生，显著降低亚硝酸盐浓度(图9)。各种肽介导的LPS中和程度的顺序为：(IRIK)3-NH2(SEQIDNO:21)>(IRVK)3-NH2(SEQIDNO:22)>(VRVK)3-NH2(SEQIDNO:20)，这与先前在FITC-LPS相互作用测定中观察到的趋势接近一致。重要的是，在125mgL-1的(IRIK)3-NH2(SEQIDNO:21)和(IRVK)3-NH2(SEQIDNO:22)下，亚硝酸盐浓度被降低到对照水平。针对NR8383细胞系进一步评估了所述肽的细胞毒性，并且发现分别在高达62.5mgL-1、125mgL-1和125mgL-1浓度的(VRVK)3-NH2(SEQIDNO:20)、(IRVK)3-NH2(SEQIDNO:22)和(IRIK)3-NH2(SEQIDNO:21)下细胞活力超过80％(图10)。这些结果确认，合成肽的良好抗炎性与它们对细胞活力的影响无关，并且所述肽在抗微生物和抗炎剂量下无细胞毒性，表明它们对于全身施用的适合性。尽管(IRIK)3-NH2(SEQIDNO:21)在3种肽中具有最强效的抗炎活性，但其相对较弱的抗微生物活性(GMMIC值＝162.7mgL-1)和较低的选择性指数(SI＝3.1)表明第二好的抗炎肽(IRVK)3-NH2(SEQIDNO:22)是用于安全且有效治疗血流感染的更合适的候选物，它具有低得多的几何平均MIC值(为47.3)和较高的选择性指数(为26.4)(表2)。在本公开中，本发明人基于天然β-折叠跨膜蛋白质中的两亲性二联体重复的普遍存在设计了一系列短的合成的β-折叠可折叠肽。所设计的β-折叠可折叠肽显示针对革兰氏阳性表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌、革兰氏阴性大肠埃希氏菌和绿脓假单胞菌以及酵母白色念珠菌的广谱抗微生物活性。发现n＝2和n＝3重复单元的最佳肽序列，即(IRIK)2-NH2(SEQIDNO:17)和(IRVK)3-NH2(SEQIDNO:22)，分别具有高选择性指数(44.8和26.4)。与临床上使用的多粘菌素B和短杆菌肽相比，小鼠中的急性体内毒性测试揭示了最佳合成肽的更高的静脉内LD50值。关于浮游微生物的高效杀死，还证实了合成的肽为生物膜中细菌生长的强效抑制剂。另外，用不同的肽处理生物膜导致生物量显著减少，表明所述肽可有效转运通过生物膜基质并引起生物膜基质的扩散。另外，具有3个重复单元的合成肽(包括(VRVK)3-NH2(SEQIDNO:20)、(IRVK)3-NH2(SEQIDNO:22)和(IRIK)3-NH2(SEQIDNO:21))显示了内毒素结合和中和能力，且在功能效应所需的浓度下诱导最小的毒性或无毒性。总之，我们的发现清楚地证实，合理设计的合成的β-折叠可折叠肽是高度选择性的并且具有用作广谱抗微生物剂的潜力，以克服众多基于细菌或真菌的传染性疾病相关的应用中多重抗药性的普遍问题，所述应用包括但不限于预防和根除在治疗上有挑战性的开放性伤口、导管或植入物上的生物膜以及中和微生物内毒素以改善血流感染的治疗。实施例2本公开的肽(D-肽)的抗微生物性能的调查研究材料本研究中使用的肽由GLBiochem(中国上海)合成，并使用分析型反相(RP)-HPLC纯化到大于95％。采用α-氰基-4-羟基肉桂酸(4-HCCA)作为基质，使用基质辅助的激光解吸/电离飞行时间质谱仪(MALDI-T0FMS，AutoflexII型，BrukerDaltonics公司，美国)进一步确认所述肽的分子量。4-HCCA购自Sigma-Aldrich(新加坡)，并在重新结晶后于饱和的乙腈/水(1:1体积比)中使用。磷酸盐缓冲盐水(10×PBS)购自1stBase(新加坡)并在使用前稀释至所需浓度。阳离子调节的Mueller-Hinton液体培养基II(MHBII)和酵母霉菌液体培养基(YMB)粉末购自BDDiagnostics(新加坡)，并根据制造商的说明书重新构建。从ATCC(美国)获得表皮葡萄球菌(ATCC编号12228)、金黄色葡萄球菌(ATCC编号6538)、大肠埃希氏菌(ATCC编号25922)、绿脓假单胞菌(ATCC编号9027)和酵母白色念珠菌(ATCC编号10231)，并根据推荐的方案培养。从Sigma-Aldrich获得环丙沙星、硫酸庆大霉素和青霉素G。圆二色(CD)光谱首先每种肽以0.5mg/mL-1溶解于单独的去离子(DI)水或含有25mMSDS表面活性剂的去离子水中。使用具有1.0mm路径长度的石英小室，在室温下用CD分光偏振计(JASC0Corp.J-810)记录CD谱。以10nmmin-1扫描速度，使用190-240nm的溶剂扣除获得CD谱，并对每个肽样品的5次运行进行平均。使用以下方程式将获得的CD谱转化为平均残基椭圆率：其中θM指平均残基椭圆率(degcm2dmol-1)，θobs是在给定波长下针对DI水校正的观察椭圆率(mdeg)，MRW是残基分子量(Mw·氨基酸残基数-1)，c是肽浓度(mgmL-1)，并且l是路径长度(cm)。最小抑制浓度(MIC)测量使用液体培养基微量稀释法，针对表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性)、大肠埃希氏菌和绿脓假单胞菌(革兰氏阴性)，以及白色念珠菌(酵母)，研究了形成β-折叠的肽的抗微生物活性。在实验之前，在300rpm的恒定振荡下在37℃在MHBII中培养细菌细胞，并且在300rpm的恒定振荡下在室温使酵母细胞在YMB中生长过夜，以达到对数生长期中期。用适当的液体培养基稀释微生物悬浮液，并进行调整使得在微板读数器(TECAN，瑞士)上在600nm波长下的初始光密度(O.D.)读数为约0.07。O.D.读数对应于麦氏标准1号(约3×108CFUmL-1)。肽溶解于HPLC级水中，并使用适当的液体培养液进行一系列的两倍稀释。随后，将具有3×105CFUmL-1的初始加载水平的100μL微生物悬浮液添加到等体积(100μL)的聚合物溶液中，以获得3.9-500mgL-1范围的最终聚合物浓度，并且96孔板的每个孔中的水含量固定在10％(以体积计)。在37℃或室温振荡培养18h或42h后，MIC作为目视观察不到微生物生长，并且从0h起O.D.读数没有变化的最低聚合物浓度。含有10％(以体积计)水的液体培养基以及仅纯液体培养基中的微生物细胞用作阴性对照。为了保证无菌处理，在每个实验中都包括含有纯液体培养基且不含微生物的孔。在至少2个独立场合下每个测试进行6个重复。杀死效率测试在用不同浓度的肽(0.5×MIC、MIC和2×MIC)处理微生物18h后，对各个样品进行一系列的10倍稀释，并平铺到LB琼脂板上。然后培养板过夜，并对菌落形成单位进行计数。含有用10％(以体积计)水处理的微生物的样品用作对照。结果表示为Log(CFU/mL)和杀灭％＝[(对照的细胞计数-肽处理的微生物的存活计数)/对照的细胞计数]×100。场发射-扫描电子(FE-SEM)显微镜分析在96孔板中，分别用等体积的含有最终浓度为10％(以体积计)的HPLC水或125mgL-1IK8-全部D的液体培养基培养约3×108CFUmL-1(100μL)的金黄色葡萄球菌和绿脓假单胞菌悬浮液，2h。将每种条件8个重复合并到微量离心管中，以4000rpm5min沉淀，并用PBS冲洗2次。然后在室温下用4％甲醛固定样品20min，随后用去离子水冲洗。使用一系列梯度的乙醇溶液(35％、50％、75％、90％、95％和100％)进行细胞的脱水。将样品固定在铜带上，进行空气干燥，并用钼进行溅涂，以供使用FE-SEM设备(JE0LJSM-7400F，日本)进行成像。溶血活性测试用RPMI164025倍稀释新鲜的兔红细胞×，以获得约4％(以体积计)的悬浮液用于本实验。将300μL红细胞悬浮液添加到含有等体积(300μL)的RPMI1640中的肽溶液的每个管中。在37℃培养所述管子lh，然后以1000×g离心5min。将上清液的等分试样(100μL)转移到96孔板的每个孔中，并使用微板读数器(TECAN，瑞士)在576nm下针对血红蛋白释放分析等分试样。用RPMI1640培养的红细胞悬浮液用作阴性对照。用0.1％v/vTritonX-100溶解的红细胞的吸光度用作阳性对照，并视为100％溶血。使用下式计算溶血百分比：溶血(％)＝[(处理样品的O.D.576nm-阴性对照的O.D.576nm/阳性对照的O.D.576nm-阴性对照的O.D.576nm)]×100。数据表示为4个重复的平均值±标准偏差。抗药性研究和针对抗药性细菌的抗微生物活性根据先前描述的液体培养基微量稀释法，用不同浓度的肽IK8-全部D以及临床上使用的环丙沙星、庆大霉素和青霉素G抗生素，重复处理大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌(3×105CFUmL-1的初始加载水平)多达20次传代。在每次传代的18h培养结束时，对细菌细胞(在特定世代的1/4MIC)进行传代培养，并使其生长到达到对数生长期中期，然后用于随后的MIC测试。通过记录每次传代的MIC的变化，即n次传代的MIC归一化为初始传代的MIC(MICn/MIC0)，可监测抗药性的产生。在本测定结束时，用不同浓度的IK8-全部D处理产生的抗环丙沙星和庆大霉素的大肠埃希氏菌培养物以确定其是否可以有效克服抗生素药物抗性。细胞培养小鼠肺泡巨噬细胞细胞系RAW264.7和人胎肺纤维母细胞WI-38细胞分别维持在补充有2mML-谷氨酰胺、1.5gL-1碳酸氢钠和10％FBS的DMEM和RPMI培养基中，并于37℃在5％CO2和95％湿润空气的气氛下培养。细胞内细菌杀死以12孔板的每个孔4×105的密度接种RAW264.7细胞。在过夜培养后，用13.3μL处理过的细菌(3.0×108CFUmL-1)感染细胞lh，以达到10:1的感染复数。然后用1×PBS冲洗细胞两次，并用含有50μgmL-1庆大霉素的lmL新鲜培养基培养45min，以清除细胞外细菌。去除每个孔中的培养基，并受感染细胞与含有10％(以体积计)水或不同浓度的IK8-全部D(2、3.9、7.8、15.6和31.3mgL-1)的新鲜培养基一起培养长达4h和8h。在各个时间点，使感染的细胞胰蛋白酶化，用PBS冲洗两次，并用800μL无菌水溶解，在室温下培养10min，然后超声处理5min。通过将连续稀释的培养物平铺到LB琼脂上并在24h后计数来确定细胞内细菌计数。细胞毒性测试分别以96孔板的每孔1.5×104和1×104的密度接种RAW264.7和WI-38细胞。在培养过夜后，用1.0-125mgL-1的IK8-全部D处理细胞48h。随后，将每个孔中的培养基替换成100μL生长培养基和10μLMTT溶液(5mg·ml-1于PBS中)，并根据制造商的说明在37℃培养细胞4h。在去除生长培养基后，使用150μLDMSO溶解每个孔中形成的合成甲臜晶体。然后将来自每个孔的100μL等分试样转移到新的96孔板中，以供使用微板分光光度计在550nm和690nm波长下测定吸光度。相对细胞活力表示为[(A550-A690)样品/(A550-A690)对照]×100％。数据表示为来自以每个浓度4个重复的两个独立实验的平均值±标准偏差。结果肽设计和表征上述实施例1描述了由天然存在的L-氨基酸构成的短的合成的形成β-折叠的肽的设计，并且证实了它们对临床相关微生物的广谱和高选择性的抗微生物活性。在本研究中，使用分别n＝1.5、2或3个重复单元的最佳的β-折叠可折叠肽(IRIK)2-NH2(SEQIDNO:17)(IK8-全部L)和(IRVK)3-NH2(SEQIDNO:22)(IK12-全部L)进行D-氨基酸的取代，所述肽在之前已针对抗微生物活性、选择性和内毒素中和性能进行了优化。所有设计的肽在C-末端均被酰胺化，以赋予高净正电荷用以增强抗微生物活性。如表3中所示，使用MALDI-TOF质谱确定的合成肽序列的观察分子量与理论值接近一致，表明产物与所设计的组成接近一致。表3.形成β-折叠的肽的设计和表征。[a]小写加下划线的残基表示D-氨基酸。[b]通过MALDI-TOFMS测量的，表观Mw＝[Mw+H]+使用CD谱在微生物膜模拟环境中研究了所设计的肽的二级结构形成。在25mMSDS胶束溶液中IK8-全部L和IK12-全部L容易自组装以形成β-折叠二级结构，如由约200nm处的特征性最大值和约218nm处的特征性最小值所证明(图11a和图11b)。相应的对映体异构体IK8-全部D和IK12-全部D是精确镜像，具有与它们的L-对应物的椭圆率相比大致等同但符号相反的椭圆率。有趣的是，在最佳的IK8-全部L序列中的第2、4、6、8(IK8-4D)位处的选择性D-氨基酸取代导致二级结构的完全丧失，而仅第4、6(IK8-2D)位处的取代使得能够保留形成β-折叠的倾向(图11c)。由于β-折叠形成受到给定肽中的侧链官能团之间的分子间氢键的控制，因此IK8-4D中包含大量的D-氨基酸可能影响肽结构内官能团的空间定位，导致邻近肽分子之间的相互作用丧失从而破坏β-折叠形成。形成β-折叠的序列IK8-全部L中阳离子氨基酸和疏水性氨基酸重排而产生对照肽(IIRK)2-NH2(对照-全部L；SEQIDNO:25)、(iirk)2-NH2(对照-全部D；SEQIDNO:26)和(IirK)2-NH2(对照-4D；SEQIDNO:275)(表3)导致二级结构的丧失；尽管所述分子的总电荷和疏水性保持不变，但在测试条件下它们以无规卷曲形式存在(图11d)。因此，该结果表明，所述氨基酸交替的疏水性和亲水性空间定位为在膜条件下β-折叠的形成所必需。如图18中所示，所设计的肽在去离子水中保持为无规卷曲形式，因此证实了各个形成β-折叠的肽对两亲性微生物膜模拟物的特异性。抗微生物活性和选择性针对一组临床相关的微生物，包括表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)、大肠埃希氏菌和绿脓假单胞菌(革兰氏阴性菌)以及白色念珠菌(酵母)，评估了所设计的肽的抗微生物活性。表4.合成的抗微生物肽的最小抑制浓度(MIC)和选择性指数[a]测试的5种微生物的MIC值的几何平均值(GM)。[b]溶血浓度10％(HC10)被定义为诱导≥10％溶血的最低肽浓度。[c]选择性指数(SI)以计算。[d]4种微生物的GMMIC值，所述肽具有针对这4种微生物的活性。[e]从125mgL-1开始RPMI1640培养基中发生的沉淀。从表4中可见，与形成非β-折叠的肽相比，不管立体化学如何，在微生物膜模拟条件下组装成β-折叠的肽序列显示了针对所有测试的微生物显著更强且更宽范围的活性(表4)。例如，不同的形成β-折叠的肽的几何平均(GM)最小抑制浓度(MIC)的范围为4.3-113.3mgL-1，而形成非β-折叠的对照肽和IK8-4D未表现出或表现出显著降低的抗微生物活性。因此，该观察证实，所设计的AMP自组装以形成β-折叠二级结构对它们的强抗微生物性能至关重要。该发现与文献报道一致，其中AMP的生物活性常常与形成二级结构时阳离子氨基酸残基与相对面上的疏水性氨基酸残基的分离而导致膜脂双层的破坏有关。有趣的是，为获得(IirK)2-NH2(对照-4D)选择性取代形成非β-折叠的IIRK基序(对照-均为L)的第2位和第3位的D-氨基酸部分地恢复了针对表皮葡萄球菌、大肠埃希氏菌、绿脓假单胞菌和白色念珠菌的抗微生物活性(表4)。特别地，针对大肠埃希氏菌的MIC值增加了约16倍，从>500mgL-1到31.3mgL-1。然而，该肽的抗微生物活性保持低于长度、电荷和疏水性相同的形成β-折叠的肽(即IK8-全部L或IK8-全部D)。另外，还发现用D-氨基酸取代显著改善了形成β-折叠的肽的抗微生物活性，而不论重复单元的数目(n＝2或3)或肽长度如何。该效果对于具有n＝2个重复单元的较短的IK8-全部D肽尤其显著，所述钛针对不同细菌的MIC值比其L-对映异构体低2-16倍。相比之下，与其相应的L-对映异构体相比，IK12-全部D介导了MIC值2-4倍降低，其具有增强的针对白色念珠菌的抗真菌活性。在不同的肽中，IK8-全部D显示出最有效的抗微生物活性，其针对不同类型的微生物具有非常低的几何平均(GM)MIC值(4.3mgL-1)，优于在相同的测试条件下针对临床上使用的脂肽抗生素多粘菌素B所获得的值(41.4mgL-1)。肽长度进一步减少至6个D-氨基酸(n＝1.5)导致抗微生物活性降低，其具有更高的GMMIC值(113.3mgL-1)，表明具有n＝2个重复单元的形成β-折叠的肽提供了最佳的抗微生物活性结构。使用4％(以体积计)兔血评估了合成肽的溶血活性。如先前所报道的，含有全部L-氨基酸的形成β-折叠的肽在MIC值下显示最小的溶血或无溶血，具有对于微生物膜的高选择性(也显示在图2和表2中)。在本发明的研究中，发现n＝2个重复单元的形成β-折叠的肽的对映异构体形式之间的溶血活性的差异很小，IK8-全部L和IK8-全部D分别具有高HC10值(2000mgL-1和1750mgL-1)(表4)。鉴于对先前观察到的抗微生物活性的极大改善，这些结果清楚地证实了，D-对映异构体对于阴离子微生物膜的选择性高于对于两性离子型哺乳动物细胞膜的选择性，IK8-全部D和IK12-全部D分别产生了非常高的SI(407.0mgL-1和>>9.8mgL-1)(表4)。总之，这些结果表明，n＝2的合成的形成β-折叠的肽的D-对映异构体(IK8-全部D)具有广谱和高选择性的抗微生物活性，可以作为用于治疗抗药性微生物感染的强治疗候选物。与它们差的抗微生物活性一致，形成非β-折叠的肽(对照-全部L和对照-全部D)在高达2500mgL-1下诱导最小溶血或无溶血(图12c)，表明与红细胞膜的同样弱相互作用。同样，D-氨基酸取代的形成非β-折叠的肽对照-4D显示出针对几种微生物的一定程度的抗微生物活性，也诱导最小溶血，因此产生高选择性指数(SI)(>23.3)(表4)。这些结果表明，在不存在二级结构形成的情况下，用D-氨基酸取代后获得的改变的肽构象仍然可以允许与某些微生物膜组成的适度的相互作用，而不会影响真核生物细胞膜(图11d)。对蛋白酶降解的抗性限制AMP的临床效用的主要因素之一在于它们不稳定而被大量存在于生物体液中和/或由微生物分泌的蛋白酶快速降解。为了评估所设计的形成β-折叠的肽的蛋白质水解稳定性，将n＝2的肽序列的D-异构体和L-异构体(分别为IK8-全部D或IK8-全部L)用广谱丝氨酸蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K处理6h，并评估它们对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌和绿脓假单胞菌的抗微生物活性。如图13中所见，在培养18h后，未处理的IK8-全部D和IK8-全部L有效抑制所有3种微生物的生长。然而，用蛋白酶处理IK8-全部L导致细菌抑制活性的完全丧失，表明其已被存在的蛋白酶降解。另一方面，IK8-全部D保留了其对各种微生物的抗细菌活性。还使用MALDI-TOF质谱评估了用两种蛋白酶处理后的合成肽的结构完整性。如从MALDI-TOF质谱所见，用两种蛋白酶处理IK8-全部L均导致完整肽的降解，产生多个较低分子量的峰(图19a)，因此解释了先前观察到的抗细菌活性的丧失。图19a中图解说明了两种酶对于IK8-全部L肽的切割位点，其中质谱峰被分配给主要片段。相反，IK8-全部D在蛋白酶处理后保持完整，没有观察到较低分子量的产物(图19b)。这种对酶降解的降低的敏感性，结合先前观察到的优良的抗微生物活性和选择性强烈地表明，IK8-全部D是用于治疗应用的有前景的候选物。膜溶解活性和抗药性缓解AMP的主要作用机制在于微生物膜的快速扰乱和破坏，导致细胞质内容物的渗漏和最终的细胞死亡。由于微生物修复大量的细胞膜损伤是非常具有挑战性的，因此已经提出了这种杀细菌作用模式以提供高度有吸引力的方式来预防和克服抗药性机制。本研究首次确定，与其L-对映异构体类似，IK8-全部D介导杀细菌作用机制，在本研究中测试的5种微生物中每种的各自MIC值下，导致存活菌落计数的大于3个对数降低(>99.9％杀死效率)(图14)。在FE-SEM下，与用含有10％(以体积计)水的液体培养基处理的各个对照的平滑表面相比，在用125mgL-1IK8-全部D短暂处理2h后，在革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性的绿脓假单胞菌的表面上，观察到显著的膜损伤和起皱(图15)。已知将微生物长时间重复暴露于非致死剂量的抗生素促进抗药性的获得。为了研究IK8-全部D介导的膜破坏是否能够充分地防止抗药性产生，将用亚MIC量AMP处理的大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌每天传代，并用于测定多达20次传代的MIC。在本研究中包括各种类别的临床上使用的抗生素(包括细胞壁合成抑制剂青霉素G、细菌拓扑异构酶抑制剂环丙沙星和蛋白质合成抑制剂硫酸庆大霉素)作为对照。如图16中所示，尽管用低剂量的所设计的AMP重复处理，但IK8-全部D针对大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌的MIC值仍然在3.9mgL-1(MICn/MIC0＝1)保持不变。用硫酸庆大霉素处理大肠埃希氏菌，最早在第2次传代时诱导抗药性，如从MIC值的加倍(MICn/MIC0＝2)所见，随后到第6次传代时增加到原始MIC值的4倍((MICn/MIC0＝4)(图16a)。环丙沙星介导稍微延迟的抗药性起始，第4次传代随后出现MIC加倍。随后到第7次传代时MIC值增加4倍，随后在实验结束时MIC值大幅增加32倍。对于金黄色葡萄球菌也观察到类似的趋势，早期获得抗药性且到第20次传代时对青霉素G的MIC和环丙沙星的MIC分别增加32倍和4倍(图16b)。总之，这些结果强烈地表明，由不同抗生素介导的各种抗微生物作用机制不同程度地影响它们的抗药性产生谱。值得注意的是，在实验过程中用合成的形成β-折叠的肽对大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌进行重复处理不诱导任何抗药性产生。除了能够防止抗药性产生外，用IK8-全部D处理来源于本实验的抗庆大霉素和环丙沙星的大肠埃希氏菌还揭示出，所述合成的肽以与野生型(非抗药性的)细菌中的浓度相同的浓度(即3.9mgL-1)有效抑制细菌生长(图20)。该结果有力地证明，形成β-折叠的肽的膜破坏能力可有效克服常规的抗生素抗性机制以抑制细菌生长。针对抗药性微生物的临床分离物进一步研究了所设计的形成β-折叠的肽的活性。如表5中所见，所设计的AMP显示了针对MRSA、VRE、多重抗药性鲍曼不动杆菌、绿脓假单胞菌和酵母新型隐球菌的广谱抗微生物活性。与先前观察到的结果一致，与其L-对映异构体相比，IK8-全部D诱导更强的抗细菌活性，其MBC降低4-8倍。另外，IK8-全部D、IK8-2D和IK12-全部L还显示针对临床上分离的结核分枝杆菌的极佳活性，其MIC范围为15.6-125mgL-1(表6)。表5.合成的抗微生物肽对临床上分离的抗药微生物的最小杀微生物浓度(MBC)。表6.合成的抗微生物肽对临床上分离的结核分枝杆菌的最小抑制浓度(MIC)。受感染的小鼠巨噬细胞中金黄色葡萄球菌的细胞内杀死肺泡巨噬细胞对微生物的吞噬，由于存活和保护细菌免受许多很少渗入细胞中的细胞外抗生素损害，可潜在地产生持续性感染的来源。金黄色葡萄球菌是可存活于肺泡巨噬细胞内的机会性病原体的临床相关示例，并且常常与社区和医院获得的肺感染病例有关。因此，接下来研究了合成的AMP根除细胞内金黄色葡萄球菌的能力。用不同剂量的IK8-全部D处理受感染的RAW264.7小鼠肺泡巨噬细胞4h和8h。如从图17中所见，当与用含有10％(以体积计)水(P<0.01)的培养基处理对照所获得的相比时，用IK8-全部D处理4h和8h后细胞内的金黄色葡萄球菌菌落计数显著降低。例如，当与对照相比时，所设计的肽在8h时有效地介导菌落计数的1.2-1.5对数降低(图17)。重要的是，发现由IK8-全部D介导的金黄色葡萄球菌的细胞内杀死独立于所述肽的细胞毒性，因为在杀细菌剂量观察到大于80％细胞活力(图21)。还在人胎肺纤维母细胞WI-38细胞系中研究了IK8-全部D的细胞毒性，并且显示在高达62.5mgL-1(远高于其抗微生物浓度)大于77％的细胞活力。总之，这些结果证实，除了在细胞外细菌杀死中的有效活性，所设计的形成β-折叠的肽还可有效进入受感染细胞，以降低细胞内细菌负载并产生最小的细胞毒性。实施例2研究了二级结构形成的重要性和立体化学对抗微生物活性和选择性的影响。证实在微生物膜模拟条件下合成肽自组装成β-折叠是其强抗微生物活性所必需的。在不同的肽中，IK8-全部D展现最强效的抗微生物活性，具有非常高的选择性指数(407.0)。在广谱蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K存在下，D-对映异构体还显示增加的稳定性。另外，IK8-全部D的膜溶解活性提供了有效方式来防止抗药性产生和有效地介导对不同的临床上分离的多重抗药性微生物的杀死。除了对细胞外微生物的效力外，合成的形成β-折叠的肽IK8-全部D还显示出对细胞内金黄色葡萄球菌的有效杀死。总之，这些结果显示，D-氨基酸取代的形成β-折叠的肽IK8-全部D，具有增强的抗微生物活性和改善的蛋白酶稳定性，可用于在各种临床应用中与抗生素抗性微生物对抗。实施例3本公开的肽的抗增殖性能的调查研究细胞培养人宫颈癌HeLa细胞系、人表皮纤维母细胞HDF细胞系和大鼠巨噬细胞NR8383细胞系分别维持在补充有10％FBS、100UmL-1青霉素和100mgmL-1链霉素的RPMI、DMEM和FK15生长培养基中，并在37℃、5％CO2和95％湿润空气的气氛下培养。细胞活力测试分别以96孔板的每个孔1×104、1×104和4×104个细胞的密度接种HeLa、HDF和NR8383细胞。在培养过夜后，用3.9-500mgL-1(IRIK)3-NH2(SEQIDNO:21)和(VRVK)3-NH2(SEQIDNO:20)处理细胞24h。对于粘附的HeLa和HDF细胞系，将每个孔中的培养基替换成100μL生长培养基和10μLMTT溶液(于PBS中5mg·ml-1)。根据制造商的说明，在37℃进一步培养细胞4h。在去除生长培养基后，使用150μLDMSO溶解每个孔中形成的合成甲臜晶体。然后将来自每个孔的100μL等分试样转移到新的96孔板中，以供使用微板分光光度计在550nm和690nm波长下测定吸光度。相对细胞活力表示为[(A550-A690)样品/(A550-A690)对照]×100％。数据表示为来自每个浓度进行4个重复的两个独立实验的平均值±标准偏差。对于半粘附的NR8383细胞，在处理后将20μL的试剂添加到每个孔中，并再培养所述板4h。使用微板读数器在560nm激发波长和590nm发射波长处测定孔的荧光强度读数。含有不存在细胞的肽溶液的对照孔被包括在内以确定背景荧光。＝[(F处理的样品–F对应的背景)/(F10％水对照-F10％水对照背景)]×100。数据表示为4个重复的平均值±标准偏差。结果如从图22中所见，用(IRIK)3-NH2(SEQIDNO:21)处理HeLa宫颈癌细胞系导致细胞活力从125mg/L开始浓度依赖性地降低到小于70％。另一方面，大于80％的非癌性HDF和NR8383细胞在125mg/L下存活。类似地，用(VRVK)3-NH2(SEQIDNO:20)处理HeLa细胞导致在250mg/L下仅30％细胞活力，而HDF和NR8383细胞具有大于53％细胞活力。因此，这些结果证实，与正常细胞膜相比，形成β-折叠的肽对带有更多阴离子电荷的癌细胞膜具有更大的选择性。实施例4本公开的肽对角膜炎的效果的调查研究材料和方法肽表征本研究中使用的肽由GLBiochem(中国上海)合成，并使用分析型反相(RP)-HPLC纯化到大于95％。采用α-氰基-4-羟基肉桂酸(4-HCCA)作为基质，使用基质辅助的激光解吸/电离飞行时间质谱仪(MALDI-T0FMS，AutoflexII型，BrukerDaltonics公司，美国)进一步确认所述肽的分子量。4-HCCA购自Sigma-Aldrich(新加坡)，并在重新结晶后于饱和的乙腈/水(1:1体积比)中使用。磷酸盐缓冲盐水(10×PBS)购自1stBase(新加坡)，并在使用前稀释到所需浓度。Mueller-Hinton液体培养基II(MHBII)和酵母霉菌液体培养基(YMB)粉末购自BDDiagnostics(新加坡)，并根据制造商的说明书重新构建。从ATCC(美国)获得表皮葡萄球菌(ATCC编号12228)、金黄色葡萄球菌(ATCC编号29737)、大肠埃希氏菌(ATCC编号25922)、绿脓假单胞菌(ATCC编号9027)和酵母白色念珠菌(ATCC编号10231)，并根据推荐的方案培养。来自大肠埃希氏菌0111:B4的脂多糖(LPS)和FITC-缀合的LPS购自Sigma-Aldrich。从Promega(美国)获得格里斯试剂系统并根据制造商的方案使用。最小抑制浓度(MIC)的测定通过液体培养基微量稀释法，针对真菌白色念珠菌(美国典型培养物保藏中心，ATCC)和腐皮镰刀菌(ATCC)确定肽的MIC。在室温、300rpm的恒定振荡下白色念珠菌在酵母霉菌液体培养基(YMB)中生长，以达到对数生长期中期。用适当的液体培养基稀释微生物悬浮液，并进行调整使得在微板读数器(TECAN，瑞士)上在600nm波长下的初始光密度(O.D.)读数为约0.07，其对应于麦氏标准1号(约3×108CFUmL-1)。肽溶解于经0.2μm过滤的HPLC级水中，并使用适当的液体培养液进行一系列的两倍稀释。将具有3×105CFUmL-1的初始加载水平的100μL微生物悬浮液添加到等体积(100μL)的肽溶液中，以获得3.9-500mgL-1范围的终浓度，并且96孔板的每个孔中的水浓度固定在10％(以体积计)。在室温下振荡培养42h后，MIC作为目视观察不到微生物生长的最低肽浓度。含有10％(以体积计)HPLC级水的液体培养基以及单独的纯液体培养基中的酵母细胞用作阴性对照。在培养器中在37℃在沙氏(sabouraud)右旋糖琼脂板上培养腐皮镰刀菌。为了在培养后收集分生孢子，在进行实验之前收获腐皮镰刀菌种的分生孢子并且标准化为1×108个孢子/ml。将沙氏右旋糖液体培养基(90μL)添加到培养板的孔中。通过2倍稀释法在孔中制备不同浓度的肽，并且用含有1×106个孢子的10μL孢子悬浮液接种这些孔。板在37℃培养并在24h后肉眼检查腐皮镰刀菌的生长。在所述研究中包括没有任何处理的适当的对照孔。如果孔表现为透明的，没有任何可见的腐皮镰刀菌生长，则认为肽是有活性的，并结果表示为MIC。对于每个浓度以4个重复进行测定。体外杀死动力学进行杀死动力学测试以评估肽对白色念珠菌的抗微生物活性。酵母溶液重悬于YMB(Difco)中以实现105-106CFUmL-1。将初始接种物暴露于浓度为1×MIC、2×MIC和4×MIC的肽1达0h、1h、2h、4h和24h，并且在这些时间点，以不同的稀释系数稀释样品。每个稀释物(20μL)平铺在琼脂板上并培养2天。培养后对存活的菌落计数。未处理的接种物组用作阴性对照。以一式三份进行测试，结果表示为杀死效率(％)。稳定性测试肽1和肽2以2mg/mL溶解在HPLC级水中，在121℃进行标准蒸汽灭菌高压釜循环15min，并且在室温下放置6周的一段时间。肽的完整性通过在处理之前和处理之后经由MALDI-TOFMS评估它们的分子量来确定。对白色念珠菌生物膜的抗真菌研究(体外角膜炎治疗模型)白色念珠菌用作用于测试肽1的抗真菌功能的代表性真菌。使用-80℃冷冻储备培养物由YMB中的新鲜过夜培养物制备白色念珠菌悬浮液。这些培养物的子样品再生长3h，并调节到在600nm下的光密度为约0.1，密度为107–108CFU/mL。体外白色念珠菌生物膜的制备稀释到3×106CFUml-1白色念珠菌的过夜培养物以每孔100μL体积添加到96孔板的每个孔中，并在37℃、100rpm轻微振荡下使其粘附5h。然后用100μLPBS冲洗孔一次以去除浮游的细胞和松散附着的细胞，并补充100μL新鲜液体培养基。在实验前使生物膜形成持续长达2天且每天进行冲洗并更换培养基。生物膜敏感性为了确定肽处理对生物膜中的白色念珠菌的活力的影响，将100μL不同浓度的肽1溶液添加到每个孔中，并培养24h。随后，去除溶液，用100μLPBS漂洗一次，然后将120μL活化的XTT溶液添加到每个孔中。在培养4h后，将来自每个孔的90μL等分试样转移到新的96孔板中，以供使用微板读数器(TECAN，瑞士)分别在490nm测量波长和660nm参照波长下测定吸光度。用含有10vol％水的液体培养基处理的生物膜用作对照。相对细胞活力表示为[(A490-A660)样品/(A490-A660)对照]×100％。数据表示为每个浓度的4个重复的平均值±标准偏差。生物量测定通过结晶紫染色法估算生物膜的生物量。简单地说，首先如上所述用所述肽处理形成的生物膜24h。在吸出培养基后，用PBS将生物膜冲洗一次，在室温下用甲醇固定15min，并用100μL0.1％(体积重量比)结晶紫染色10min。通过用DI水冲洗孔5次来去除过量的结晶紫染料。使用每孔100μL33％冰乙酸提取与生物膜结合的染料，并将来自每个孔的60-μL等分试样转移到新的94孔板中，以供使用微板读数器(TECAN，瑞士)在570nm波长下定量吸光度。肽处理后残留的生物量的相对量表示为用含有10vol％水的液体培养基处理的对照的百分比。数据表示每个浓度4个重复的平均值±标准偏差。对生物膜的扫描电子显微镜研究使用在4.0-6.0keV加速电压下操作的场发射扫描电子显微镜(FESEM)(JEOLJSM-7400F)观察用肽1处理的白色念珠菌生物膜的形态。白色念珠菌生物膜与1000mg/L的肽一起培养24h。用PBS洗涤三次，然后在含有2.5％戊二醛的PBS中固定过夜。用DI水进一步洗涤细胞，并使用一系列乙醇洗涤脱水。将几滴悬浮液置于铜带上，并在室温下干燥。在FESEM分析之前用铂涂覆样品。体内小鼠角膜炎治疗模型小鼠来源成年C57BL/6小鼠(8周龄，18-22g)用于动物研究。在开始实验之前检查所有小鼠眼不存在眼部病变。实验方案由新加坡科技研究局(A*STAR)的生物资源中心的机构动物管理和使用委员会批准。所述肽的体内毒性评估在小鼠眼中测试所述肽。在第一个小时期间每5min以3000mg/L剂量向小鼠施用所述肽并且在接下来的7h期间每30min以3000mg/L剂量向小鼠施用所述肽。在暂停16h后，以每小时间隔再施用滴眼剂8h。在施用最后一次滴眼剂后16h处死所有小鼠。立即收集处理的眼球。将固定的眼球包埋在石蜡中，进行切片并通过标准方案用苏木精和曙红染色。隐形眼镜相关性角膜炎模型用于本研究的LotrafilconA隐形眼镜购自CIBAVision，焦度为+1.50屈光度。用PBS洗涤隐形眼镜，并将其浸入YMB中过夜，然后将其冲压成直径为2mm的较小片。为了使白色念珠菌生物膜生长，将透镜置于具有4mL酵母悬浮液(107CFU/mL)的6孔组织培养板中，并且在22℃培养3h。用PBS轻轻地洗涤隐形眼镜以去除未粘附的酵母细胞，并在22℃、100rpm振荡下浸入YMB中48h。通过采用隐形眼镜生物膜感染来建立黑色小鼠角膜炎模型(如以下文献中所述：GoldblumD,FruehBE,SarraGM,KatsoulisK,ZimmerliS.TopicalcaspofunginfortreatmentofkeratitiscausedbyCandidaalbicansinarabbitmodel.AntimicrobAgentsChemother2005；49:1359-63；LiP,PoonYF,LiW,ZhuHY,YeapSH,CaoY等人，Apolycationicantimicrobialandbiocompatiblehydrogelwithmicrobemembranesuctioningability.NatMater2011；10:149-56；PrakashG,SharmaN,GoelM,TitiyalJS,VajpayeeRB.Evaluationofintrastromalinjectionofvoriconazoleasatherapeuticadjunctiveforthemanagementofdeeprecalcitrantfungalkeratitis.AmJOphthalmol2008；146:56-9；和SunY,ChandraJ,MukherjeeP,Szczotka-FlynnL,GhannoumMA,PearlmanE.Amurinemodelofcontactlens-associatedfusariumkeratitis.InvestOphthalmolVisSci2010；51:1511-6)。经由腹膜内注射(I.P.)氯胺酮(150mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/mL)麻醉小鼠。还施用了0.5％盐酸丁卡因滴眼剂(Bausch&Lomb，Tampa，Florida)形式的另外的局部麻醉剂。在本研究中使用总共29只小鼠。用99％1-庚醇(Sigma-Aldrich，Lausanne，瑞士)润湿的1mm滤纸盘放置在角膜的中心上40s。创伤性地擦除角膜上皮，并用PBS冲洗眼以去除任何残留的痕量的1-庚醇。然后将来自具有白色念珠菌生物膜的隐形眼镜的2mm直径冲压物放置在裸露的角膜表面上。用丝线使眼睑闭合而将隐形眼镜保持在眼内。在接种后18h白色念珠菌细胞在眼球上生长；观察到具有坚韧的革质凸起表面的眼溃疡。建立了从0(无疾病)到4(严重疾病)的疾病分级用以评估治疗功效(表7)。通过皮下注射环磷酰胺(Sigma-Aldrich，180g/kg)使小鼠免疫抑制。表7.用于体内角膜炎治疗的临床分级和评分。使用肽的角膜炎治疗功效的评估用4种局部滴眼剂溶液随机处理动物：水溶液(对照)、3000mg/L肽1、3000mg/L肽2以及1000mg/L两性霉素B。在第一个小时期间每5min向小鼠施用滴眼剂(各20μl)并且在接下来的7h期间每30min向小鼠施用滴眼剂(各20μl)。在暂停16h后，以每小时间隔再施用滴眼液8h。在施用最后一次滴眼剂后16h处死所有小鼠。立即收集处理的眼球。收集来自每组的3个眼球用于组织学研究，并且将剩余的6个眼球匀质化用于定量的真菌回收研究。将固定的眼球包埋在石蜡中，进行切片并通过标准方案用Grocott乌洛托品银染色。结果与形成非β-折叠的肽(IIRK)2–NH2(即肽3)相比，研究了形成β-折叠的肽(IKIK)2–NH2(即肽1)和肽(IRIK)2–NH2(即肽2)针对角膜炎相关真菌(包括白色念珠菌和腐皮镰刀菌)的活性。如从表8所见，所设计的形成β-折叠的肽1和肽2显示出强抗真菌活性，其针对白色念珠菌的MIC范围为2-3.9mg/L，其针对腐皮镰刀菌的MIC为31.3mg/L。相比之下，形成非β-折叠的肽3针对白色念珠菌仅显示出适中的活性，具有明显更高的MIC(>500mg/L)，并且发现其针对腐皮镰刀菌根本无效。该结果证实，在与微生物膜相互作用之上形成β-折叠二级结构对于所设计的肽的抗真菌作用是重要的。由于对白色念珠菌的优异活性，因此用肽1进行了杀死动力学研究。如图23中所示，在MIC水平下处理2h后，白色念珠菌细胞的数量显著减少。在MIC下4h后以及在2×MIC和4×MIC下1h后大多数真菌被杀死。这些结果表明时间和剂量依赖性杀真菌作用机制；越高浓度的肽在越短的时段内有效地根除所有真菌。表8.抗微生物肽的最小抑制浓度(MIC)MIC(mg/L)白色念珠菌腐皮镰刀菌(IKIK)22.031.3(IRIK)23.931.3(IIRK)2>500>500大多数抗真菌剂对真菌性角膜炎无效，因为真菌性角膜炎感染经常作为生物膜存在，其中真菌细胞附着在一起并被封闭在自产的ECM内。肽1用于处理体外生长的白色念珠菌生物膜。如图24A中所示，在500mg/L单个肽处理后24h内90％细胞被杀死。在相同的肽浓度下处理后，白色念珠菌生物膜的生物量显著降低(图24B)。肽浓度增加导致生物量的进一步降低。另外，SEM研究进一步证实，在1000mg/L肽处理24h后，白色念珠菌细胞的形态变形，并且生物量显著降低(图25)。另外，测试了肽1的稳定性。肽1溶液被高压蒸汽灭菌，并且在没有任何避光保护的情况下在室温下保持6周。肽1的分子量保持不变且没有观察到降解产物，证实所述肽可通过高压蒸汽灭菌来灭菌，并且在水中是稳定的。在小鼠眼中评估肽1和肽2(各3000mg/L)的毒性。在局部施用所述肽后角膜的组织学图像未显示角膜上皮侵蚀的显著迹象，并且施加高浓度的肽未导致基础基质的明显病理变化(图26)。总之，这些结果证实，肽1和肽2具有针对浮游性角膜炎相关真菌和它们的生物膜的高效力，以及极佳的稳定性。另外，它们在用作滴眼剂时对眼无毒。为了研究肽在真菌角膜炎治疗中的潜在应用，在小鼠中建立了白色念珠菌角膜炎模型。首先在用于生物膜形成的隐形眼镜上培养白色念珠菌。然后将含有白色念珠菌生物膜层的隐形眼镜转移到小鼠的脱上皮的角膜的表面上。在18h接种后，白色念珠菌生物膜感染角膜，导致形成具有坚韧的革质凸起表面的眼溃疡。肽1溶液(3000mg/L)、肽2溶液(3000mg/L)、两性霉素B(1000mg/L)和水(对照)作为滴眼剂以20μL量局部施加在角膜的表面上。与对照组相比，在处理后观察到角膜炎感染的显著消退，角膜变得更透明并且虹膜可见。所述肽的治疗功效与两性霉素B的治疗功效相当(图27)。根据临床标准评估治疗前和治疗后真菌性角膜炎的临床评分。如图28中所示，所有治疗组中小鼠角膜的临床评分均显著低于对照组。另外，处理的眼球被固定并用过碘酸-希夫(PAS)染色。在对照组中，真菌菌丝延伸到角膜基质中，而用肽1、肽2和两性霉素B的处理减小了菌丝侵入角膜的最大深度(图29)。组织学研究进一步验证用所述肽和两性霉素B的处理显著降低真菌在患有角膜炎的角膜中的浸润。为了对处理的眼球中的真菌计数进行定量，将处理的眼球匀质化，并通过琼脂铺板确定每只眼球中白色念珠细胞的数目。所述肽在减少眼球中白色念珠菌菌落的数目方面与两性霉素B一样有效，并且与未处理的对照组相比，约90％的真菌细胞在处理后从生物膜中被从根除(图30)。总之，这些合成的形成β-折叠的肽在根除小鼠眼中的固着性角膜炎相关真菌和它们的生物膜方面是有效的。因此，在本公开中，本公开的发明人已证实，形成β-折叠的肽具有强的抗真菌活性，并且能够去除在体外和真菌生物膜诱导的角膜炎小鼠模型中形成的真菌生物膜且不会引起对眼的显著毒性。所述肽是水溶性的，并且在高压蒸汽灭菌程序中是稳定的。它们是用于治疗真菌性角膜炎的有用的抗真菌剂。168386PCT-CN-ELLA序列表<110>新加坡科技研究局<120>肽和其用途<130>9869SG2451<160>27<170>PatentInversion3.5<210>1<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>n为1<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>为阳离子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>为阳离子氨基酸<400>1XaaXaaXaaXaa1<210>2<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>n为1.5<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>为阳离子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>为阳离子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(5)..(5)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>为阳离子氨基酸<400>2XaaXaaXaaXaaXaaXaa15<210>3<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>n为2<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>为阳离子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>为阳离子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(5)..(5)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>为阳离子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(7)..(7)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(8)..(8)<223>为阳离子氨基酸<400>3XaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaa15<210>4<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>n为2.5<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>为阳离子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>为阳离子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(5)..(5)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>为阳离子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(7)..(7)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(8)..(8)<223>为阳离子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(9)..(9)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>为阳离子氨基酸<400>4XaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaa1510<210>5<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>n为3<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>为阳离子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>为阳离子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(5)..(5)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>为阳离子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(7)..(7)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(8)..(8)<223>为阳离子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(9)..(9)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>为阳离子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(11)..(11)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(12)..(12)<223>为阳离子氨基酸<400>5XaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaa1510<210>6<211>14<212>PRT<213>人工序列<220><223>n为3.5<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>为阳离子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>为阳离子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(5)..(5)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>为阳离子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(7)..(7)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(8)..(8)<223>为阳离子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(9)..(9)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>为阳离子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(11)..(11)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(12)..(12)<223>为阳离子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(13)..(13)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(14)..(14)<223>为阳离子氨基酸<400>6XaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaa1510<210>7<211>16<212>PRT<213>人工序列<220><223>n为4<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>为阳离子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>为阳离子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(5)..(5)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>为阳离子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(7)..(7)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(8)..(8)<223>为阳离子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(9)..(9)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>为阳离子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(11)..(11)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(12)..(12)<223>为阳离子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(13)..(13)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(14)..(14)<223>为阳离子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(15)..(15)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(16)..(16)<223>为阳离子氨基酸<400>7XaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaa151015<210>8<211>18<212>PRT<213>人工序列<220><223>n为4.5<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>为阳离子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>为阳离子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(5)..(5)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>为阳离子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(7)..(7)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(8)..(8)<223>为阳离子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(9)..(9)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>为阳离子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(11)..(11)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(12)..(12)<223>为阳离子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(13)..(13)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(14)..(14)<223>为阳离子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(15)..(15)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(16)..(16)<223>为阳离子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(17)..(17)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(18)..(18)<223>为阳离子氨基酸<400>8XaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaa151015XaaXaa<210>9<211>20<212>PRT<213>人工序列<220><223>n为5<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>为阳离子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>为阳离子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(5)..(5)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>为阳离子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(7)..(7)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(8)..(8)<223>为阳离子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(9)..(9)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>为阳离子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(11)..(11)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(12)..(12)<223>为阳离子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(13)..(13)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(14)..(14)<223>为阳离子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(15)..(15)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(16)..(16)<223>为阳离子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(17)..(17)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(18)..(18)<223>为阳离子氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(19)..(19)<223>为疏水性氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(20)..(20)<223>为阳离子氨基酸<400>9XaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaa151015XaaXaaXaaXaa20<210>10<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>n为1.5<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(6)<223>D氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>C末端被酰胺化<400>10IleArgIleLysIleArg15<210>11<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>n为2<220><221>MISC_FEATURE<222>(8)..(8)<223>C末端被酰胺化<400>11ValArgValLysValArgValLys15<210>12<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>n为2<220><221>MISC_FEATURE<222>(8)..(8)<223>C末端被酰胺化<400>12IleArgIleArgIleArgIleArg15<210>13<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>n为2<220><221>MISC_FEATURE<222>(8)..(8)<223>C末端被酰胺化<400>13IleLysIleLysIleLysIleLys15<210>14<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>n为2<220><221>MISC_FEATURE<223>C末端被酰胺化<400>14IleArgValLysIleArgValLys15<210>15<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>n为2<220><221>MISC_FEATURE<222>(8)..(8)<223>C末端被酰胺化<400>15PheArgPheLysPheArgPheLys15<210>16<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>n为2<220><221>MISC_FEATURE<222>(8)..(8)<223>C末端被酰胺化<400>16TrpArgTrpLysTrpArgTrpLys15<210>17<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>n为2<220><221>MISC_FEATURE<222>(8)..(8)<223>C末端被酰胺化<400>17IleArgIleLysIleArgIleLys15<210>18<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>n为2<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(8)<223>D氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(8)..(8)<223>C末端被酰胺化<400>18IleArgIleLysIleArgIleLys15<210>19<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>n为2<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>L氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>L氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>L氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>D氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(5)..(5)<223>L氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>D氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(7)..(7)<223>L氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(8)..(8)<223>C末端被酰胺化<220><221>MISC_FEATURE<222>(8)..(8)<223>L氨基酸<400>19IleArgIleLysIleArgIleLys15<210>20<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>n为3<220><221>MISC_FEATURE<222>(12)..(12)<223>C末端被酰胺化<400>20ValArgValLysValArgValLysValArgValLys1510<210>21<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>n为3<220><221>MISC_FEATURE<222>(12)..(12)<223>C末端被酰胺化<400>21IleArgIleLysIleArgIleLysIleArgIleLys1510<210>22<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>n为3<220><221>MISC_FEATURE<222>(12)..(12)<223>C末端被酰胺化<400>22IleArgValLysIleArgValLysIleArgValLys1510<210>23<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>n为3<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(12)<223>全部D氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(12)..(12)<223>C末端被酰胺化<400>23IleArgValLysIleArgValLysIleArgValLys1510<210>24<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>IK8-4D<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>L氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>D氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>L氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>D氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(5)..(5)<223>L氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>D氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(7)..(7)<223>L氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(8)..(8)<223>C-末端酰胺化<220><221>MISC_FEATURE<222>(8)..(8)<223>D氨基酸<400>24IleArgIleLysIleArgIleLys15<210>25<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>对照-全部L<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(8)<223>全部L氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(8)..(8)<223>C-末端酰胺化<400>25IleIleArgLysIleIleArgLys15<210>26<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>对照-全部D<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(8)<223>全部D氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(8)..(8)<223>C-末端酰胺化<400>26IleIleArgLysIleIleArgLys15<210>27<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>对照-4D<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>L氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(2)..(3)<223>D氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(4)..(5)<223>L氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(6)..(7)<223>D氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(8)..(8)<223>C-末端酰胺化<220><221>MISC_FEATURE<222>(8)..(8)<223>L氨基酸<400>27IleIleArgLysIleIleArgLys15当前第1页1 2 3