本发明涉及一种黑柄炭角菌菌丝体萃取物的用途及基于此用途的组合物，特别是一种黑柄炭角菌菌丝体萃取物保护神经细胞的用途，以及保护神经细胞组合物。
背景技术：
随着医疗、食品科技进步及经济成功的发展，人类平均寿命得以延长，并已渐渐步入老年人社会。老化所衍生的疾病包含免疫失调、癌症、心血管疾病、神经退化病症及代谢症候群等。其中后两者所带来的庞大医疗、社会成本及家庭生活品质的受损，乃不容忽视。
人类的神经系统可分为中枢神经系统和周围神经系统，其中中枢神经系统包含脑、小脑和脊髓等。神经系统的基本结构单位是神经元，或称神经细胞，而成人的中枢神经系统的神经细胞是分化的神经细胞，不能再分裂和增殖，一旦损伤或死亡，即会造成永久性的功能丧失。因此，需要一种方法来保护神经细胞免于受伤、退化或死亡。
黑柄炭角菌(Xylaria nigripe)隶属于炭角菌目(Xylariales)、炭角菌科(Xylariaceae)及炭角菌属(Xylaria)，是一种中国传统的药用真菌，通常生长在废弃白蚁巢穴，其菌丝体形成的菌核即是中国传统的中药材料“乌灵参”，又称作乌灵菌、雷震子等。根据四川《中药志》记载，乌灵参有“补心肾、治失眠”疗效的描述，其具有补气固肾、健脾除湿及镇定安神等多种生理活性。
因野生资源逐渐匮乏，黑柄炭角菌有采集不易与品质不稳定的问题。目前开始以人工液态培养黑柄炭角菌菌丝体，是解决天然黑柄炭角菌产量不足和品质不稳定等问题的一种方法。而液态培养的过程中，黑柄炭角菌除了合成 自身生长所需的有机物质外，还会分泌代谢产物，其中也可能包含具保护神经细胞功能的成分，因此以液态培养黑柄炭角菌具有发展天然保护神经细胞物质的潜力。但不同的培养方式会令菌体生长型态不同，其基因也表达不尽相同，所产出的代谢产物也必然有所差异，在功效上也不同，或可能产生新的功效与用途。
技术实现要素：
本发明的一个方面在于提供一种黑柄炭角菌(Xylaria nigripes)菌丝体萃取物的用途，其用于制备保护神经细胞的医药组合物。黑柄炭角菌菌丝体萃取物由下述步骤所制得：提供基质，基质实质由0.5～5％重量比的糙米粉、0.1～1％重量比的麦芽萃取物以及99.4～94％重量比的水所组成。接着进行发酵工艺过程，其在基质中接种黑柄炭角菌，并在发酵温度下培养一发酵时间，以获得发酵物质。再分离发酵物质，以获得黑柄炭角菌菌丝体。接着进行萃取工艺过程，其利用溶剂与黑柄炭角菌菌丝体混合成混合物后，将混合物搅拌一萃取时间。最后去除混合物的固体部分，以获得上清液，其中上清液包含黑柄炭角菌菌丝体萃取物，且黑柄炭角菌菌丝体萃取物具有保护神经细胞活性。
依据前述的黑柄炭角菌菌丝体萃取物的用途，前述的基质由2％重量比的糙米粉、0.5％重量比的麦芽萃出物以及97.5％重量比的水所组成。
依据前述的黑柄炭角菌菌丝体萃取物的用途，其中发酵工艺过程的发酵温度为25℃，发酵时间为10天。
依据前述的黑柄炭角菌菌丝体萃取物的用途，其中萃取工艺过程的溶剂可为80℃至100℃的热水，萃取时间可为0.5小时至2小时。
依据前述的黑柄炭角菌菌丝体萃取物的用途，其中萃取工艺过程的溶剂可为70％重量比的乙醇，萃取时间可为22小时至26小时。
依据前述的黑柄炭角菌菌丝体萃取物的用途，其中混合物的固体部分可利用离心方式、过滤方式或上述方式的组合而去除。
依据前述的黑柄炭角菌菌丝体萃取物的用途，其中保护神经细胞活性可保护或预防神经细胞免于损伤而死亡。
依据前述的黑柄炭角菌菌丝体萃取物的用途，其中保护神经细胞活性可通过保护或预防神经细胞的DNA免于损伤。
本发明的另一个方面在于提供一种保护神经细胞的组合物，组合物包含有效剂量的黑柄炭角菌菌丝体萃取物。
依据前述的保护神经细胞的组合物，组合物选自以下群组的一种形式：医药组合物、饲料组合物、饮料组合物、营养补充组合物、食用组合物以及保健食用组合物。
借此，本发明的黑柄炭角菌菌丝体萃取物因具有保护神经细胞活性，可以保护或预防神经细胞免于损伤而死亡以及可保护或预防神经细胞的DNA免于损伤，故本发明的黑柄炭角菌菌丝体萃取物可用于制备保护神经细胞的医药组合物。而包含黑柄炭角菌菌丝体萃取物的组合物可作为保护神经细胞目的的医药组合物、饲料组合物、饮料组合物、营养补充组合物、食用组合物以及保健食用组合物上，具有运用在生医保健市场的潜能。
上述发明内容旨在提供本技术方案内容的简化摘要，以使阅读者对本技术方案内容具备基本的理解。此发明内容并非本技术方案内容的完整概述，且其用意并非在指出本发明实施例的重要/关键元件或界定本发明的范围。
附图说明
为让本发明的上述和其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，附图说明如下：
图1为本发明的黑柄炭角菌菌丝体萃取物的制备步骤流程图。
具体实施方式
本说明书公开内容提出黑柄炭角菌菌丝体萃取物的新颖用途，以体外试验评估黑柄炭角菌菌丝体萃取物的保护神经细胞活性，并进一步验证黑柄炭角菌菌丝体萃取物的保护神经细胞活性为保护或预防神经细胞免于损伤而死亡以及保护或预防神经细胞的DNA免于损伤。本说明书公开内容提出的黑柄炭角菌菌丝体萃取物为潜在的保护神经细胞补充剂，可用以制备保护神经细胞的医药组合物。
本发明所述的“有效剂量”指黑柄炭角菌菌丝体萃取物能有效保护和/或预防神经细胞免于损伤的量。例如，黑柄炭角菌菌丝体萃取物的有效剂量可预防神经细胞免于损伤和/或在一定程度上缓解与神经细胞损伤所引起的疾病相关的一个或多个症状。
现在以下列具体试验例进一步示范说明本发明，用以使得本发明所属技术领域通常知识的人员，可在不需过度解读的情形下完整利用并实践本发明，而不应将这些试验例视为对本发明范围的限制，但用于说明如何实施本发明的材料及方法。
<试验例>
一、制备黑柄炭角菌菌丝体萃取物
请参照图1，其为黑柄炭角菌菌丝体萃取物的制备步骤流程图。图1中，黑柄炭角菌菌丝体的制备方法100包含步骤110、步骤120、步骤130、步骤140和步骤150。
步骤110是提供基质，基质实质由0.5～5％重量比的糙米粉、0.1～1％重量比的麦芽萃出物以及99.4～94％重量比的水所组成。优选地，基质由2％重量比的糙米粉、0.5％重量比的麦芽萃出物以及97.5％重量比的水所组成。更进一步说，使用的基质的组成分为20g/L糙米粉与5g/L麦芽萃出物。使用的发酵槽为5公升的搅拌式发酵槽(stirred-tank fermentor)，工作体积为3公升。以提供碳源、氮源及水分让后续黑柄炭角菌能进行液态培养。
步骤120是进行发酵工艺过程，在基质中接种黑柄炭角菌，并在发酵温度下培养一发酵时间，以获得发酵物质。所使用的菌株为黑柄炭角菌Xylaria nigripes BCRC34219为佳，购自食品工业发展研究所生物资源保存与研究中心(台湾，新竹)，黑柄炭角菌Xylaria nigripes BCRC34219为分离自台湾本土的菌株。然而需说明的是，上述黑柄炭角菌菌株(BCRC34219)仅为本发明的一实施方式。发酵工艺过程以调节温度、通气量等条件，使黑柄炭角菌菌丝体生长。更进一步的说，发酵工艺过程的条件为，将300mL黑柄炭角菌种菌接种至基质中，再以搅拌转速为100rpm、通气量为1vvm及发酵温度为25℃等发酵条件培养10天后，可获得发酵物质。
步骤130是分离发酵物质，将发酵物质分离为固体部分和液体部分，其中固体部分包含黑柄炭角菌菌丝体。在发酵工艺过程完成后，因发酵物质中已充满黑柄炭角菌菌丝体，因此将发酵物质中的液体部分和固体部分分离后，即可在固体部分中获得黑柄炭角菌菌丝体。而分离方式可为过滤方式、离心方式或上述方式的组合。
步骤140是进行萃取工艺过程，利用溶剂与黑柄炭角菌菌丝体混合成混合物后，将混合物搅拌一萃取时间。在萃取工艺过程中，溶剂可为80℃至100℃的热水，萃取时间可为0.5小时至2小时。或溶剂可为70％重量比的乙醇，萃取时间可为22小时至26小时。更进一步的说，进行黑柄炭角菌菌丝体萃取物制备时，先使用水清洗黑柄炭角菌菌丝体数次，再利用冷冻干燥机干燥黑柄炭角菌菌丝体，制成菌丝体粉末，菌丝体粉末样品保存在密闭容器内。再将菌丝体粉末与90℃热水以重量比1：10至1：30的比例混合成混合物后，将混合物搅拌1小时以萃取其中具有功能性的成分。或是将菌丝体粉末与70％重量比的乙醇以重量比1：10至1：30的比例混合成混合物后，将混合物搅拌24小时以萃取其中具有功能性的成分。
步骤150是去除混合物的固体部分，以获得上清液，其中上清液包含黑柄炭角菌菌丝体萃取物。经过萃取工艺过程后，黑柄炭角菌菌丝体萃取物已溶解至溶剂中，其中包含具有功能性的成分，因此去除混合物中固体部分后， 所获得的上清液中包含黑柄炭角菌菌丝体萃取物。而混合物的固体部分可利用离心方式、过滤方式或上述方式的组合而去除。更进一步的说，将萃取后的样品经过滤与离心步骤，取上清液进行浓缩，再使用冷冻干燥机进行干燥，即可得黑柄炭角菌菌丝体热水萃取物和黑柄炭角菌菌丝体乙醇萃取物。
二、黑柄炭角菌菌丝体萃取物保护神经细胞能力
PC12神经细胞株分离自大鼠肾髓质嗜铬性细胞瘤属中胚层组织，一般被广为运用作为研究神经分化、神经毒性、神经药理、神经保护机制。实验上以未分化PC12神经细胞(nPC-12cells)模拟未分化的神经细胞，并以诱导剂H2O2处理模拟神经细胞的氧化损伤，通过细胞存活率分析、乳酸脱氢酶的释出率、细胞的DNA损伤分析来探讨黑柄炭角菌菌丝体萃取物对PC12神经细胞的保护能力。下述试验例的PC12神经细胞购自食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心(台湾，新竹)。
1.细胞存活率分析
PC12神经细胞的存活率(viability)分析以细胞存活率分析法(3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide；MTT assay)计算黑柄炭角菌菌丝体萃取物对PC12神经细胞的保护率。MTT为可溶于水的黄色染剂，活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶(Succinate dehydrogenase,SDH)能够代谢还原MTT，同时在细胞色素C的作用下，生成蓝紫色不溶于水的MTT-formazan，在波长595nm下具有吸光值。此法除了可监测粒线体的还原能力外，也可代表细胞存活数目，当吸光值越高表示细胞存活率越高。
实验上PC12神经细胞培养液为含10％胎牛血清(Fetal bovine serum；FBS)的DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)培养液。进行细胞存活率分析时，先将PC12神经细胞以3×105 cell/well的浓度接种在96孔微量盘中，在37℃、5％CO2培养箱中培养24小时后，分别给予样品或诱导剂H2O2，其中以仅添加诱导剂H2O2作为控制组，同时添加诱导剂H2O2与样品为实验组，而样品分别为黑柄炭角菌菌丝体热水萃取物和黑柄炭角菌菌丝体乙醇萃取物，再在37℃、5％ CO2培养箱中培养24小时。培养后将培养液吸出，用磷酸缓冲液(PBS)洗两次，加入150μl浓度为0.5mg/ml的MTT，放置37℃、5％CO2的培养箱反应4小时后，将MTT吸出，再加入100μl二甲基亚砜(DMSO)，以溶解MTT-formazan使溶液呈色。放置隔夜后，以酵素免疫分析测读仪测定在波长595nm的吸光值，可代表细胞存活数目。而PC12神经细胞保护率的计算方式如下：
其中为同时添加诱导剂H2O2与样品时PC12神经细胞的存活率；为只添加诱导剂H2O2时PC12神经细胞的存活率。
请参照下表一，为以细胞存活率分析法分析黑柄炭角菌菌丝体热水萃取物和黑柄炭角菌菌丝体乙醇萃取物对于PC12神经细胞保护率。
表一
实验结果显示，黑柄炭角菌菌丝体热水萃取物在浓度为10、50、100μg/mL时，黑柄炭角菌菌丝体热水萃取物对于PC12神经细胞保护率分别为9.4％、24.1％和29.6％。黑柄炭角菌菌丝体乙醇萃取物在浓度为10、50、100μg/mL时，黑柄炭角菌菌丝体乙醇萃取物对于PC12神经细胞保护率分别为14.3％、29.2％和33.2％。显示不论是黑柄炭角菌菌丝体乙醇萃取物或黑柄炭角菌菌丝体热水萃取物，皆可保护PC12神经细胞免于受到H2O2氧化伤害，而保护或预防PC12神经细胞免于损伤而死亡，且具有剂量依赖性。而在不同的样品浓度下，黑柄炭角菌菌丝体乙醇萃取物对PC12神经细胞保护率均高于黑柄炭角菌菌丝体热水萃取物。
2.乳酸脱氢酶释出率分析
H2O2对细胞造成氧化伤害，也导致细胞膜的破坏，因而释放出乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)到培养基之中，故培养基之中LDH释出率越低，则细胞受到损伤的比率越低，表示样品越有保护细胞的效力。
实验上先将PC12神经细胞以3×105 cell/well的浓度接种在96孔微量盘中，在37℃、5％CO2培养箱中培养24小时后，分别给予样品或诱导剂H2O2，其中以仅添加诱导剂H2O2作为控制组，同时添加诱导剂H2O2与样品为实验组，而样品分别为黑柄炭角菌菌丝体热水萃取物和黑柄炭角菌菌丝体乙醇萃取物，再在37℃、5％CO2培养箱中培养24小时。培养后将培养液吸出，用磷酸缓冲液(PBS)洗两次后，使用日本宝生物实验室的LDH细胞毒性检测试剂盒(Cytotoxicity Detection Kit，TaKaRa Bio Laboratories,Japan)分析培养液中的LDH活性，可以计算对PC12神经细胞造成的毒性百分率(percentage cytotoxicity)，即表示细胞受到损伤的情形。当分析结果LDH活性较低时，其毒性百分率较小，则细胞受到损伤的情形较不严重，表示该样品越有保护细胞的效力。在这个分析套组中，乳酸脱氢酶活性是通过比色法来测定，在特定的基质与酵素反应后，反应液的吸光度与乳酸脱氢酶活性成线性正相关。毒性百分率计算公式如下:
其中OD样品为添加样品处理后，细胞的LDH释出量。ODLow control为未添加样品的控制组，即细胞自发性的LDH释出量。ODHigh control为未加添样品的控制组，但添加Triton X-100使细胞100％死亡时的LDH释出量。
请参照下表二，为以LDH释出率分析在添加黑柄炭角菌菌丝体热水萃取物和黑柄炭角菌菌丝体乙醇萃取物时，对于H2O2诱发PC12神经细胞氧化伤害的毒性百分率。
表二
实验结果显示，黑柄炭角菌菌丝体热水萃取物在浓度为10、50、100μg/mL时，黑柄炭角菌菌丝体热水萃取物对于H2O2诱发PC12神经细胞氧化伤害的毒性百分率分别为40.5％、35.7％和32.9％。黑柄炭角菌菌丝体乙醇萃取物在浓度为10、50、100μg/mL时，黑柄炭角菌菌丝体乙醇萃取物对于H2O2诱发PC12神经细胞氧化伤害的毒性百分率分别为44.4％、36.3％和33.1％。显示不论是黑柄炭角菌菌丝体乙醇萃取物或黑柄炭角菌菌丝体热水萃取物，皆具保护PC12神经细胞免于受到H2O2氧化伤害的功效，且具有剂量依赖性。而在不同的样品浓度下，黑柄炭角菌菌丝体乙醇萃取物对PC12神经细胞保护情形均高于黑柄炭角菌菌丝体热水萃取物。
3.细胞的DNA损伤分析
单细胞凝胶电泳是一种可以检测单一细胞DNA受损的方法，其原理是利用低熔点琼脂胶体电泳分离不同大小片段的DNA，监测细胞DNA有无断裂的情况。若细胞DNA未损害则移动慢，而损伤断裂的DNA片段在电泳后会移动至细胞核外，在核酸染色后，会形成像彗星拖尾的现象，又称为彗星分析法(Comet assay)。因此，可利用单细胞凝胶电泳来观察PC12神经细胞受到诱导剂H2O2氧化伤害与黑柄炭角菌菌丝体萃取物保护后，PC12神经细胞DNA受损的情形。
实验上以未经任何处理的PC12神经细胞作为对照组，以仅添加诱导剂H2O2作为控制组，以同时添加诱导剂H2O2与样品为实验组。控制组以300μ g/mL的H2O2处理2小时后，再进行单细胞凝胶电泳。而实验组先分别以浓度为10、50、100μg/mL的黑柄炭角菌菌丝体热水萃取物或黑柄炭角菌菌丝体乙醇萃取物处理24小时后，再以300μg/mL的H2O2处理2小时，之后进行单细胞凝胶电泳。在定量分析上，可使用影像处理软体，统计DNA拖尾比率与拖尾长度。
请参照下表三，不同实验组的PC12神经细胞的DNA损伤分析结果。
表三
实验结果显示，对照组的PC12神经细胞在进行单细胞凝胶电泳时不会有拖尾的情形出现。控制组的PC12神经细胞在进行单细胞凝胶电泳时，拖尾DNA的比率达68.3％，平均拖尾长度为80。而实验组的P12神经细胞，不论是先经黑柄炭角菌菌丝体乙醇萃取物或黑柄炭角菌菌丝体热水萃取物处理24小时，再以300μg/mL的H2O2处理2小时后，在进行单细胞凝胶电泳时，可以发现拖尾DNA的比率与拖尾长度都降低了。尤其是先以100μg/mL的黑柄炭角菌菌丝体热水萃取物处理后，拖尾DNA的比率降低为7.6％与平均拖尾长度减短为11.6。显示不论是黑柄炭角菌菌丝体乙醇萃取物或黑柄炭角菌菌丝体热水萃取物，皆具有保护PC12神经细胞免于受到H2O2氧化伤害的功效，并能保护或预防PC12神经细胞的DNA免于损伤，且不论在何种样品浓度，黑柄炭角菌菌丝体乙醇萃取物保护PC12神经细胞的能力均优于黑柄炭角菌菌丝体热水萃取物。
由上所述，本发明所公开的黑柄炭角菌菌丝体萃取物在保护神经细胞活性分析结果显示，黑柄炭角菌菌丝体萃取物可以保护或预防神经细胞免于损伤而死亡以及可保护或预防神经细胞的DNA免于损伤。故本发明的黑柄炭角菌菌丝体萃取物可用于制备保护神经细胞的医药组合物。本发明的黑柄炭角菌菌丝体萃取物所制备的保护神经细胞的医药组合物可经由局部表面施用式(topical)投药、口服(如，口服用粉剂、胶囊、悬浮液或药锭)、或肠胃外(parenterally)(例如注射)等适当方法施用。故包含有效剂量的黑柄炭角菌菌丝体萃取物的组合物，可作为保护神经细胞目的的医药组合物、饲料组合物、饮料组合物、营养补充组合物、食用组合物以及保健食用组合物上，具有运用在生医保健市场的潜能。
虽然本发明已经以实施方式公开如上，然其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种变动与润饰，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。