一种抗HBV感染的宿主HNF因子抑制剂及其用途的制作方法

本发明属生物医药技术领域，涉及天然活性物质中的抗病毒药物,具体涉及一种抗HBV感染的宿主HNF因子抑制剂，尤其涉及宿主细胞肝核因子HNF特异性抑制剂黄芩苷或与核苷类药物组合，用于临床治疗乙肝病毒感染疾病。

背景技术：

据国家卫生部2010年最新的统计数据表明，全国的乙肝表面抗原流行率是7.18％，比以前的11％，下降趋势明显，表明目前采用的防控手段有效。由于中国的人口基数庞大，中国仍约有9300万例乙肝病毒携带者，其中慢性乙肝患者约2000-3000万。而相关性的统计研究表明乙肝病毒感染引起的慢性肝炎与肝衰竭、肝硬化和原发性肝癌密切相关，每年近30万人死于与乙肝相关的肝硬化和肝癌等，是我国目前最为突出的一个公共卫生问题。研究显示，我国肝癌患者中，90％以上是由乙肝病毒感染引起，乙肝病毒对肝脏损害先表现为肝细胞炎症坏死，尔后发展成肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌，因此乙型肝炎病毒感染防治仍是目前中国乃至全世界的科研人员研究的热点。

目前临床上的治疗HBV感染的药物主要是干扰素(包括IFN-α和PEG-IFN)和核苷(酸)类似物药物，如拉米夫定(Lamivudine,LMV)、阿德福韦酯(Adefovir dipivoxil,ADV)、恩替卡韦(Entecavir,ETV)、替比夫定(Telbivudine，LdT)，实践显示，这些药物都存在不足之处，使用均有局限性；IFN-α对乙肝患者的HBeAg和HBV-DNA的转阴和肝功能的恢复有效率约为30％，但患者对其耐受性较差，副作用也较多，PEG-IFN的治疗效果虽略优于IFN-2α，但耐受性与副作用与IFN-α相似；核苷(酸)类似物药物因其强大的抑制HBV病毒复制的效果成为目前治疗HBV感染首要的选择，但由于其不能清除HBV cccDNA(covalently closed circular DNA)，所以需要长期服药，从而导致了耐药问题的产生，尤其是最早上市的核苷(酸)类似物药物拉米夫定耐药突变问题最为突出，严重影响治疗效果；恩替卡韦是较新型的核苷(酸)类似物药物，于2005年获得美国FDA批准上市；恩替卡韦为2’-戊环脱氧鸟嘌呤核苷类似物，是目前抗HBV作用最强的核苷(酸)类似物药物，对于使用核苷(酸)类似物药物的初治患者，恩替卡韦疗效显著且耐药变异的发生率很低，5年耐药发生率只有1.2％，但是当恩替卡韦用作已经产生拉米夫定耐药的患者的替代治疗药物时，耐药发生率则会明显提高，3年和5年的耐药发生率分别达15％和51％；另外，虽然恩替卡韦和其它核苷(酸)类似物药物一样，总体安全性和耐受性良好，但部分患者还是会发生中到重度的不良反应，常见的如头痛、疲劳、眩晕、恶心等。

由于目前的治疗手段存在的缺陷，人们一直在努力探索更多种类的安全有效的抗HBV药物和方法，除了开发更新型的化学药物，其它研究方向还包括细胞因子的使用(如IFN-λ、IL-7和IL-21)、治疗性疫苗、Toll样受体激动剂、RNA干扰、HBV特异性T细胞恢复治疗等。而从天然产物中发掘抗HBV活性成分也日益受到关注。天然产物因其资源丰富，种类繁多，已成为创新药物的重要源泉，研究表明许多天然产物具有抗HBV的作用，其结构成分包括了黄酮类、苯丙素类、萜类、生物碱、醌类和多糖等类型的化合物，与目前临床上应用的以核苷(酸)类似物为主的抗HBV药物的单一结构类型相比，更具多样性，抗病毒的机制也各不相同，这不仅有助于开发抗HBV新药，并且对发展联合用药，提高疗效，减小副作用和耐药突变的发生都有重要意义。

黄芩苷是从唇形科植物黄芩(Scutellaria baicalensis Georigi)的干燥根中提取的一种黄酮类化合物,其原植物主要产于东北、河北、山西、河南、陕西、内蒙古等地；日本、韩国等也发现有黄芩的产地；其中黄芩苷是黄芩的主要有效成分之一,也是黄芩及其制剂的主要质量控制指标成分，据药理学研究报道,黄芩苷具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗肿瘤、免疫调节、降压、镇静、利胆、保肝、抗氧化和解痉等功效，体外实验表明,黄芩苷对HBV复制有一定抑制作用,在临床上黄芩苷药物作为乙肝治疗的辅助用药亦有较好的疗效，但是有关黄芩苷抗HBV的确切作用机制尚未见文献报道，也无证据显示黄芩苷为代表的黄芩类化合物有抑制乙肝病毒HBV耐药性突变株的感染的作用。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供天然活性物质中的抗病毒药物,具体涉及抗HBV感染的宿主HNF因子抑制剂，尤其涉及宿主细胞肝核因子HNF特异性抑制剂黄芩苷或与核苷类药物组合，用于临床治疗乙肝病毒感染疾病。

与本发明相关的现有技术有：

1.Papatheodoridis GV,Dimou E,Papadimitropoulos V.Nucleoside analogues for chronic hepatitis B:Antiviral efficacy and viral resistance[J].Am J Gastroenterol,2002,97(7):1618-1628.

2.Ferir G,Kaptein S,Neyts J,et al.Antiviral treatment of chronic hepatitis B virus infections:the past,the present and the future.[J]Rev Med Virol,2008,18(1):19-34.

3.Manesis EK,Hadziyannis SJ.Interferon alpha treatment and retreatment of hepatitis B e antigen-negative chronic hepatitis B.Gastroenterology,2001,121(1):101–109.

4.Papatheodoridis GV,Dimou E,PapadimitropoulosV.Nucleoside analogues for chronic hepatitis B:Antiviral efficacy and viral resistance[J].Am J Gastroenterol,2002,97(7):1618-1628.

5.Zoulim F.New insight on hepatitis B virus persistence from the study of intrahepatic viral cccDNA[J].J Hepatol,2005,42(3):302-308.

6.Ghany M,Liang TJ.Drug targets and molecular mechanisms of drug resistance in chronic hepatitis B[J].Gastroenterology 2007,132(4):1574-1585.

7.Zoulim F，Locarnini S.Hepatitis B Virus Resistance to Nucleos(t)ide Analogues[J].Gastroenterology,2009,137(5):1593–1608.

8.Fletcher P,Delaney WE.New Therapeutic Targets and Drugs for the Treatment of Chronic Hepatitis B.Semin Liver Dis 2013,33(2):130-137.

9.Wu GY,Chen HS.Novel approaches towards conquering hepatitis B virus infection[J].World J Gastroentero,2007,13(6):830-836.

10.Michel ML,Deng Q,Mancini-Bourgine M.Therapeutic vaccines and immune-based therapies for the treatment of chronic hepatitis B:Perspectives and challenges[J].J Hepatol,2011,54(6):1286-1296.

11.Weinberg MS,Arbuthnot P.Progress in the use of RNA interference as a therapy for chronic hepatitis B virus infection[J].Genome Med,2010,2:28.

12.左国营,刘树玲,徐贵丽.近20年来药用植物成分体外抗HBV活性研究进展[J].世界华人消化杂志,2006,14(3):1241-1246.

13.Wohlfarth C,Efferth T.Natural products as promising drug candidates for the treatment of hepatitis B and C[J].Acta Pharmacol Sin,2009,30(1):25-30.

14.文敏,李雪,付守廷.黄芩苷药理作用研究新进展[J].沈阳药科大学学报,2008,25(2):158-162.

15.张建春,张华,施瑛,等.黄芩苷的研究近况[J].时珍国医国药,2005,16(3):247-249.

16.成扬,平键,许怀栋,等.氧化苦参碱黄芩苷组合物对HepG2.2.2.15细胞乙肝病毒抗原表达的抑制作用[J].中国药理学通报,2006,22(10):1258-1263.

17.陈焯彬,姚钦江,刘辉林.黄芩苷胶囊联合阿德福韦酯片治疗慢性乙型病毒性肝炎临床观察[J].广西中医学院学报,2010,13(1):5-7.

18.李金科,李芳,胡波,等.干扰素联合黄芩苷胶囊治疗慢性乙型肝炎和早期肝硬化临床观察[J].山西医药杂志,2010,39(6):501-502.

19.亓民,张国强,王灵菊,等.恩替卡韦分散片联合黄芩苷胶囊治疗慢性乙型病毒性肝炎临床观察[J].中国实用医刊,2012,39(20):44-46.

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供天然活性物质中的抗病毒药物,具体涉及一种抗HBV感染的宿主HNF因子抑制剂，尤其涉及宿主细胞肝核因子HNF特异性抑制剂黄芩苷或与核苷类药物组合物，及其在用于制备临床治疗乙肝病毒感染疾病的药物中的用途。

本发明提供了能特异性抑制宿主核转录因子HNF的天然活性物质黄芩苷在制备抗乙肝病毒HBV的药物中的用途。

本发明还提供了由宿主细胞肝核因子HNF特异性抑制剂黄芩类化合物与核苷类化合物组成的药物组合物及其在用于制备临床治疗乙肝病毒感染疾病的药物中的用途。

本发明中，所述的乙肝病毒HBV包含野生型，拉米夫定突变株，及临床上发生的各类耐药病毒株感染。

本发明中，所述的由宿主细胞肝核因子HNF特异性抑制剂黄芩类化合物与核苷类化合物组成的药物组合物，其中，黄芩苷是从唇形科植物黄芩(Scutellaria baicalensis Georigi)的干燥根中提取的一种黄酮类化合物,其原植物主要产于东北、河北、山西、河南、陕西、内蒙古等地；日本、韩国等也发现有黄芩的产地；黄芩苷是黄芩的主要有效成分之一,也是黄芩及其制剂的主要质量控制指标成分；

本发明中，黄芩类化合物优选黄芩苷；

本发明中，核苷类药物包括但不限于拉米夫定，恩替卡韦，替诺夫韦等核苷类药物；本发明优选恩替卡韦。

依据现有技术的研究基础，肝细胞核因子(hepatocyte nuclear factors，HNF)是调节肝脏内基因特异性表达的一类转录因子，在肝脏丰富表达，并含有在进化上相当保守的DNA结合区，通过与各种靶基因调控区顺式作用元件的结合，调节下游多种基因的表达。HNF不仅在肝细胞成熟分化和代谢过程起重要作用，并且与HBV感染后病毒的复制密切相关，HNF可以与HBV启动子和增强子上的特定序列结合，调控转录活性，影响病毒的复制效率。

本发明中，通过实验证实了黄芩苷具有明显的抑制宿主细胞肝核转录因子的表达，下调病毒RNA的转录的作用，进一步，采用黄芩苷与恩替卡韦制成药物组合，进行(1)在HepG2 2.2.15细胞模型中单独和药物组合对野生型HBV的抑制作用实验；(2)构建YMDD变异HBV的短暂表达细胞模型单独和药物组合对拉米夫定耐药突变HBV的抑制效果实验，结果证实了所述的两种抗HBV作用机制不同的药物制成的药物组合，使用后能明显提升抗HBV突变株复制效果。

本发明提供了有关宿主细胞肝核因子HNF特异性抑制剂黄芩苷以及与核苷类药物组合物，实验结果显示，以黄芩苷为代表的黄芩类化合物具有抑制宿主细胞肝核因子的能力，单独使用对HBV的野生株，或者耐3TC突变株具有显著效果，与恩替卡韦为代表的核苷类化合物制成药物组合物，能有效的增强对耐药突变株的抑制效果。

本发明所述的有关宿主细胞肝核因子HNF特异性抑制剂黄芩苷以及与核苷类药物组合物可用于制备临床治疗乙肝病毒感染疾病的药物。

本发明的黄芩苷以及与核苷类药物的组合物的组合方式，可以不改变现有药物剂型下，黄芩类化合物与核苷类药物分别以单独成药的方式组合治疗，也可以将黄芩类化合物与核苷类似物制成同一剂型，其给药途径或制剂包括且不限定于以下方式：口服、注射、粘膜给药，注射液、气雾剂等。

附图说明

图1是黄芩苷下调HNF mRNA水平结果，

图2是黄芩苷抑制HNF蛋白表达水平结果。

图3是黄芩苷抑制HepG2 2.2.15细胞内HBV RNA结果。

图4是黄芩苷抑制HBs抗原和HBe抗原的分泌及胞外HBV-DNA病毒颗粒分泌结果。

图5显示ETV+BA组合物明显抑制HepG2 2.2.15细胞分泌HBsAg，HBeAg和胞外病毒颗粒。

图6显示了恩替卡韦与黄芩苷药物组合物抑制HBV rtM204V+rtLl80M突变株HBsAg、HBeAg分泌。

图7显示了恩替卡韦与黄芩苷药物组合物明显提升抑制HBV rtM204V+rtLl80M突变株分泌病毒颗粒的能力。

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

具体实施方式

实施例1

黄芩苷(baicalin)抑制肝核因子HNF，下调HBV-RNA水平，降低HBV病毒表面抗原水平和病毒颗粒水平试验

HepG2 2.2.15细胞长成单层后，弃去培养液，用EDTA溶液洗涤细胞一次，每瓶(25cm2培养瓶)加入消化液(EDTA溶液:0.5％胰酶＝5:1)5mL，置37℃恒温箱5-10分钟，去除消化液，每瓶加入适量细胞培养液，用移液管将贴壁细胞轻轻吹下并吹散，分瓶传代，置37℃，5％CO2培养，48小时后换液，平均每5天传代一次。HepG2 2.2.15细胞经消化，制备成2×10⁵/mL的细胞悬液，以250μL/孔接种于48孔细胞培养板中，培养48小时长成细胞单层后，加入无毒浓度下不同浓度倍比稀释的含黄芩苷的培养液，同时设不加药物的空白对照，继续培养9天(每3天换液一次)，收集上清液，检测HBsAg、HBeAg和HBV DNA水平，细胞则用于提取RNA，通过Northern blot和real time RT-PCR检测HBV RNA的表达。同时测定核因子HNF的转录水平和蛋白表达水平。

Real time RT-PCR相对定量分析结果显示，①黄芩苷12.5μM、25μM和50μM干预后的HNF1αmRNA表达水平显著低于对照组，分别减少31.76％、51.76％和57.65％(如图1A所示)；②黄芩苷25μM和50μM干预后的HNF4α mRNA表达水平显著低于对照组(如图1B所示)，分别减少43.33％和52.22％；③黄芩苷12.5μM、25μM和50μM对HNF3β表达水平无显著影响(图1C所示)；④恩替卡韦(ETV)3nM对HNF1α、HNF3β和HNF4α mRNA水平均无显著影响。

Western blot检测结果显示，黄芩苷对HNF1α和HNF4α蛋白表达同样具有抑制作用，且抑制强度与黄芩苷浓度呈正相关；而恩替卡韦(ETV)3nM对HNF1α、HNF4α表达水平均未见明显影响(如图2所示)；

Real time RT-PCR相对定量分析结果显示，黄芩苷25μM和50μM干预后的HBV 3.5kb RNA水平显著低于对照组(如图3A所示)，Northern印记杂交检测结果显示，黄芩苷对HepG2 2.2.15细胞内HBV RNA水平的影响具有浓度依赖关系，在12.5μM时作用不明显，而在25μM和50μM时对HBV 3.5kb和2.1/2.4kb RNA均显示有抑制作用，以50μM时的抑制效果最明显(如图3B所示)；

图3,黄芩苷抑制HepG2 2.2.15细胞内HBV RNA

ELISA法检测结果显示，黄芩苷在50μM和25μM时对HepG2 2.2.15细胞分泌的HBV抗原有显著的抑制作用(如图4A,4B所示),定量PCR分析结果显示，黄芩苷25μM和50μM干预后的细胞上清HBV DNA水平显著低于对照组(如图4C所示).

实施例2

黄芩苷BA与恩替卡韦ETV组合物体外抗HBV野生型病毒株作用试验

HepG2 2.2.15细胞以2×10⁵/mL的密度，250μL/孔接种于48孔细胞培养板中，培养48小时长成细胞单层后，加入用培养液配制的ETV和BA的混合液,分别为ETV3nM+BA 50μM、ETV0.75nM+BA 50μM和ETV0.19nM+BA50μM。同时以ETV 3nM、0.75nM和0.19nM作为ETV单独干预对照，并设不含药物的培养液对照。再继续培养9天，期间每3天换液一次，样品干预9天后收集细胞上清液，检测HBsAg、HBeAg和HBV DNA水平；

对HepG2 2.2.15细胞上清中HBV抗原检测显示，单独使用ETV对HBV抗原的抑制作用较弱，而与BA配伍后抑制作用均有不同程度的提升(如图5A,5B所示)；real time RT-PCR检测结果显示，不同配比的ETV+BA组合物干预后的HepG22.2.15细胞上清中HBV DNA拷贝数比单独使用ETV干预的HBV DNA拷贝数均有所降低(如图5C所示)

实施例3

恩替卡韦黄芩苷组合物体外抗HBV rtM204V+rtLl80M突变株活性检测

HepG2细胞以2×10⁵/mL的细胞密度，250μL/孔接种于48孔细胞培养板中，培养24小时，约80％汇合时，转染突变质粒rtM204V+rtLl80M，然后加入用培养液配制的ETV和BA的混合液，分别为ETV 48nM+BA 50μM、ETV 12nM+BA 50μM ETV 3nM+BA 50μM和ETV 0.75nM+BA 50μM，同时做ETV单独干预的对照，ETV浓度分别为48nM、12nM、3nM和0.75nM，并设不含药物的培养液对照；样品干预6天后(期间隔天换液一次)，收集细胞上清液，用ELISA试剂盒检测HBsAg、HBeAg以及用荧光定量PCR检测HBV DNA水平；

对HBV rtM204V+rtLl80M耐药突变细胞模型上清中的HBV抗原检测显示,单独使用ETV对HBV抗原的抑制作用较弱，而不同配比的ETV+BA组合物干预后的细胞模型培养上清中HBV抗原水平均显著低于单独使用ETV干预的抗原水平(如图6A,6B所示)，表明ETV与BA组合干预后对HBsAg和HBeAg抑制作用均有显著提升；

荧光定量PCR检测结果显示，不同配比的ETV+BA组合物干预后的rtM204V+rtLl80M耐药突变细胞模型培养上清中HBV DNA拷贝数均显著低于单独使用ETV干预的HBV DNA拷贝数(如图7所示)。