本发明涉及阿尔茨海默氏病及其它与淀粉样β(Abeta)肽、淀粉样前体蛋白(APP)的神经毒性和高度聚集肽片段有关的疾病和病症的领域。阿尔茨海默氏病是在世界范围内影响数百万患者的破坏性神经变性病症。由于目前批准的上市药剂对于患者只有暂时的症状性益处，所以，在阿尔茨海默氏病的治疗方面，还存在显著未满足的需要。
阿尔茨海默氏病的特点在于Abeta在脑部的形成、聚集和沉积。在小鼠模型中，已经证明，完全或部分抑制β-分泌酶(β位点淀粉样前体蛋白裂解酶；BACE)，对于斑块相关和斑块依赖性病变具有显著的效果。这说明，即使少量降低Abeta肽水平，也可以导致斑块负荷以及突触缺陷的长期明显减少，由此提供显著的治疗益处，尤其是治疗阿尔茨海默氏病。
此外，已经证明，特异性靶向N3pGlu Abeta的抗体可以体内降低斑块水平(US 2013/0142806)。N3pGlu Abeta，也称为N3pE或Abetap3-42，是仅仅在斑块中发现的Abeta肽的截短形式。虽然N3pGlu Abeta肽是在脑中沉积的Abeta的少量组分，但研究表明，N3pGlu Abeta肽具有侵害性的聚集性能，并且在沉积级联的早期累积。
BACE抑制剂与结合N3pGlu Abeta肽的抗体的联用药，希望能够治疗Abeta肽介导的病症，例如，阿尔茨海默氏病，这种联用药可以比任何单独的药物更有效。例如，用这种联用药治疗，与单独使用的每个药物相比较，可以降低任一个或两个药物的使用剂量，潜在地降低副作用，同时保持效果。人们相信，用N3pG抗体和BACE抑制剂靶向除去Abeta的沉积形式，将会促进噬菌细胞除去预先存在的斑块沉淀，同时通过抑制Abeta的形成，减少或防止Abeta的进一步沉积。
US 2009/0209755公开了具有BACE抑制活性的稠合的氨基二氢噻嗪衍生物，并且进一步公开了作为Aβ肽所引起的神经变性疾病的有效治疗剂，例如，阿尔海默氏类型的痴呆。另外，J. Neuroscience，31(46)，16507-16516页(2011)公开了(S)-4-(2,4-二氟-5-嘧啶-5-基-苯基)-4-甲基-5,6-二氢-4H-[1,3]噻嗪-2-基胺，它是口服给予的CNS活性的BACE抑制剂。美国专利US 8,278,334公开了治疗认知或神经变性疾病的方法，所述方法包括：给予取代的环胺BACE-1抑制剂与抗淀粉样蛋白抗体。进一步的，J. Neuroscience，34(35)，11621-11630页(2014)公开了BACE抑制剂和抗abeta抗体Gentenerumab的联合治疗在APPLondon小鼠中能够增进淀粉样蛋白的降低。
相应地，本发明提供了治疗认知或神经变性疾病的方法，所述方法包括：给予需要这种治疗的患者有效量的BACE抑制剂与有效量的抗N3pGlu Abeta单克隆抗体的联用药。
更具体地说，本发明提供了治疗认知或神经变性疾病的方法，所述方法包括：给予需要这种治疗的患者有效量的式I的化合物或其可药用盐与有效量的抗N3pGlu Abeta单克隆抗体的联用药，
其中，R是H或F；和
A是∶
本发明还提供了治疗以Abeta的形成和沉积为特征的疾病的方法，所述方法包括：给予需要这种治疗的患者有效量的式I的化合物或其可药用盐与有效量的抗N3pGlu Abeta单克隆抗体的联用药。
本发明进一步提供了治疗阿尔茨海默氏病的方法，所述方法包括：给予需要这种治疗的患者有效量的式I的化合物或其可药用盐与有效量的抗N3pGlu Abeta单克隆抗体的联用药。
本发明还提供了治疗轻微的阿尔茨海默氏病的方法，所述方法包括：给予需要这种治疗的患者有效量的式I的化合物或其可药用盐与有效量的抗N3pGlu Abeta单克隆抗体的联用药。
本发明进一步提供了治疗轻微的认知损害的方法，所述方法包括：给予需要这种治疗的患者有效量的式I的化合物或其可药用盐与有效量的抗N3pGlu Abeta单克隆抗体的联用药。
本发明进一步提供了治疗前驱症状的阿尔茨海默氏病的方法，所述方法包括：给予需要这种治疗的患者有效量的式I的化合物或其可药用盐与有效量的抗N3pGlu Abeta单克隆抗体的联用药。
另外，本发明提供了防止轻微认知损害发展为阿尔茨海默氏病的方法，所述方法包括：给予需要这种治疗的患者有效量的式I的化合物或其可药用盐与有效量的抗N3pGlu Abeta单克隆抗体的联用药。
本发明进一步提供了治疗大脑的淀粉样血管病(CAA)的方法，所述方法包括：给予需要这种治疗的患者有效量的式I的化合物或其可药用盐与有效量的抗N3pGlu Abeta单克隆抗体的联用药。
此外，本发明提供了式I的化合物或其可药用盐与有效量的抗N3pGlu Abeta单克隆抗体的联用药，用于治疗，尤其是用于治疗阿尔茨海默氏病、轻微的阿尔茨海默氏病、前驱症状的阿尔茨海默氏病，或用于防止轻微的认知损害发展成为阿尔茨海默氏病。
本发明进一步提供了药物组合物，其含有式I的化合物或其可药用盐以及一或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂，与含有抗N3pGlu Abeta单克隆抗体以及一或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物联用。
另外，本发明提供了试剂盒，其包含式I的化合物或其可药用盐，以及抗N3pGlu Abeta单克隆抗体。本发明进一步提供了试剂盒，其包括：含有式I化合物或其可药用盐与一或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物，以及含有抗N3pGlu Abeta单克隆抗体与一或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。本文使用的“试剂盒”包括每个组分的独立的容器，在单一包装中，其中一个组分是式I的化合物或其可药用盐，另一个组分是抗N3pGlu Abeta单克隆抗体。“试剂盒”还可以包括每个组分的独立的容器，在独立的包装中，其中一个组分是式I的化合物或其可药用盐，另一个组分是抗N3pGlu Abeta单克隆抗体，以及以联用药形式给予每个组分的说明书。
本发明进一步提供了式I化合物或其可药用盐与有效量的抗N3pGlu Abeta单克隆抗体的联用形式用于制备药物的用途，所述药物用于治疗阿尔茨海默氏病、轻微的阿尔茨海默氏病、前驱症状的阿尔茨海默氏病，或用于防止轻微的认知损害发展成为阿尔茨海默氏病。
本领域普通技术人员可以理解和认识到，在美国专利US 8,679,498 B2(题目为：“Anti-N3pGlu Amyloid Beta Peptide Antibodies and Uses Thereof”，2014年3月25日颁布(USSN13/810,895))中，本领域普通技术人员鉴定和公开了“抗N3pGlu Abeta单克隆抗体”和特异性抗体“B12L”与“R17L”以及制备和使用所述抗体的方法。参见例如美国专利US 8,679,498 B2的表1。
另外，本发明使用的某些抗体的氨基酸序列提供于下面的表A中∶
表A-抗体SEQ ID号
。
认知或神经变性疾病包括阿尔茨海默氏病、轻微的阿尔茨海默氏病、轻微的认知损害、前驱症状的阿尔茨海默氏病、大脑淀粉样血管病(CAA)、唐氏综合症，等等。
本文使用的术语“治疗”包括限制、减缓、终止、降低或逆转所存在的症状、障碍、病症或疾病的进展或严重程度。
本文使用的术语“患者”是指人。
术语“抑制Abeta肽的产生”是指降低患者的体内Abeta肽的水平。
本文使用的术语“有效量”是指式I化合物或其可药用盐的数量或剂量，以及抗N3pGlu Abeta单克隆抗体的数量或剂量，当给予患者单或多剂量时，这种数量或剂量能够为诊断或治疗中的患者提供期望的效果。应当理解，通过以能够提供式I化合物和抗N3pGlu Abeta单克隆抗体的在身体中有效水平的方式给予式I的化合物或其可药用盐，以及抗N3pGlu Abeta单克隆抗体，进行本发明的联合治疗。
作为本领域技术人员，主诊医生通过利用已知的技术，并且观察在类似情况下所获得的结果，可以容易地确定有效量。在确定患者的有效量的过程中，主诊医生会考虑大量因素，包括但不限于∶患者的种类；它的体量、年龄和常规健康情况；所涉及的具体疾病或病症；疾病或病症的复杂度或严重程度；个体患者的响应；给予的具体化合物；给药模式；给予的制剂的生物利用率特征；选择的剂量方案；使用的伴随药物；及其它相关的情况。
在本发明的联用药中，式I的化合物和其可药用盐在很宽的剂量范围内通常是有效的。例如，日剂量通常在大约0.1 mg/天至大约1000 mg/天的范围内，优选大约0.1 mg/天至大约500 mg/天，最优选大约0.1 mg/天至大约100 mg/天。另外，在本发明的联用药中，抗N3pGlu Abeta单克隆抗体在很宽的剂量范围内通常是有效的。例如，周剂量通常在大约0.1至10 mg/kg/周的范围内，优选大约0.3至大约6 mg/kg/周，最优选大约0.3 mg/kg/周至大约3 mg/kg/周。在有些情况下，低于上述范围的下限的剂量水平可能是更合适的，而在其它情况下，在副作用可接受的条件下，可以使用更大的剂量，因此，上述剂量范围不是打算以任何方式限制本发明的范围。
优选，将本发明的BACE抑制剂和抗体配制为药物组合物，通过能够产生化合物生物利用率的任何途径给予。由于受到药物的物理性能与患者和护理者的便利性的限制，可以以任何方式改变给药途径。优选，肠胃外给予抗N3pGlu Abeta单克隆抗体组合物，例如，静脉内或皮下给予。另外，口服、肠胃外或透皮给予BACE抑制剂，例如，式I的化合物或其可药用盐，包括静脉内或皮下给予。这种药物组合物和其制备方法在本领域为大家所熟知(参见，例如，Remington: The Science and Practice of Pharmacy(D.B. Troy, Editor, 21st Edition, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006))。
本文使用的短语“联用药”是指，BACE抑制剂，例如，式I的化合物或其可药用盐，与抗N3pGlu Abeta单克隆抗体，例如，抗N3pGlu Abeta单克隆抗体，同时给予，或以任何次序顺序给予，或其任何联用形式。两种分子可以以相同药物组合物的一部分或单独的药物组合物形式给予。BACE抑制剂可以在给予抗N3pGlu Abeta单克隆抗体之前、同时或之后给予，或在其一些联用药中给予。如果以重复的间隔时间(例如，在标准疗程期间)给予抗N3pGlu Abeta单克隆抗体，则可以在每次给予抗N3pGlu Abeta单克隆抗体之前、同时或之后给予BACE抑制剂，或其一些联用药形式，或以相对于抗N3pGlu Abeta单克隆抗体治疗的不同的间隔时间给予，或以抗N3pGlu Abeta单克隆抗体的疗程之前、在该疗程期间的任何时间或在该疗程之后，给予单一或系列剂量。
下列段落描述了本发明的优选的基团、取代基和构型。
优选的化合物是∶
N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺；和
N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-3,5-二氟-吡啶-2-甲酰胺；和其可药用盐。
尤其优选N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺，或其可药用盐。
最优选N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺。
此外， N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4a,5,6,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a(4H)-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的结晶形式2是优选的化合物； N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4a,5,6,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a(4H)-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的结晶形式2，是尤其优选的化合物，其特征为：在X射线衍射谱中，在11.8°的衍射角2θ处存在实质性的峰，还具有一个或多个选自18.6°、19.3°和26.7°的峰，衍射角的容许误差是0.2度。
优选的抗N3pGlu Abeta单克隆抗体是B12L和R17L，美国专利US 8,679,498 B2(参见，例如，其中的表1)对它们进行了鉴定，尤其优选B12L。
本领域普通技术人员可以理解，式I的化合物可以存在互变异构形式，如反应路线A所述。当本申请提到式I化合物的任何一个具体互变异构体时，应该理解为，它包括两种互变异构形式和其所有的混合物。
反应路线A
为了清楚起见，在下列反应路线中未指明某些立体化学核心，并且删除了某些取代基，但并没有以任何方式限制反应路线内容的意思。此外，在合成式I化合物的过程中，在任何方便的点，本领域普通技术人员可以利用(例如)选择结晶技术或手性色谱方法分离或拆分单一异构体、对映体和非对映体(参见，例如，J. Jacques等人，"Enantiomers,Racemates,and Resolutions",John Wiley and Sons, Inc., 1981, 以及E.L. Eliel和S.H. Wilen,”Stereochemistry of Organic Compounds”, Wiley-Interscience, 1994)。名称“异构体1”和“异构体2”是指分别从手性色谱第一个和第二个洗脱的化合物，如果在合成的早期开始手性色谱，则同样的名称用于随后的中间体和实施例。
本领域普通技术人员可以理解，本发明的化合物包含含有至少两个手性中心的核∶
反应路线B
虽然本发明包括所有的单一对映体，以及所述化合物的对映体的混合物，包括外消旋体，但在标记了1和2的碳原子(如反应路线B所述)处具有绝对构型的化合物是优选的本发明化合物。
另外，下面反应路线所描述的某些中间体可以包含一个或多个氮保护基。可变的保护基在每次出现时可以相同或不同，这取决于具体反应条件和所进行的具体转化。技术人员熟知保护和脱保护条件，并且在文献中进行了描述(参见，例如“Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis”，第四版，Peter G.M. Wuts和Theodora W. Greene, John Wiley and Sons, Inc. 2007)。
式I的化合物或其可药用盐，可以用本领域已知的各种方法制备，在下面的制备例和实施例中，举例说明了其中一些方法。所描述的每个途径的具体合成步骤可以以不同的方式组合，或与不同方法的步骤结合，制备式I的化合物或其盐。可以使用本领域众所周知的常规方法，回收每个步骤的产物，包括提取、蒸发、沉淀、色谱、过滤、研磨和结晶。另外，除非另作说明，否则，所有的取代基如以前所定义。对本领域普通技术人员来说，很容易得到试剂和起始原料。
本文使用的“APP”是指淀粉样前体蛋白；“BOC”是指叔丁氧羰基；“BSA”是指牛血清白蛋白；“CSF”是指脑脊液；“DCC”是指1,3-二环己基碳二亚胺；“DIC”是指二异丙基碳二亚胺；“DCM”是指二氯甲烷；“DIPEA”是指二异丙基乙胺；“DMAP”是指二甲基氨基吡啶；“DMEM”是指Dulbecco's改进的Eagle's培养基；“DMSO”是指二甲亚砜；“EDCI”是指1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；“EDTA”是指乙二胺四乙酸；“ee”是指对映体过量；“EtOAc”是指乙酸乙酯；“Ex”是指实施例；“F12”是指Ham's F12培养基；“FBS”是指胎牛血清；“FRET”是指荧光共振能量转移； “HATU”是指(二甲基氨基)-N,N-二甲基(3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-基氧基)甲亚胺(methaniminium)六氟磷酸盐；“HEK”是指人的胚肾；“hr”是指小时；“HOAc”是指乙酸；“HOAt”是指1-羟基-7-偶氮苯并三唑；“HOBt”是指1-羟基苯并三唑水合物；“HBTU”是指2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐；“HRP”是指辣根过氧化酶；“IC50”是指药剂可以产生可能的最大抑制响应的50%时的药剂的浓度；“iPr”是指异丙基；“min”是指分钟；“MTBE”是指甲基叔丁基醚；“PBS”是指磷酸盐缓冲盐水；“PDAPP”是指血小板衍生的淀粉样前体蛋白；“Prep”是指制备；“psi”是指磅/平方英寸； “PyBOP”是指苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷子基-鏻六氟磷酸盐；“PyBrop”是指溴-三-吡咯烷子基鏻六氟磷酸盐；“RFU”是指相对荧光单位；“Rt”是指保留时间；“SCX”是指强阳离子交换色谱；“SFC”是指超临界流体色谱；“SEM”是指平均值的标准误差；“THF”是指四氢呋喃；“TMB”是指3,3',5,5'-四甲基联苯胺。
下列制备例和实施例进一步说明本发明。
在下面的反应路线中，除非另作说明，否则，所有的取代基如以前所定义。对本领域普通技术人员来说，通常容易得到试剂和起始原料。其它的可以利用有机和杂环化学的标准技术、使用后面的制备例和实施例所描述的方法(包括任何新的方法)来制备。
反应路线1
反应路线1描述了肟(步骤2的产物)和(步骤5的产物)的形成。每个肟可以用于形成二环异噁唑(步骤3或7的产物)。取代的芳香基可以在反应路线1的步骤1和步骤7所示的合成的不同点引入。“PG”是氨基的保护基，例如，氨基甲酸酯和烯丙基。本领域熟知和了解这些基团。
在两步反应中，使用无机碱，例如，碳酸钾，可以用保护的烯丙胺将带有β卤素的酮烷基化(步骤1)，而后在极性质子溶剂中，例如，乙醇，用盐酸羟胺和有机碱(例如，吡啶)处理，得到肟(步骤2)。然后，利用一些方法，例如，在非极性溶剂中，例如，甲苯或二甲苯，加热步骤2的肟，步骤2的肟产物可以在3+2环化反应中转变为二环异噁唑，形成二环异噁唑(步骤3)。另外，可以如下形成肟：从二甲基缩醛起始，用酸(例如，甲酸)处理，形成醛(步骤4的产物)。在步骤5中，使用盐酸羟胺和碱，例如，三水乙酸钠，步骤4的醛可以转变为步骤5的肟产物。使用次氯酸钠的水溶液，步骤6的二环异噁唑产物可以由肟形成，如步骤6所示。在步骤7中，使保护的二环异噁唑与芳香有机锂试剂或格氏试剂反应，得到步骤7的保护的二环异噁唑产物。
反应路线2
反应路线2说明了步骤10或步骤12的保护的吡咯并噻嗪产物的各种途径。在乙酸中，可以用Zn粉末处理保护的二环异噁唑，或在极性溶剂中，例如，乙醇，在压力和氢化条件下，用Raney镍处理，得到氨基吡咯烷甲醇(步骤11的产物)。然后，在极性溶剂中，例如，THF，使步骤11的氨基吡咯烷甲醇产物与苯甲酰异硫氰酸酯反应，而后加入1,1-羰二咪唑(CDI)，得到稠合的保护的吡咯烷噻嗪(步骤12的产物)。另外，可以使二环异噁唑的胺与苯甲酰异硫氰酸酯反应，得到硫脲(步骤8的产物)，而后，在步骤9中，可以用锌粉末(在乙酸中)打开异噁唑环，得到步骤9的羟基化合物产物。然后，在极性非质子溶剂中，例如，THF或1-氯-N,N,2-三甲基丙烯基胺/DCM，用CDI处理该羟基化合物，形成稠合的保护的吡咯烷噻嗪(步骤10的产物)。稠合的吡咯烷噻嗪还可以由Mitsunobu反应形成，例如，使用三苯基膦和偶氮二甲酸二异丙基酯(DIAD)。
反应路线3
反应路线3描述了吡咯并噻嗪转化为苯胺(步骤13的产物)，然后可以将所述苯胺酰化，而后进行吡咯烷的脱保护和杂芳化。苯胺氮的酰化和噻嗪胺的脱保护，得到式I的化合物。
在叠氮化物源的存在下，例如，叠氮化钠，在合适的吡咯并噻嗪上进行叠氮脱卤。本领域熟知和了解这种叠氮脱卤反应。利用本领域众所周知的和所描述的氢化条件，或使用本领域众所周知的还原剂，例如，LiAlH4、NaBH4和PPh3，可以使所得到的叠氮化物中间体还原为苯胺(步骤13的产物)。
在本领域众所周知的酸性条件下，可以将BOC保护的吡咯烷脱保护(步骤14中的步骤1)。然后，使用有机碱，例如，二异丙基乙胺(dipea)、三乙胺或N,N,N,N'-四甲基胍，在亲核性芳香取代(SNAr)中，使用取代的芳香嘧啶，将脱保护的吡咯烷杂芳化，得到步骤14中的步骤2的产物。在偶合条件下，步骤14的苯胺产物可以与杂芳香的羧酸偶合(步骤15中的步骤1的产物)。本领域技术人员可以认识到，对于由羧酸和胺反应形成酰胺，存在着许多方法和试剂。例如，在偶合试剂和胺碱(例如，DIPEA或三乙胺)的存在下，合适的苯胺与合适的酸反应，在将噻嗪胺脱保护之后，得到式I的化合物。偶合试剂包括碳二亚胺，例如，DCC、DIC、EDCI，以及芳香肟，例如，HOBt和HOAt。另外，可以使用非亲核的阴离子的脲阳离子或膦盐，例如，HBTU、HATU、PyBOP和PyBrOP，代替更常规的偶合试剂。为了促进反应，可以使用添加剂，例如，DMAP。另外，在碱的存在下，例如，三乙胺或吡啶，使用取代的苯甲酰氯，可以将保护的苯胺酰化。然后，在极性非质子溶剂中，例如，乙醇，使用有机碱，例如，吡啶和盐酸甲基羟胺，或使用无机碱，例如氢氧化锂/甲醇，可以将保护的噻嗪胺脱保护，得到式I的化合物。
在任选的步骤中，在合适的溶剂中，在标准条件下，通过合适的式I的游离碱与合适的可药用酸反应，可以形成式I化合物的可药用盐。另外，当氮保护基脱保护时，可以同时形成这种盐。这种盐的形成在本领域为大家所熟知和了解。参见，例如，Gould, P.L., “Salt selection for basic drugs,”International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217(1986); Bastin, R.J.,等人，“Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities,”Organic Process Research and Development, 4: 427-435(2000); 和Berge, S.M.,等人，“Pharmaceutical Salts,” Journal of Pharmaceutical Sciences,66: 1-19,(1977)。本领域普通技术人员可以理解，式I的化合物容易转变为和分离为可药用盐，例如，盐酸盐。
制备例和实施例
下列制备例和实施例进一步说明本发明。
制备例1
1-(3-溴苯基)-2-(二烯丙基氨基)乙酮
将碳酸钾(38.8 g，281 mmol)加入到3-溴苯甲酰甲基溴(60 g 216 mmol)/乙腈(430 ml)中，并将该混合物在氮气氛围中冷却至0℃。用1小时逐滴加入二烯丙基胺(34.6 ml，280.63 mmol)，并将该反应升温至22℃过夜。浓缩该粗品反应混合物，并将残余物在水(300 ml)和MTBE(300 ml)中分配。除去水层，并将有机层用水(100 ml，2×)和盐水(100 ml)洗涤。用硫酸钠干燥有机层，过滤，蒸发溶剂至恒重，得到标题化合物(62 g，98%)。ES/MS(m/e): 294(M+1)。
制备例2
N-(2,2-二甲氧基乙基)氨基甲酸苄基酯
在0℃，将氨基乙醛二甲基缩醛(25 ml，229 mmol)的甲苯(120 ml)溶液用4.85M氢氧化钠溶液(70.8 ml，343.5 mmol)处理。将该混合物在0℃下搅拌10分钟，并加入氯甲酸苄基酯(33.8 ml，229 mmol)，在加入期间，保持内部温度低于20℃。用4小时将该混合物升温至室温。分离有机层，用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，浓缩至干，得到标题化合物(54 g，98%)。ES/MS(m/e): 240(M+H)。
制备例3
N-烯丙基-N-(2,2-二甲氧基乙基)氨基甲酸苄基酯
在氮气氛围中，将N-(2,2-二甲氧基乙基)氨基甲酸苄基酯(50 g，208.9 mmol)的甲苯(180 ml)溶液用固体氢氧化钾(51.6 g，919.69 mmol)处理。10分钟之后，加入苄基三乙基氯化铵(0.8 g，3.1 mmol)。再经过10分钟之后，用10分钟逐滴加入烯丙基溴(33 g，272.8 mmol)的甲苯(50 ml)溶液。将得到的混合物在50℃下搅拌48小时。将该混合物冷却至室温，并用水淬灭。分离有机层，用盐水洗涤，用硫酸镁干燥，浓缩至干，得到标题化合物(44 g，75%)。ES/MS(m/e): 280(M+H)。
制备例4
N-烯丙基-N-(2-氧代乙基)氨基甲酸苄基酯
将N-烯丙基-N-(2,2-二甲氧基乙基)氨基甲酸苄基酯(30 g，107 mmol)的甲酸(36.8 ml，860 mmol)和水(4.84 ml)溶液在室温下搅拌过夜。浓缩该混合物，并用己烷/EtOAc(1:2)和水稀释。分离有机层，用盐水溶液洗涤，直到pH=6为止，并用硫酸钠干燥。蒸发溶剂，得到标题化合物(25g，99%)。ES/MS(m/e): 234(M+H)。
制备例5
1-(3-溴苯基)-2-(二烯丙基氨基)乙酮肟
将1-(3-溴苯基)-2-(二烯丙基氨基)乙酮(60 g，204.7 mmol)的乙醇(720 ml)和吡啶(24.8 ml，307 mmol)溶液在22℃下搅拌15分钟。用1小时将盐酸羟胺(17 g，246 mmol)分为几部分加入到该溶液中。将该反应升温到50℃，保持2小时，而后加热到70℃，保持16小时。蒸发溶剂，并将残余物在水(300 ml)和MTBE(300 ml)中分配。分离有机层，并用水(100 ml，2×)和盐水(100 ml)洗涤。用硫酸钠干燥有机层，过滤，蒸干，得到标题化合物(75.5 g，79%)。ES/MS(m/e): 309(M+1)。
制备例6
2-(二烯丙基氨基)-1-(2-氟苯基)乙酮肟
将二烯丙基胺(1.56 L，12.2 mol)加入到2-溴-1-(2-氟苯基)乙酮(1291 g，5.8 mol)的乙醇(12.9 L)溶液中，保持内部温度低于30℃。将该反应混合物在22℃下搅拌4小时。将盐酸羟胺(543 g，7.58 mol)分为几部分加入到该溶液中，而后在70℃下加热16小时。将该反应冷却至室温，蒸发溶剂，并将残余物在水(5.1 L)和MTBE(6.4 L)中分配。加入碳酸钠，将水层调节至pH=5.5，并用额外的MTBE(1.2 L)提取水层。将有机层合并，并用水和盐水洗涤。用硫酸钠干燥有机层，过滤，蒸干，得到粗品标题化合物(1.45 kg，104%)，其不用进一步纯化，直接使用。ES/MS(m/e): 249(M+1)。
制备例7
N-烯丙基-N-[2-羟基亚氨基乙基]氨基甲酸苄基酯
将N-烯丙基-N-(2-氧代乙基)氨基甲酸苄基酯(25 g，107 mmol)的乙腈(150 ml)溶液用盐酸羟胺(9.68 g，139 mmol)和三水乙酸钠(16 g，117.9 mmol)水溶液(75 ml)处理。将该混合物在室温下搅拌过夜。蒸发乙腈，并将该水溶液用EtOAc提取。分离有机层，用硫酸镁干燥，真空浓缩，得到标题化合物(24 g，90%)。ES/MS(m/e): 249(M+H)。
制备例8
2-溴-1-(5-溴-2-氟苯基)乙烷-1-酮
在35℃，将N-溴代琥珀酰亚胺(984g，5.53mol)逐份加入到1-(5-溴-2-氟苯基)乙-1-酮(1000 g，4.6mol)和对甲苯磺酸(1315 g，7.64mol)的DCM(7 L)溶液中。搅拌该混合物，并加热到40℃。将该混合物冷却至24℃，并加入7% NaHCO3(5 L)。分离各层，并用10% Na2SO3(5 L)和水(5 L)洗涤有机层。将有机层浓缩至1/2-1/3体积，得到标题化合物，其不用进一步纯化，直接使用。
制备例9
5-烯丙基-6a-(5-溴-2-氟苯基)-1-(4-甲氧苯甲基)六氢-1H-吡咯并[3,4-c]异噁唑
向2-溴-1-(5-溴-2-氟苯基)乙烷-1-酮(1363 g，4.61 mol)的甲苯(10 L)溶液中加入二烯丙基胺(537 g，5.53 mol)和DIPEA(2381 g，18.42 mol)。将该混合物在40℃搅拌4小时，得到1-(5-溴-2-氟苯基)-2-(二烯丙基氨基)乙烷-1-酮，不用分离。将N-(4-甲氧苯甲基)羟胺(847g，5.53mol)和Ti(OiPr)4(1965 g，6.91 mol)加入到含有粗品1-(5-溴-2-氟苯基)-2-(二烯丙基氨基)乙烷-1-酮的混合物中。将该混合物在90℃下搅拌2小时。将该混合物冷却至20℃，并加入50%柠檬酸一水合物(4 L)和饱和Na2CO3(4 L)。分离各层，并将水溶液用MTBE(5 L)提取。用水(5 L)洗涤有机提取物，通过硅藻土过滤，并浓缩至干。将EtOAc(10 L)和草酸(580g)加入到残余物中，滤出固体，并加入到1N NaOH(13 L)中。加入MTBE(5 L)，并将该混合物通过硅藻土过滤。分离各层，并将有机层浓缩至1/2体积。加入庚烷(3 L)，并将该溶液冷却至10℃。将得到的固体滤出，得到标题化合物(1330 g，64%)。
制备例10
5-烯丙基-6a-(3-溴苯基)-3,3a,4,6-四氢-1H-吡咯并[3,4-c]异噁唑
将粗品1-(3-溴苯基)-2-(二烯丙基氨基)乙酮肟(75.5 g，195.34 mmol)溶于甲苯(600 ml)中，并回流12小时。真空蒸发溶剂，并将残余物溶于1N HCl水溶液(1L)和MTBE(300 ml)的混合物中。将该混合物搅拌15分钟，并加入硅藻土(10 g)。将该混合物再搅拌20分钟，并通过硅藻土过滤。将滤饼用额外的1N HCl水溶液(200 ml)和MTBE(200 ml)洗涤。分离有机层，并用1N HCl(2×100 ml)洗涤。将水层合并，并用50% w/w NaOH将pH值调节至9。用MTBE(3×250 ml)提取水性混合物。将有机层合并，用硫酸钠干燥，并过滤。蒸发滤液，并真空干燥，得到红色固体(60 g)。将该红色固体用庚烷(600 ml)稀释，并将该混合物加热至回流，保持20分钟。加入炭(2 g)，并将该混合物通过硅藻土过滤。常压浓缩滤液，将最终体积调节至300 ml。将该溶液冷却至22℃，并搅拌3小时。过滤收集浅黄色固体，真空干燥至恒重，得到标题化合物(40 g，60%)。ES/MS(m/e): 309(M+1)。
制备例11
5-烯丙基-6a-(2-氟苯基)-3,3a,4,6-四氢-1H-吡咯并[3,4-c]异噁唑
流动化学反应步骤∶将343 ml无缝不锈钢管式反应器(O.D=1/8英寸)放在GC炉内部，并以20 ml/min的速度用甲苯冲洗20分钟。施加氮气背压(720 psig)，并将GC的温度设定在210℃。温度达到210℃之后，使用一对以连续方式工作的高压注射泵，使2-(二烯丙基氨基)-1-(2-氟苯基)乙酮肟(480.51 g，1.74mol)的甲苯(5.81 L)溶液以22.866 ml/min的速度泵送通过反应器，停留时间15分钟。消耗了所有储备溶液之后，将反应器以22.866 ml/min的速度用甲苯冲洗30分钟。GC炉的温度设置在25℃，收集全部溶液，并真空浓缩。蒸发溶剂，并将残余物溶于二氯甲烷(2.5 L)和水(5 L)中。用盐酸将pH值调节至1，分离水层，并用氢氧化钠中和，将pH值调节至10。用MTBE(3×2.5 L)提取水层。将有机提取物合并，用硫酸钠干燥，过滤，并蒸干，得到粗品标题化合物(248 g，47%)，其不用进一步纯化，直接使用。ES/MS(m/e): 249(M+1)。
制备例12
5-烯丙基-6a-(5-溴-2-氟苯基)六氢-1H-吡咯并[3,4-c]异噁唑盐酸盐
将三氟乙酸(4 L，52.9 mol)逐滴加入到5-烯丙基-6a-(5-溴-2-氟苯基)-1-(4-甲氧苯甲基)六氢-1H-吡咯并[3,4-c]异噁唑(1990 g，4.45 mol)的DCM(12 L)溶液中，加入速度应保持温度低于35℃。加入完成之后，将该混合物升温至33-43℃，并搅拌6小时。加入NaOH(20%，10 L)，加入速度应保持温度低于35℃。分离各层，并将有机层用水(6 L)洗涤。浓缩该溶液，加入乙醇(16 L)，并将该混合物通过硅藻土过滤。浓缩滤液，并加入EtOAc(10 L)。加入4M HCl/EtOAc(8 L)，并滤出所得到的固体，干燥，得到标题化合物(1385 g，85.6%)。ES m/z 327.1(M+1)。
制备例13
3,3a,4,6-四氢吡咯并[3,4-c]异噁唑-5-甲酸苄基酯
用10分钟，将N-烯丙基-N-[2-羟基亚氨基乙基]氨基甲酸苄基酯(24 g，96.6 mmol)的DCM(338 ml)溶液用5% w/w次氯酸钠水溶液(106.08 mmol，143.06 ml)逐滴处理。将得到的混合物在室温下搅拌过夜。将该反应用40%亚硫酸氢钠(7 g)水溶液淬灭。分离有机层，用硫酸镁干燥，并真空浓缩。用硅胶纯化粗品，用5% EtOAc/己烷洗脱，得到标题化合物(18 g，75 %)。ES/MS(m/e): 247(M+H)。
制备例14
6a-(5-溴-2-氟-苯基)-3,3a,4,6-四氢-1H-吡咯并[3,4-c]异噁唑-5-甲酸苄基酯
将1.6M正丁基锂的己烷溶液(25.4 ml，40.6 mmol)逐滴加入到-78℃的4-溴-1-氟-2-碘苯(12.22 g，40.6 mmol)的THF(60 ml)溶液中，得到黄色溶液，并在-78℃下搅拌15分钟。
将三氟化硼醚合物(5.14 ml，40.6 mmol)加入到单独的-78℃的3,3a,4,6-四氢吡咯并[3,4-c]异噁唑-5-甲酸苄基酯(5 g，20.3 mmol)的THF(60 ml)溶液中，并将该混合物在-78℃下搅拌5分钟。将此溶液通过小管加入到先前制备的-78℃的有机锂混合物中。将合并的混合物在-78℃下搅拌30分钟。将该混合物用饱和氯化铵水溶液淬灭，并升温至室温。将该混合物用EtOAc(3×)提取，将有机提取物合并，用硫酸钠干燥，过滤，并真空除去溶剂。用硅胶纯化粗品，使用5%至100% EtOAc/己烷的梯度，经过35分钟，得到标题化合物(2.27 g，27%)。ES/MS(m/e):(79Br/81Br)421/423(M+H)。
制备例15
1-(苯甲酰硫代氨基甲酰基)-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-3,3a,4,6-四氢吡咯并[3,4-c]异噁唑-5-甲酸苄基酯
将苯甲酰异硫氰酸酯(2.87 ml，21.28 mmol)逐滴加入到6a-(5-溴-2-氟-苯基)-3,3a,4,6-四氢-1H-吡咯并[3,4-c]异噁唑-5-甲酸苄基酯(5.977 g，14.2 mmol)的THF(95 ml)溶液中，并在氮气氛围中搅拌过夜。真空除去溶剂。用硅胶纯化粗品，使用5%至100% EtOAc/己烷的梯度，经过30分钟，得到标题化合物(6.05 g，73%)。ES/MS(m/e):(79Br/81Br)584/586(M+H)。
制备例16
3-(苯甲酰硫代氨基甲酰基氨基)-3-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(羟甲基)吡咯烷-1-甲酸苄基酯
在室温下，在氮气氛围中，将1-(苯甲酰硫代氨基甲酰基)-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-3,3a,4,6-四氢吡咯并[3,4-c]异噁唑-5-甲酸苄基酯(6.05 g 10.4 mmol)和锌(粉末，<10微米)(6.77 g，103.5 mmol)的混合物在乙酸(52 ml)中搅拌过夜。将该反应用EtOAc稀释，并通过硅藻土过滤。真空除去溶剂，并将残余物用EtOAc、水和饱和碳酸氢钠水溶液稀释。将该混合物用EtOAc(3×)提取，将有机层合并，用硫酸钠干燥，过滤，并真空除去溶剂。用硅胶纯化粗品，使用5%至100% EtOAc/己烷的梯度，经过30分钟，得到标题化合物(5.222 g，86%)。ES/MS(m/e):(79Br/81Br)586/588(M+H)。
制备例17
(1-烯丙基-4-氨基-4-(5-溴-2-氟苯基)吡咯烷-3-基)甲醇
将饱和碳酸钠水溶液加入到5-烯丙基-6a-(5-溴-2-氟苯基)六氢-1H-吡咯并[3,4-c]异噁唑盐酸盐(1400g，3.85 mol)的DCM(7 L)溶液中，达到pH>9。分离各层，并将有机提取物浓缩至2/3体积。加入乙酸(1.38 L)，并将该溶液浓缩至2 L。加入乙酸(7 L)和锌粉(2.5 kg，38.5 mol)，将该混合物加热至40-50℃，并搅拌3小时。加入EtOAc(9.8L)，并将该混合物通过硅藻土过滤。将滤饼用EtOAc(4 L)洗涤。分离滤液，并将水(7 L)加入到合并的有机物中。加入氢氧化铵，达到pH≥9。分离各层，并将有机层浓缩至2 L。加入乙醇(2.8 L)，并将该溶液浓缩至2 L。加入乙醇(19 L)，并将该混合物通过硅藻土过滤，得到标题化合物的乙醇溶液，其不用进一步纯化，直接使用。
制备例18
[1-烯丙基-4-氨基-4-(3-溴苯基)吡咯烷-3-基]甲醇
在22℃，将5-烯丙基-6a-(3-溴苯基)-3,3a,4,6-四氢-1H-吡咯并[3,4-c]异噁唑(40 g，129.4 mmol)的乙酸(400 ml)溶液通过一次性加入锌粉(42.3 g，646.8 mmol)处理。将该反应在室温下剧烈搅拌1小时。加入EtOAc(400 ml)，并将该混合物通过硅藻土过滤。蒸发滤液，并将残余物真空干燥。将残余物在水(300 ml)和MTBE(300 ml)中分配。将pH值用50% w/w氢氧化钠调节至8，分离有机层，用硫酸钠干燥，并过滤。蒸发滤液，并将残余物真空干燥，得到标题化合物(41 g，97%)。ES/MS(m/e): 311(M+1)。
制备例19
1-烯丙基-4-氨基-4-(2-氟苯基)吡咯烷-3-基]甲醇
将锌粉(590 g，9 mol)加入到5-烯丙基-6a-(2-氟苯基)-3,3a,4,6-四氢-1H-吡咯并[3,4-c]异噁唑(3559 g，1.29 mol)的溶液(在甲醇(2.85 L)和饱和氯化铵水溶液(3.56 L)的混合物中)中，并将该混合物在70℃下加热16小时。将该反应冷却至60℃，用THF(2.85 L)稀释，趁热在硅藻土上过滤。蒸发滤液，除去有机溶剂，并将该水性混合物用10% w/w枸橼酸水溶液(4 L)和EtOAc(3.5 L)稀释。分离有机层，并将水层用EtOAc(2×2 L)洗涤。将水层用50% w/w氢氧化钠中和，将pH值调节至10，而后用EtOAc(2×1.5 L)提取。将有机提取物合并，用硫酸钠干燥，过滤，并蒸干，得到粗品标题化合物(299 g，92%)。ES/MS(m/e): 251(M+1)。
制备例20
[(3S,4R)-1-烯丙基-3-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(羟甲基)吡咯烷-3-基]铵；(2S,3S)-4-羟基-2,3-二[(4-甲基苯甲酰基)氧基]-4-氧代-丁酸盐
将二-对甲苯酰-L-酒石酸一水合物(1.04 kg，2.69 mol)加入到(1-烯丙基-4-氨基-4-(5-溴-2-氟苯基)吡咯烷-3-基)甲醇(1264 g，3.85 mmol)的乙醇(21 L)溶液中。将该混合物加热至65-75℃，并搅拌3小时。将该混合物冷却至5-10℃，加入[(3S,4R)-1-烯丙基-3-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(羟甲基)吡咯烷-3-基]铵；(2S,3S)-4-羟基-2,3-二[(4-甲基苯甲酰基)氧基]-4-氧代-丁酸盐(1.0 g)的晶种，并将该混合物搅拌3小时。滤出固体，并将滤饼用冷乙醇(1.4 L)洗涤。干燥滤饼，得到标题化合物的白色固体。第二个洗脱的异构体的手性分析∶ 柱∶IC Chiralpak，4.6 mm * 250 mm * 5µm；洗脱液∶90%己烷(0.3%二乙胺)∶10%乙醇(0.3%二乙胺)；流速∶1.0 ml/min，UV 270 nm证明了对映体富集(99% ee)的对映体的Rt=7.4分钟(1050g，38%)。
制备例21
[(3R,4S)-1-烯丙基-4-氨基-4-(2-氟苯基)吡咯烷-3-基]甲醇；2,3-二[(4-甲基苯甲酰基)氧基]丁二酸
将二-对甲苯酰-L-酒石酸(348.6 g，884 mmol)的1-甲氧基-2-丙醇(1.13 L)溶液加入到预先在40℃加热的[(3R,4S)-1-烯丙基-4-氨基-4-(2-氟苯基)吡咯烷-3-基]甲醇(225.9 g，902 mmol)的1-甲氧基-2-丙醇(1.13 L)溶液中。将该反应冷却至22℃，并搅拌18小时。过滤收集白色固体，并用1-甲氧基-2-丙醇(600ml)洗涤。将收集的固体干燥，得到标题化合物(183.01 g，31.8%)。ES/MS(m/e): 251(M+1)。
制备例22
[(3R,4S)-1-烯丙基-4-氨基-4-(3-溴苯基)吡咯烷-3-基]甲醇；(2R,3R)-2,3-二[(4-甲基苯甲酰基)氧基]丁二酸
将[1-烯丙基-4-氨基-4-(3-溴苯基)吡咯烷-3-基]甲醇(77 g，235 mmol)的异丙醇(914 ml)溶液加热至70℃。加入二-对甲苯酰-L-酒石酸(86.2 g，223 mmol)，并将该混合物冷却至22℃，保持2小时，并搅拌过夜。过滤该浆液，收集浅黄色固体，并用异丙醇洗涤。将固体真空干燥，得到标题化合物(63 g，36%)。ES/MS(m/e): 311(M+1)。用反相手性色谱分析产物∶ 第一个洗脱的异构体的分析(柱∶Chiralpak ID-3，4.6 x 50 mm；洗脱液∶70:30，20 mM碳酸氢铵水溶液∶乙腈；流速∶1.5 ml/min，UV 215 nm)证明，对映体富集(96% ee)的对映体的Rt=1.26分钟。
制备例23
((3R,4S)-1-烯丙基-4-氨基-4-(5-溴-2-氟苯基)吡咯烷-3-基)甲醇
将1N HCl(500 ml，500 mmol)加入到0℃的[(3S,4R)-1-烯丙基-3-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(羟甲基)吡咯烷-3-基]铵；(2S,3S)-4-羟基-2,3-二[(4-甲基苯甲酰基)氧基]-4-氧代-丁酸盐(100 g，139.4 mmol)的EtOAc(500 ml)溶液中。将该混合物搅拌1小时。分离水层，并将pH值用1N NaOH调节至8。用EtOAc(350 ml×2)提取水层。合并有机层，用水(500 ml)洗涤，浓缩，得到标题化合物(40g，87%)。第二个洗脱的异构体的手性分析∶柱∶IC Chiralpak，4.6 mm * 250 mm * 5μm；洗脱液∶90%己烷(0.3%二乙胺)∶10%乙醇(0.3%二乙胺)；流速∶1.0 ml/min，UV 270 nm证明了对映体富集(99.7% ee)的对映体，Rt=7.4分钟。
制备例24
[(3R,4S)-1-烯丙基-4-氨基-4-(2-氟苯基)吡咯烷-3-基]甲醇
将[(3R,4S)-1-烯丙基-4-氨基-4-(2-氟苯基)吡咯烷-3-基]甲醇；2,3-二[(4-甲基苯甲酰基)氧基]丁二酸(211 g，331 mmol)溶于水(2.1L)和EtOAc(2.3L)中。加入35% w/w盐酸，将pH值调节至1。分离水层，用50% w/w氢氧化钠将pH值调节至10，并用EtOAc(2×)提取。将水层的pH值用NaOH水溶液调节至10，并用MTBE(3×)提取，同时保持该水溶液的pH值=10。将有机提取物合并，用硫酸钠干燥，过滤，并浓缩至干，得到粗品标题化合物(73 g，88%，94.8%ee)。用手性色谱分析产物∶ 柱∶AS-H，洗脱液∶10%异丙醇、2%异丙胺；流速∶3 ml/min，UV 220；压力∶100 bar，在35℃下，得到标题化合物为第二个洗脱的异构体，Rf=2.26分钟。ES/MS(m/e): 251(M+1)。
制备例25
N-(((3S,4R)-1-烯丙基-3-(5-溴-2-氟苯基)-4-(羟甲基)吡咯烷-3-基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺
将苯甲酰异硫氰酸酯(15.0 g，91.9 mmol)加入到0℃的((3R,4S)-1-烯丙基-4-氨基-4-(5-溴-2-氟苯基)吡咯烷-3-基)甲醇(30 g，91.1 mmol)的THF(400 ml)溶液中。将该溶液升温至25℃，并搅拌1小时，得到标题化合物的THF溶液，其不用进一步纯化，直接使用。
制备例26
[(3R,4S)-1-烯丙基-4-氨基-4-(3-溴苯基)吡咯烷-3-基]甲醇
将[(3R,4S)-1-烯丙基-4-氨基-4-(3-溴苯基)吡咯烷-3-基]甲醇；(2R,3R)-2,3-二[(4-甲基苯甲酰基)氧基]丁二酸(63 g 85.8 mmol)与1N HCl水溶液(800 ml)和EtOAc(400 ml)混合，并将该混合物在22℃下搅拌15分钟。分离各层，并用50% w/w氢氧化钠将水层的pH值调节至10。用MTBE(3×250 ml)提取该水性混合物。将合并的有机层用硫酸镁干燥，过滤，并蒸干，得到标题化合物(27 g，99%)。ES/MS(m/e): 311(M+1)。
制备例27
N-[(4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(3-溴苯基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺
在氮气氛围中，将[(3R,4S)-1-烯丙基-4-氨基-4-(3-溴苯基)吡咯烷-3-基]甲醇(27 g；86.7 mmol)的THF(270 ml)溶液冷却至-5℃。逐滴加入苯甲酰异硫氰酸酯(12.3 ml，91 mmol)，保持温度低于0℃。将该反应升温至22℃，保持1小时。一次性加入1,1'-羰二咪唑(28.1 g，173.5 mmol)，并将该反应在22℃下搅拌1小时，而后加热到回流，保持16小时。真空除去溶剂，并将残余物真空干燥。将粗品在MTBE(500 ml)和水(250 ml)中分配。分离有机层，用硫酸镁干燥，过滤，并蒸干。用硅胶纯化粗品，使用90/10至60/40的DCM/EtOAc的梯度，得到标题化合物(27 g，68%)。ES/MS(m/e): 456(M+1)。
制备例28
N-((4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(5-溴-2-氟苯基)-4,4a,5,6,7,7a-六氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺二盐酸盐
将三苯基膦(36.8 g，140.3 mmol)加入到N-(((3S,4R)-1-烯丙基-3-(5-溴-2-氟苯基)-4-(羟甲基)吡咯烷-3-基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺(91.1 mmol)的THF(400 ml)溶液中。加入偶氮二甲酸二叔丁基酯(31.6 g，137.2 mmol)/THF(100 ml)。将该混合物在20-30℃下搅拌2小时。浓缩该混合物，并加入MTBE(400 ml)。通过硅藻土过滤该溶液，并将滤饼用MTBE(130 ml)洗涤。将滤液合并，并加入1N HCl/EtOAc(200 ml)。将该混合物搅拌2小时，而后浓缩至500 ml。加入MTBE(320 ml)，并过滤该溶液，并用庚烷(130 ml)洗涤。使固体在EtOAc(650 ml)中形成浆液，并在50-60℃下搅拌2小时。将热浆液过滤，并将固体用EtOAc(130 ml)和庚烷(130 ml)洗涤。使固体在EtOAc(650 ml)中再形成浆液，并在50-60℃下搅拌2小时。将热浆液过滤，并用EtOAc(130 ml)和庚烷(130 ml)洗涤。将固体干燥，得到标题化合物的二-HCl盐(40 g，80%，99.5% ee)。第一个洗脱的异构体的手性分析∶ 柱∶IC Chiralpak，4.6 mm * 250 mm * 5μm；洗脱液∶85%己烷(0.1%二乙胺)∶15%异丙醇(0.1%二乙胺)；流速∶1.0 ml/min，UV 282 nm证明了对映体富集(99.5% ee)的对映体，Rt=12.5分钟。
制备例29
N-((4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(2-氟-5-(2,2,2-三氟乙酰胺基)苯基)-4,4a,5,6,7,7a-六氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺
将15%碳酸钠(440 ml)加入到N-((4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(5-溴-2-氟苯基)-4,4a,5,6,7,7a-六氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺二盐酸盐(495 g，717.88 mmol)的EtOAc(3 L)和水(784 ml)溶液中。将该混合物搅拌1-2小时。分离各层，通过硅胶(40 g)过滤有机层，并用EtOAc(600 ml)洗涤。将滤液浓缩至干，得到N-((4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(5-溴-2-氟苯基)-4,4a,5,6,7,7a-六氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺。将三氟乙酰胺(136.7 g，1.21mol)、NaI(182.5 g，1.22mol)、4Å分子筛(342g)和K2CO3(170.9g，1.24mol)加入到N-((4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(5-溴-2-氟苯基)-4,4a,5,6,7,7a-六氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺(341 g，494.54mmol)的DMSO(525 ml)和1,4-二噁烷(1.025 L)溶液中。将反式-N,N'-二甲基环己烷(81.6 g，573.66 mmol)和碘化亚铜(27.3 g，143.34 mmol)/DMSO(500 ml)加入到该反应混合物中。将该混合物搅拌5分钟。将该混合物升温至100℃，搅拌8小时，并冷却至24℃。加入水(5.9 L)和DCM(5.9 L)，过滤该混合物，并分离各层。将有机层用水(5.9 L)洗涤，获得标题化合物的DCM溶液，其不用进一步纯化，直接使用。
制备例30
N-((4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(5-氨基-2-氟苯基)-4,4a,5,6,7,7a-六氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺盐酸盐
将氢氧化钠(28.7 g)和水(2.7 L)加入到N-((4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(2-氟-5-(2,2,2-三氟乙酰胺基)苯基)-4,4a,5,6,7,7a-六氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺(250 g，494.4mmol)的DCM溶液中，并将该混合物在24℃下搅拌68小时。加入1N HCl(3.5 L)，获得1-3的pH值。分离各层，并将水层用DCM(680 ml)洗涤。将DCM(4 L)加入到该水溶液中，而后加入21%氢氧化铵，获得8-10的pH值。分离各层，将有机提取物合并，通过硅胶(170 g)过滤，并用DCM(1.4 L)洗涤。将溶剂浓缩至干，并用EtOAc(4 L)稀释。在低于25℃的温度下，加入1N HCl/EtOAc(700 ml)，并将该混合物搅拌1小时。将该混合物浓缩至大约1/7-1/8体积，并加入EtOAc(2.8 L)。将得到的沉淀滤出，并用EtOAc(400 ml)洗涤。将固体干燥，得到标题化合物(246 g，52%)。
制备例31
N-((4aR,7aS)-7a-(5-乙酰氨基-2-氟苯基)-6-烯丙基-4,4a,5,6,7,7a-六氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺
将乙酸酐(23.5g，0.23 mol)加入到N-((4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(5-氨基-2-氟苯基)-4,4a,5,6,7,7a-六氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺盐酸盐(100 g，0.153 mol)和三乙胺(54.3g，0.535 mol)的DCM(800ml)溶液中。在20-25℃下搅拌1小时之后，加入饱和NaHCO3(700 ml)和水(600 ml)。分离各层，得到标题化合物的DCM溶液，其不用进一步纯化，直接使用。
制备例32
N-[(4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(2-氟苯基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺
在氮气氛围中，在0℃，将[(3R,4S)-1-烯丙基-4-氨基-4-(2-氟苯基)吡咯烷-3-基]甲醇(129.7 g，414 mmol)的THF(2.3L)溶液冷却。加入苯甲酰异硫氰酸酯(61.5 ml，456 mmol)，保持温度低于5℃。用3小时将该反应升温至室温，加入1,1'-羰二咪唑(87.4 g，538.9 mmol)，并将该反应在22℃下搅拌1小时，而后在70℃下加热16小时。将该反应混合物冷却至22℃，并蒸发溶剂。将残余物在EtOAc(1L)和水(1L)中分配。分离有机层，并将水层用EtOAc(2×400 ml)提取。将有机物合并，用硫酸钠干燥，过滤，并蒸干，得到粗品标题化合物。用硅胶色谱纯化粗品，用EtOAc/DCM(0-40% DCM)的梯度进行洗脱，得到标题化合物的浅黄色固体(170 g，99%)，其含有残余溶剂。ES/MS(m/e): 396(M+1)。
制备例33
2-苯甲酰胺基-7a-(5-溴-2-氟-苯基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸苄基酯
将1,1'-羰二咪唑(2.87 g，17.7 mmol)加入到3-(苯甲酰硫代氨基甲酰基氨基)-3-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(羟甲基)吡咯烷-1-甲酸苄基酯(5.198 g，8.86 mmol)的THF(52 ml)溶液中。将该混合物在室温下搅拌1.5小时，而后将该反应在氮气氛围中、在回流下加热过夜。冷却该反应，用水稀释，并用EtOAc(3×)提取。将有机层合并，用硫酸钠干燥，过滤，并真空除去溶剂。用硅胶纯化粗品，使用5%至100% EtOAc/己烷的梯度，经过30分钟，得到标题化合物(2.93 g，58%)。ES/MS(m/e):(79Br/81Br).568/570(M+H)。
制备例34
N-((4aR,7aS)-7a-(5-乙酰氨基-2-氟苯基)-4,4a,5,6,7,7a-六氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺
将三苯基膦(4.0g，0.015 mol)和1,3-二甲基巴比妥酸(15.2 g，0.097 mol)加入到N-((4aR,7aS)-7a-(5-乙酰氨基-2-氟苯基)-6-烯丙基-4,4a,5,6,7,7a-六氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺(0.153 mol)的DCM溶液中。加入乙酸钯(1.7g，7.7 mmol)，并将该混合物在20至30℃下搅拌1小时。加入25%氢氧化铵，并分离各层。用HOAc(3.0当量，在500 ml水中)洗涤有机层，并用25%氢氧化铵将pH值调节至8-9。将水层用DCM(2× 500 ml)提取。将有机提取物合并，并浓缩至1/3-1/4体积。加入MTBE(1 L)，并将该混合物过滤。浓缩该混合物，并加入庚烷(1 L)。滤出所得到的固体，收集，并干燥，得到标题化合物(48 g，76%)。
制备例35
N-[(4aR,7aS)-7a-(3-溴苯基)-4a,5,6,7-四氢-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺
在室温下，通过向得到的浆液中鼓入氮气5分钟，将N-[(4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(3-溴苯基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(1 g，2.19 mmol)和N,N-二甲基巴比妥酸(0.868 g，5.48 mmol)的室温混合物在氯仿(22 ml)中脱气。将该混合物用四(三苯基膦)钯(0.261 g，219μmol)处理，并在氮气氛围中搅拌1.5小时。在单独的烧瓶中，在室温下，通过向所得到的浆液中鼓入氮气5 min，将N-[(4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(3-溴苯基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(22.2 g，48.6 mmol)和N,N-二甲基巴比妥酸(19.28 g，121.6 mmol)的混合物在氯仿(486 ml)中脱气。将该混合物用四(三苯基膦)钯(5.79 g，4.86 mmol)处理，并在氮气氛围中搅拌2小时。将两个反应合并，并真空除去溶剂，得到粗品。用硅胶纯化粗品，使用0.5%至10% 甲醇/DCM的梯度，经过30分钟，得到标题化合物(22.4 g，100%)。ES/MS(m/e):(79Br/81Br)416/418(M+H)。
制备例36
N-[(4aR,7aS)-7a-(2-氟苯基)-4a,5,6,7-四氢-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺
在氮气氛围中，将苯甲酸、2-巯基-(122 g，793 mmol)、二(二亚苄基丙酮)钯(4.15 g，7.21 mmol)和1,4-二(二苯基膦基)丁烷(3.14 g，7.21 mmol)加入到N-[(4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(2-氟苯基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(178.21 g，360 mmol)的无水2-甲基四氢呋喃(1.96 L)溶液中。通过真空/氮气循环三次，将该溶液脱气，而后向该反应中鼓入氮气15分钟。将该反应混合物加热至40℃，同时向该反应中鼓入氮气。当反应达到40℃时，停止鼓入氮气，并在氮气氛围中，将该反应混合物在40℃下搅拌3小时。将该反应冷却至22℃，并用水(2 L)稀释。加入HCl(5M)溶液，将pH值调节至1。分离水层，并用额外的EtOAc(2×800 ml)洗涤。将水层的pH值用50% w/w氢氧化钠调节至10，而后是用EtOAc(10L)提取。用额外的EtOAc(2×750mL)洗涤水层。将有机提取物合并，用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，并蒸干，得到粗品标题化合物的浅黄色固体(124.7 g，97%)。ES/MS(m/e): 356(M+1)。
制备例37
N-[7a-(5-溴-2-氟-苯基)-4a,5,6,7-四氢-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺
将碘代三甲基甲硅烷(2.21 ml，15.46 mmol)逐滴加入到室温的2-苯甲酰胺基-7a-(5-溴-2-氟-苯基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸苄基酯(2.93 g，5.15 mmol)的乙腈(44 ml)溶液中。在室温下搅拌该反应两个小时，并真空除去溶剂。用SCX柱纯化粗品，使用3∶1的DCM∶甲醇，而后2∶1的DCM∶7N氨/甲醇，得到标题化合物(2.098 g，94%)。ES/MS(m/e):(79Br/81Br)434/436(M+H)。
制备例38
(4aR,7aS)-2-苯甲酰胺基-7a-(3-溴苯基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸叔丁基酯
将室温的N-[(4aR,7aS)-7a-(3-溴苯基)-4a,5,6,7-四氢-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(22.4 g，36.69 mmol)的DCM(367 ml)溶液用二碳酸二叔丁基酯(8.81 g，40.36 mmol)处理，而后用三乙胺(7.67 ml，55.04 mmol)处理，并将该反应在室温下、在氮气氛围中搅拌1小时。真空除去溶剂，用硅胶纯化粗品，使用5%至100% EtOAc/己烷的梯度，经过25分钟，得到标题化合物(20.22 g，100%)。ES/MS(m/e):(79Br/81Br)516/518(M+H)。
制备例39
2-苯甲酰胺基-7a-(5-溴-2-氟-苯基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸叔丁基酯
将二碳酸二叔丁基酯(1.16 g，5.31 mmol)和三乙胺(1.01 ml，7.25 mmol)加入到N-[7a-(5-溴-2-氟-苯基)-4a,5,6,7-四氢-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(2.098 g，4.83 mmol)的DCM(48 ml)溶液中。将该反应在室温下、在氮气氛围中搅拌1小时。真空除去溶剂，用硅胶纯化粗品，使用5%至100% EtOAc/己烷的梯度，经过30分钟，得到标题化合物(2.556 g，99%)。ES/MS(m/e):(79Br/81Br)534/536(M+H)。
制备例40
(4aR,7aS)-7a-(3-氨基苯基)-2-苯甲酰胺基-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸叔丁基酯
将(4aR,7aS)-2-苯甲酰胺基-7a-(3-溴苯基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸叔丁基酯(5 g，9.7 mmol)和反式-N,N'-二甲基-1,2-环己二胺(220.3 mg，1.5 mmol)的乙醇(100 ml)溶液用叠氮化钠(1.30 g，19.4 mmol)处理。加入L-抗坏血酸钠盐的水溶液(0.66M，3.2 ml，2.1 mmol)和水(10 ml)，并将烧瓶的顶部用氮气吹扫。将该混合物用硫酸铜(II)五水合物的水溶液(0.33M，3.2 ml，1.1 mmol)处理，并在80℃下，在氮气氛围中，将该混合物立即在预热的加热板上加热1.5小时。一旦加热，获得均匀混合物。将该反应冷却，并加入冰水。将该混合物用EtOAc(3×)提取。将有机层合并，用硫酸钠干燥，过滤，真空除去溶剂，得到粗品叠氮化物。将该粗品叠氮化物与10%钯/碳(2 g)/冷乙醇(150 ml)混合，并使用真空/氮气，而后真空/氢气，吹扫该混合物。将该混合物在室温下、在30 psi的氢气氛围中搅拌2小时。排出反应物，并将该混合物通过硅藻土过滤，使用DCM，冲洗滤饼。从滤液中真空除去溶剂，并将粗品用硅胶纯化，使用50% EtOAc/DCM，得到标题化合物(4 g，91%)。ES/MS(m/e): 453(M+H)。
制备例41
7a-(5-氨基-2-氟-苯基)-2-苯甲酰胺基-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸叔丁基酯
将2-苯甲酰胺基-7a-(5-溴-2-氟-苯基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸叔丁基酯(2.556 g，4.8 mmol)和反式-N,N'-二甲基-1,2-环己二胺(150 mg，1.1 mmol)的乙醇(50 ml)溶液用叠氮化钠(933 mg，14.3 mmol)处理。加入L-抗坏血酸钠盐的水溶液(0.66M，3.2 ml，2.1 mmol)和水(1 ml)，并将烧瓶的顶部用氮气吹扫。将该混合物用硫酸铜(II)五水合物的水溶液(0.33M，3.2 ml，1.1 mmol)处理，并在80℃下，在氮气氛围中，将该混合物立即在预热的加热板上加热1.5小时。一旦加热，获得均匀混合物。冷却该反应，用冰水稀释，并将该混合物用EtOAc(3×)提取。将有机提取物合并，用硫酸钠干燥，过滤，真空除去溶剂，得到粗品叠氮化物。将该粗品叠氮化物与10%钯/碳(1 g)/冷乙醇(150 ml)混合，并使用真空/氮气，而后真空/氢气，吹扫该混合物。将该混合物在室温下、在30 psi的氢气氛围中搅拌5小时。排出反应物，通过硅藻土过滤，并将滤饼用DCM冲洗。从滤液中真空除去溶剂，并将粗品用硅胶纯化，使用50% EtOAc/DCM，得到标题化合物(2.014 g，89%)。ES/MS(m/e): 471(M+H)。
制备例42
(4aR,7aS)-2-苯甲酰胺基-7a-[3-[(5-氟吡啶-2-羰基)氨基]苯基]-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸叔丁基酯
将(4aR,7aS)-7a-(3-氨基苯基)-2-苯甲酰胺基-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸叔丁基酯(93 mg，0.21 mmol)、5-氟吡啶-2-甲酸(31.9 mg，0.23 mmol)、1-羟基苯并三唑水合物(56.7 mg，0.41 mmol)和EDCI(40 mg，0.21 mmol)的DCM(4 ml)(含有二甲基甲酰胺(1 ml))浆液用DIPEA(179.2μl，1.03 mmol)处理，并将得到的混合物在室温下搅拌过夜。将该反应混合物用DCM(5 ml)和饱和碳酸氢钠水溶液(15 ml)稀释。分离有机层，用饱和氯化钠水溶液(10 ml)洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，真空除去溶剂，得到粗品标题化合物(105 mg，89%)。ES/MS(m/e): 576(M+H)。
制备例43
N-[3-[(4aR,7aS)-2-苯甲酰胺基-4a,5,6,7-四氢-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]苯基]-5-氟-吡啶-2-甲酰胺；2,2,2-三氟乙酸
将(4aR,7aS)-2-苯甲酰胺基-7a-[3-[(5-氟吡啶-2-羰基)氨基]苯基]-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸叔丁基酯(105mg，0.18 mmol)溶于DCM(2 ml)中，并用三氟乙酸(500μl，6.6 mmol)处理。将得到的黄色溶液在室温下搅拌4小时，并真空除去溶剂，得到粗品标题产物(190 mg，100%)。ES/MS(m/e): 476(M+H)。
制备例44
N-[(4aR,7aS)-7a-(3-氨基苯基)-4a,5,6,7-四氢-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺
将三氟乙酸(25 ml)加入到(4aR,7aS)-7a-(3-氨基苯基)-2-苯甲酰胺基-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸叔丁基酯(4 g，8.84 mmol)的DCM(100 ml)溶液中，并将该混合物在室温下、在氮气氛围中搅拌4小时。真空除去溶剂，用SCX柱纯化粗品，使用3∶1的DCM∶甲醇，而后使用2∶1的DCM∶7N氨/甲醇，得到标题化合物(2.49 g，80%)。ES/MS(m/e): 353(M+H)。
制备例45
N-[7a-(5-氨基-2-氟-苯基)-4a,5,6,7-四氢-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺
将三氟乙酸(10 ml)加入到7a-(5-氨基-2-氟-苯基)-2-苯甲酰胺基-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸叔丁基酯(2.013 g，4.28 mmol)的DCM(30 ml)溶液中，并将该混合物在室温下、在氮气氛围中搅拌4小时。真空除去溶剂，用SCX柱纯化粗品，使用3∶1的DCM∶甲醇，而后使用2∶1的DCM∶7N氨/甲醇，得到标题化合物(1.555 g，98%)。ES/MS(m/e): 371(M+H)。
制备例46
N-[(4aR,7aS)-7a-(3-氨基苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺
在氮气氛围中，将N-[(4aR,7aS)-7a-(3-氨基苯基)-4a,5,6,7-四氢-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(2.49 g，7.06 mmol)、5-氟-2-氯嘧啶(3.74 g，28.26 mmol)和DIPEA(6.16 ml，35.32 mmol)的1,4-二噁烷(60 ml)溶液加热至回流，保持4小时。冷却该反应，用水稀释，并用EtOAc(3×)提取。用硫酸钠干燥合并的有机提取物，过滤，并真空除去溶剂，得到粗品。用硅胶纯化粗品，使用5%至100% EtOAc/己烷的梯度，经过25分钟，得到标题化合物(2.51 g，79%)。ES/MS(m/e): 449(M+H)。
制备例47
N-[(4aR,7aS)-7a-(2-氟苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺
将N-[(4aR,7aS)-7a-(2-氟苯基)-4a,5,6,7-四氢-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(124.7 g，256 mmol)、DIPEA(67ml)、5-氟-2-氯嘧啶(29.3 ml，307 mmol)的N-甲基吡咯烷酮(997 ml)溶液加热至100℃，保持16小时。将该反应冷却至22℃，并倒入在10℃的冷水(10 L)中，保持温度低于15℃。过滤收集淡色的膏状固体，并用额外的水洗涤。将湿润的固体溶于EtOAc(2 L)中，并转入分液漏斗中。加入5% w/w氯化钠水溶液(1 L)，分离有机层，用硫酸钠干燥，过滤，并减压蒸发滤液。用硅胶色谱纯化产物，使用0-40%的EtOAc/异己烷的梯度，得到标题化合物的浅黄色固体(116 g，70%)。ES/MS(m/e): 452(M+1)。
制备例48
N-((4aR,7aS)-7a-(5-乙酰氨基-2-氟苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,6,7,7a-六氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺
将2-氯-5-氟嘧啶(28.9 g，218 mmol)和碳酸钾(33.46 g，242.1 mmol)加入到N-((4aR,7aS)-7a-(5-乙酰氨基-2-氟苯基)-4,4a,5,6,7,7a-六氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺(50 g，121.22 mmol)的DMF(100 ml)溶液中。将该混合物加热至80-85℃，保持8小时。将该混合物冷却至24℃，过滤，并用DMF(100 ml)洗涤。使固体在水(2 L)中形成浆液，过滤，获得标题化合物(68.5g，98%)。
制备例49
(4aR,7aS)-7a-(5-氨基-2-氟苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,6,7,7a-六氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺
将氢氧化锂(8.6 g，204.9 mmol)加入到N-((4aR,7aS)-7a-(5-乙酰氨基-2-氟苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,6,7,7a-六氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺(80 g，157.3 mmol)的甲醇(400 ml)溶液中。将该混合物加热至60-70℃，保持4小时。加入浓HCl(132 g)，并将该混合物在55℃下搅拌18小时。将该混合物冷却至30℃，并浓缩，除去甲醇。加入水，并将水层用DCM(3×)提取，获得标题化合物的920 g的水溶液，其中，总质量的5.6%是标题化合物，其不用进一步纯化，直接使用。
制备例50
N-[3-[(4aR,7aS)-2-苯甲酰胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]苯基]-5-氟-吡啶-2-甲酰胺
将N-[3-[(4aR,7aS)-2-苯甲酰胺基-4a,5,6,7-四氢-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]苯基]-5-氟-吡啶-2-甲酰胺；2,2,2-三氟乙酸(150 mg，254μmol)、5-氟-2-氯嘧啶(68mg，51μmol)和DIPEA(98μl，56μmol)的DMSO(5 ml)溶液在40℃下加热过夜。加入额外的5-氟-2-氯嘧啶(68 mg，51μmol)和DIPEA(98μl，56μmol)，并将该混合物在50℃下加热过夜。加入额外的5-氟-2-氯嘧啶(68 mg，51μmol)和DIPEA(98μl，56μmol)，并将该混合物在50℃下加热过夜(第三个晚上)。冷却该反应，用饱和碳酸钠水溶液(50 ml)稀释，得到浆液，过滤，并在真空烘箱中、在50℃下干燥4小时，得到标题化合物(60 mg，41%)。ES/MS(m/e): 449(M+H)。
另一个制备例50
将N-[(4aR,7aS)-7a-(3-氨基苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(282 mg，628.73µmol)和5-氟吡啶-2-甲酸(106.46 mg，754.47 µmol)在DCM(3 ml)和二甲基甲酰胺(0.5 ml)中混合。加入HOBT(112.70 mg，817.35 µmol)，而后加入EDCI(159.07 mg，817.35 µmol)，并将得到的混合物在室温下、在氮气氛围中搅拌5小时。用水稀释该反应混合物，并用1N NaOH将pH值调节至～12。将该混合物用EtOAc(3×)提取。将有机提取物合并，用硫酸钠干燥，过滤，并真空除去溶剂，得到粗品。用硅胶纯化粗品，使用5%至100%的EtOAc/己烷的梯度，经过20分钟，得到标题化合物(327 mg，91%)。ES/MS(m/e): 571(M+H)。
制备例51
N-[7a-(5-氨基-2-氟-苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺
在氮气氛围中，将N-[7a-(5-氨基-2-氟-苯基)-4a,5,6,7-四氢-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(705 mg，1.90 mmol)、5-氟-2-氯嘧啶(1.01 g,7.61 mmol)和DIPEA(1.66 ml，9.52 mmol)在1,4-二噁烷(20 ml)中的溶液加热至回流，保持4小时。冷却该反应，用水稀释，并用EtOAc(3×)提取。将有机层合并，用硫酸钠干燥，过滤，并真空除去溶剂，得到粗品。用硅胶纯化粗品，使用5%至100%的EtOAc/己烷的梯度，经过25分钟，得到标题化合物(590 mg，66%)。ES/MS(m/e): 467(M+H)。
制备例52
N-[3-[(4aR,7aS)-2-苯甲酰胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺
将N-[(4aR,7aS)-7a-(3-氨基苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(400 mg，891.81 µmole)和5-甲氧基吡嗪-2-甲酸(165 mg，1.07 mmol)在DCM(4 ml)和二甲基甲酰胺(0.5 ml)中混合。加入HOBt(160 mg，1.16 mmol)，而后加入EDCI(226 mg，1.16 mmol)，并将得到的混合物在氮气氛围中、在室温下搅拌5小时。用水稀释该反应混合物，并用1N NaOH将pH值调节至～12。将该混合物用EtOAc(3×)提取。用硫酸钠干燥合并的有机提取物，过滤，并真空除去溶剂。用硅胶纯化粗品，使用5%至100%的EtOAc/己烷的梯度，经过20分钟，得到标题化合物(482 mg，92%)。ES/MS(m/e): 585(M+H)。
制备例53
N-[3-[2-苯甲酰胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-氟-吡啶-2-甲酰胺
将N-[7a-(5-氨基-2-氟-苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(302 mg，647 µmol)和5-氟吡啶-2-甲酸(110 mg，777 µmol)在DCM(3 ml)和二甲基甲酰胺(0.5 ml)中混合。加入HOBT(116 mg，842 µmol)，而后加入EDCI(164 mg，842 µmol)，并将该混合物在室温下、在氮气氛围中搅拌过夜。用水稀释该反应混合物，并用1N NaOH将pH值调节至～12，而后用EtOAc(3×)提取。将有机层合并，过滤，收集不溶性物质。用水和EtOAc洗涤固体，并真空干燥，得到标题化合物。用硫酸钠干燥得自于滤液的有机层，过滤，并真空除去溶剂。用硅胶纯化残余物，使用5%至100%的EtOAc/己烷的梯度，经过20分钟，得到额外的标题化合物，具有合并的产率(275 mg，72%)。ES/MS(m/e): 590(M+H)。
制备例54
N-[(4aR,7aS)-7a-(5-氨基-2-氟-苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(异构体1)
将外消旋的N-[7a-(5-氨基-2-氟-苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(1.694 g，3.63 mmol)用手性HPLC纯化(柱∶Chiralcel OJ，8 x 35 cm；洗脱液∶90%甲醇(0.2%二甲基乙胺)和10%乙腈；流速400 ml/min，UV 280 nm)。第一个洗脱的异构体的分析(柱∶Chiralcel OJ-H，0.46 x 15 cm；洗脱液∶10∶90的乙腈∶甲醇(含有0.2%二甲基乙胺)；流速∶0.6 ml/min，UV 280 nm)证明了对映体富集(99% ee)的对映体，Rt=6.70分钟(723 mg，43%)。ES/MS(m/e): 467(M+H)。
制备例55
N-[3-[(4aR,7aS)-2-苯甲酰胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺(异构体1)
将N-[(4aR,7aS)-7a-(5-氨基-2-氟-苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(0.361 g，0.77 mmol，异构体1)溶于DCM(4 ml)和DMF(0.5 ml)的混合物中。将5-甲氧基吡嗪-2-甲酸(240 mg，1.55 mmol)、HOBT(210 mg，1.55 mmol)和EDCI(300 mg，1.55 mmol)加入到该混合物中，并将该混合物在室温下搅拌过夜。将反应溶液直接加到硅胶装载的柱上，使用40 g硅胶柱纯化，用0-100%的EtOAc/己烷的梯度进行洗脱。将产物溶于EtOAc(200 ml)中，用1N NaOH(2×50 ml)和盐水(1×50 ml)洗涤。重复上述硅胶纯化，得到标题化合物(350 mg，74%)。ES/MS(m/e): 603(M+H)。
制备例56
N-[3-[(4aR,7aS)-2-苯甲酰胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]苯基]-5-氰基-吡啶-2-甲酰胺
将N-[(4aR,7aS)-7a-(3-氨基苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(0.30 g，0.67 mmol)溶于DCM(10 ml)中，并加入5-氰基吡啶-2-甲酸(129 mg，0.87 mmol)、HOBt(185 mg，1.34 mmol)和EDCI(169 mg，0.87 mmol)。加入DIPEA(0.35 ml，2 mmol)，并将该反应在室温下搅拌过夜。直接用硅胶色谱纯化物质，用0-100%的EtOAc/己烷的梯度进行洗脱，得到标题化合物(360 mg，88%)。ES/MS(m/e): 579(M+H)。
制备例57
N-[3-[(4aR,7aS)-2-苯甲酰胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]苯基]-3,5-二氟-吡啶-2-甲酰胺
将N-[(4aR,7aS)-7a-(3-氨基苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(0.30 g，0.67 mmol)溶于DCM(10 ml)中，并加入3,5-二氟吡啶-2-甲酸(138 mg，0.87 mmol)、HOBT(185 mg，1.34 mmol)和EDCI(169 mg，0.87 mmol)。加入DIPEA(0.35 ml，2 mmol)，并将该反应在室温下搅拌过夜。直接用硅胶色谱纯化反应，用0-100%的EtOAc/己烷的梯度进行洗脱，得到标题化合物(330 mg，84%)。ES/MS(m/e): 590(M+H)。
制备例58
N-[3-[(4aR,7aS)-2-苯甲酰胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-氰基-吡啶-2-甲酰胺(异构体1)
将N-[(4aR,7aS)-7a-(5-氨基-2-氟-苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(0.180 g，0.39 mmol，异构体1)溶于DCM(2 ml)和DMF(0.25 ml)的混合物中。加入5-氰基吡啶-2-甲酸(114 mg，0.77 mmol)、HOBt(106 mg，0.77 mmol)和EDCI(150 mg，0.77 mmol)，并将该反应在室温下搅拌过夜。用水(10 ml)、EtOAc(10 ml)稀释该混合物，并加入到1N NaOH溶液(100 ml)中。将该混合物用EtOAc(2×100 ml)提取，将有机层合并，并用盐水洗涤。将有机层用MgSO4干燥，过滤，浓缩。用硅胶色谱纯化残余物，使用0-100%的EtOAc/己烷的梯度，得到标题化合物(133 mg，57%)。ES/MS(m/e): 597(M+H)。
制备例59
N-[3-[(4aR,7aS)-2-苯甲酰胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-3,5-二氟-吡啶-2-甲酰胺(异构体1)
将N-[(4aR,7aS)-7a-(5-氨基-2-氟-苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(0.180 g，0.39 mmol，异构体1)溶于DCM(2 ml)和DMF(0.25 ml)的混合物中。加入5-氰基吡啶-2-甲酸(114 mg，0.77 mmol)、HOBt(106 mg，0.77 mmol)和EDCI(150 mg，0.77 mmol)，并将该反应在室温下搅拌过夜。用水(10 ml)和EtOAc(10 ml)稀释该混合物，而后倒入1N NaOH溶液(100 ml)中。将该混合物用EtOAc(2×100 ml)提取，将有机提取物合并，并用盐水洗涤。将有机层用MgSO4干燥，过滤，浓缩。通过硅胶色谱纯化残余物，使用0-100%的EtOAc/己烷的梯度，得到标题化合物(190 mg，80%)。ES/MS(m/e): 608(M+H)。
制备例60
(4aR,7aS)-7a-(2-氟苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺
将氢氧化锂(9.26 g，386 mmol)加入到N-[(4aR,7aS)-7a-(2-氟苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(158.6 g，351.6 mmol)的甲醇(1.6 L)混合物中。将该混合物在70℃下加热4小时，而后冷却至22℃。真空蒸发该反应混合物，得到黄色残余物。将残余物在水(1L)和EtOAc(750 ml)中分配。加入HCl(5M水溶液)，将pH值调节至1。分离水层，并将有机层用EtOAc(2×200 ml)洗涤。将水层的pH值用50% w/w氢氧化钠水溶液调节至pH=10，并用EtOAc(3×1L)提取。将有机提取物合并，用硫酸钠干燥，过滤，减压蒸发，得到粗品标题化合物的浅黄色固体(133.3 g，99%，含有12%残余的EtOAc)。ES/MS(m/e): 348(M+1)。
制备例61
(4aR,7aS)-7a-(5-氨基-2-氟-苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺
将硫酸(33.4 ml，626.6 mmol)加入到(4aR,7aS)-7a-(2-氟苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺(45.8 g，125,3 mmol)的三氟乙酸(626 ml)溶液中。将该混合物冷却至0℃，并搅拌20分钟。加入发烟硝酸(6.2 mL，144.1 mmol)，将该反应混合物升温至22℃，并搅拌3小时。蒸发该反应混合物，加入MTBE(250 ml)，并蒸发两次。将残余物真空干燥至恒重，而后溶于水(147 ml)和乙醇(885 ml)中，并鼓入氮气15分钟，进行脱气。将该溶液转入压力反应器中，并加入87L类型的10% Pd/C糊状物(6.6 g，6.27 mmol)。将该混合物用额外的乙醇(700 ml)稀释，并在80 psi下用氢气加压16小时。过滤该反应混合物，而后将第二个催化剂进料加入87L类型的10% Pd/C糊状物(6.6 g，6.27 mmol)，并在压力反应器中，将该混合物加压到80 psi，搅拌3天。用氮气吹扫该反应混合物，并用硅藻土过滤。蒸发滤液，并将残余物在水(200ml)和EtOAc(200 ml)之间分配。分离水层，冷却至5℃，并用15% w/w氢氧化铵中和。将水层用EtOAc(3×150 ml)提取。将有机物合并，用硫酸钠干燥，过滤，减压蒸发，得到标题化合物的浅棕色固体(47.7 g，99%，含有残余的EtOAc)。ES/MS(m/e): 363(M+1)。
实施例A
N-[3-[2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-氟-吡啶-2-甲酰胺
在封盖的烧瓶中，将N-[3-[2-苯甲酰胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-氟-吡啶-2-甲酰胺(293 mg，497 µmol)、O-甲基羟胺盐酸盐(430 mg，4.97 mmol)和吡啶(402 µl，4.97 mmol)的混合物在乙醇(13 ml)中加热至70℃，保持2.5小时。加入DMSO(3 ml)，并将该混合物在70℃下加热过夜。加入额外的DMSO(10 ml)，并在70℃下继续加热4小时。加入额外的O-甲基羟胺盐酸盐(208 mg，2.48 mmol)和吡啶(201 µl，2.48 mmol)，将该混合物加热至60℃，保持3小时，并将该混合物在室温下搅拌3天。在单独的烧瓶中，将N-[3-[2-苯甲酰胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-氟-吡啶-2-甲酰胺(276 mg，468 µmol)、O-甲基羟胺盐酸盐(405 mg，4.68 mmol)和吡啶(478 µl，4.68 mmol)的混合物在乙醇(15 ml)和DMSO(4 ml)中、在70℃、在封盖的烧瓶中加热过夜。加入额外的DMSO(10 ml)，并在70℃下继续加热4小时。加入额外的O-甲基羟胺盐酸盐(195 mg，2.34 mmol)和吡啶(189 µl，2.34 mmol)，在70℃下继续加热3小时，而后在室温下搅拌该混合物3天。将两个反应混合物合并，并真空除去大部分溶剂。在SCX柱上纯化粗品，使用3∶1的DCM∶甲醇，而后使用2∶1的DCM∶7N氨/甲醇。用硅胶进一步纯化粗品，使用0.5%至10%的7N氨甲醇/DCM的梯度，经过20分钟，得到标题化合物(451 mg，96%)。ES/MS(m/e): 486(M+H)。
实施例1
N-{3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4a,5,6,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a(4H)-基]苯基}-5-氟吡啶-2-甲酰胺盐酸盐
在封盖的管瓶中，将N-[3-[(4aR,7aS)-2-苯甲酰胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]苯基]-5-氟-吡啶-2-甲酰胺(320 mg，560 µmol)、O-甲基羟胺盐酸盐(485 mg，5.60 mmol)和吡啶(453 µl，5.60 mmol)在乙醇(15 ml)中的混合物、在65℃下加热五个小时。冷却该反应，并真空除去溶剂。用硅胶纯化粗品，使用0.5%至10%的7N氨/甲醇-DCM的梯度，经过30分钟，得到N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]苯基]-5-氟-吡啶-2-甲酰胺(219 mg，84%)。将该物质溶于DCM(1 ml)和甲醇(0.5 ml)中，并加入1M盐酸/乙醚(0.47 ml，470 µmol)。真空除去溶剂，得到标题化合物(228 mg，81%)。ES/MS(m/e): 468(M+H)。
实施例2
N-{3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4a,5,6,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a(4H)-基]苯基}-5-甲氧基吡嗪-2-甲酰胺盐酸盐
在封盖的烧瓶中，将N-[3-[(4aR,7aS)-2-苯甲酰胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺(479 mg，819 µmol)、O-甲基羟胺盐酸盐(709 mg，8.19 mmol)和吡啶(663 µl，8.19 mmol)在乙醇(20 ml)中的混合物在50℃下加热过夜。加入DMSO(4 ml)，并将该混合物加热至70℃，保持4小时，获得溶液。冷却该反应，并真空除去大部分溶剂。加入水，并用1N氢氧化钠将pH值调节至～12。将该混合物用EtOAc(5×)提取。用硫酸钠干燥合并的有机提取物，过滤，并真空除去溶剂。用硅胶纯化粗品，使用0.5%至10%的7N氨甲醇/DCM的梯度，经过30分钟。在SCX柱上再次纯化该混合物，使用3∶1的DCM∶甲醇，而后使用2∶1的DCM∶7N氨/甲醇，除去残余的DMSO。最后，用硅胶纯化该混合物，使用0.5%至10%的7N氨甲醇/DCM的梯度，经过20分钟，得到N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺。将该物质溶于DCM(1 ml)和甲醇(0.5 ml)中，并加入1M盐酸/乙醚(0.66 ml，660µmol)。真空除去溶剂，得到标题化合物(329 mg，78%)。ES/MS(m/e): 481(M+H)。
实施例3
N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-氟-吡啶-2-甲酰胺盐酸盐
将外消旋的N-[3-[2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-氟-吡啶-2-甲酰胺(451 mg，929µmol)用SFC进行手性纯化(柱∶Chiralcel OD-H(5µm)，2.1×25 cm；洗脱液∶40%甲醇(0.2%异丙胺)/CO2；流速70 ml/min，UV 225 nm)。第一个洗脱的异构体的手性分析∶柱∶Chiralcel OD-H(5 µm)，4.6×150 mm；洗脱液∶40%甲醇(0.2%异丙胺)/CO2；流速5 ml/min，UV 225 nm证明了对映体富集(>99% ee)的对映体，Rt=1.01分钟(175 mg，360 µmoles)。将该物质(游离碱，异构体1)溶于DCM(1 ml)和甲醇(0.5 ml)中，并加入1M盐酸/乙醚(0.36 ml，360 µmoles)。真空除去溶剂，得到标题化合物(183 mg，38%)。ES/MS(m/e): 486(M+H)。
实施例4
N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺盐酸盐
将N-[3-[(4aR,7aS)-2-苯甲酰胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺(0.350 g，0.58 mmol，异构体1)溶于THF(2 ml)中，而后加入甲醇(4 ml)和乙醇(4 ml)。将O-甲基羟胺盐酸盐(495 mg，5.81 mmol)和吡啶(470 µl，5.81 mmol)加入到该混合物中，将该反应升温至50℃，并搅拌过夜。将硅胶(～10 g)加入到该反应中，并浓缩该混合物。将在硅胶上干燥的样品装载到空柱上，纯化，用0-10%的7N氨甲醇/DCM的梯度进行洗脱。在SCX柱上再次纯化粗品，使用3∶1的DCM∶甲醇，而后使用2∶1的DCM∶7N氨/甲醇。最后用硅胶纯化粗品，使用0%至10%的7N氨甲醇/DCM的梯度，得到标题化合物的游离碱。将该物质溶于DCM(5 ml)中，并加入1M盐酸/乙醚(0.20 ml，660µmol)。真空除去溶剂，得到标题化合物(71 mg，23%)。ES/MS(m/e): 498(M+H)。
实施例5
N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4a,5,6,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a(4H)-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的结晶形式2(水合物)
将乙腈(500 ml)加入到二甲基甲酰胺(19.2 ml，248.9 mmol)中。将草酰氯(39.3 g，309.63 mmol)、而后5-甲氧基吡嗪-2-甲酸(46.0g，298.4 mmol)加入到该二甲基甲酰胺溶液中。在单独的烧瓶中，将(4aR,7aS)-7a-(5-氨基-2-氟苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,6,7,7a-六氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺(56.8 g，156.75 mmol)的水溶液加入到乙腈(500 ml)中，并将pH值用氢氧化铵(95 ml)调节至9。然后，将该混合物加热到50-55℃。逐滴加入酰氯溶液，并将该混合物搅拌3小时。将pH值用氢氧化铵调节至8-9。滤出所得到的沉淀，用水洗涤，干燥，获得标题化合物(123 g)。使固体在丙酮(250 ml)中形成浆液，保持1.5小时，并过滤。用丙酮洗涤湿滤饼，获得标题化合物(110g，用HPLC测得纯度90.5%)。将THF(1 L)和活性炭(9 g)加入到固体中，并将该混合物加热至回流过夜。通过硅藻土过滤该混合物，并用THF(150 ml)洗涤。浓缩有机溶液至1/10体积，并加热到60℃。加入水(430 ml)，并将该混合物在60℃下搅拌8小时。将该混合物冷却至室温，并搅拌10小时。滤出所得到的固体，用THF/水(7:6)洗涤，干燥，得到标题化合物(69 g，88%)。LC-MS: m/z=499(M+1)，纯度∶98.3%。
X射线粉末衍射(XRD)
在配备有CuKa源(λ=1.54060 Å)和Vantec检测器的Bruker D4 Endeavor X射线粉末衍射仪(在35 kV和50 mA下操作)上获得结晶固体的XRD图。在4和40°(2θ)之间扫描样品，步长为0.009°(2θ)，扫描速率为0.5秒/步长，发散度0.6 mm， 5.28固定的防散射，检测器狭缝为9.5 mm。将干粉填装到石英样品座上，并使用载玻片获得光滑表面。在环境温度和相对湿度下收集结晶形式的衍射图。结晶学领域众所周知的是，对于任何给定的结晶形式，衍射峰的相对强度可能由于例如晶体形态和特性等因素引起的优先取向而改变。如果存在优先取向的效果，峰强度改变，但多晶型物的特征峰位置没有变化。参见，例如， The United States Pharmacopeia #23, National Formulary #18, 1843-1844 页, 1995。此外，结晶学领域还众所周知的是，对于任何给定的结晶形态，有角度的峰位置可能轻微改变。例如，由于分析样品时的温度或湿度变化、样品替换、或存在或不存在内标，峰位置可能移动。在本发明的情况下，±0.2(2θ)的峰位置的变化性将会考虑到这些可能的变化，不会妨碍明确鉴别所指明的结晶形式。基于特征峰(单位°2θ)的任何独特组合，典型地是更突出的峰，可以确定结晶形式。基于NIST 675标准峰(在8.853和26.774度2θ)，调节在环境温度和相对湿度下收集的结晶形式的衍射图。
N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4a,5,6,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a(4H)-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的结晶形式2的制备样品的特点在于：使用CuKa辐射的XRD图，具有下面表2所述的衍射峰(2θ值)。具体地说，该图包括处于11.8°的峰，一个或多个选自18.6°、19.3°和26.7°的峰；衍射角的容许误差为0.2度。
表2∶实施例5的结晶形式2的X射线粉末衍射峰
。
实施例6
N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]苯基]-5-氰基-吡啶-2-甲酰胺盐酸盐
将N-[3-[(4aR,7aS)-2-苯甲酰胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]苯基]-5-氰基-吡啶-2-甲酰胺(360 mg，0.59 mmol)溶于乙醇(10 ml)和DCM(2 ml)中。加入O-甲基羟胺盐酸盐(504 mg，5.91 mmol)和吡啶(478 µl，5.91 mmol)，并将该反应在室温下搅拌度过周末(70小时)。将该反应升温至60℃，并搅拌24小时。浓缩该反应，得到粗品，通过硅胶色谱纯化，使用0-10%的7N氨甲醇/DCM的梯度，得到标题化合物的游离碱。将该物质溶于DCM(5 ml)中，并加入1M盐酸/乙醚(0.54 ml，540µmol)。真空除去溶剂，得到标题化合物(240 mg，75%)。ES/MS(m/e): 475(M+H)。
实施例7
N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]苯基]-3,5-二氟-吡啶-2-甲酰胺盐酸盐
将N-[3-[(4aR,7aS)-2-苯甲酰胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]苯基]-3,5-二氟-吡啶-2-甲酰胺(330 mg，0.53 mmol)溶于THF(10 ml)中，并用乙醇(10 ml)稀释。加入O-甲基羟胺盐酸盐(453 mg，5.32 mmol)和吡啶(430 µl，5.91 mmol)，并将该反应在室温下搅拌度过周末(70小时)。将该反应升温至60℃，并搅拌24小时。将该混合物浓缩到硅胶(～10 g)上，通过硅胶色谱纯化，使用0-10%的7N氨甲醇/DCM的梯度，得到标题化合物的游离碱。将该物质溶于DCM(5 ml)中，并加入1M盐酸/乙醚(0.49 ml，490µmol)。真空除去溶剂，得到标题化合物(159 mg，54%)。ES/MS(m/e): 486(M+H)。
实施例8
N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-氰基-吡啶-2-甲酰胺盐酸盐
将N-[3-[(4aR,7aS)-2-苯甲酰胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-氰基-吡啶-2-甲酰胺(133 mg，0.22 mmol，异构体1)溶于THF(1 ml)中，并用甲醇(3 ml)和乙醇(3 ml)稀释。加入O-甲基羟胺盐酸盐(190 mg，2.2 mmol)和吡啶(180µl，2.2 mmol)。将该反应升温至50℃，并搅拌过夜。将该混合物浓缩到硅胶(～10 g)上，通过硅胶色谱纯化，使用0-10%的7N氨甲醇/DCM的梯度进行洗脱。在SCX柱上再次纯化该物质，使用3∶1的DCM∶甲醇，而后使用2∶1的DCM∶7N氨/甲醇。最后一次用硅胶纯化该混合物，使用0%至10%的7N氨甲醇/DCM的梯度，得到标题化合物的游离碱。将该物质溶于DCM(5 ml)中，并加入1M盐酸/乙醚(0.27 ml，270µmol)。真空除去溶剂，得到标题化合物(114 mg，97%)。ES/MS(m/e): 493(M+H)。
实施例9
N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-3,5-二氟-吡啶-2-甲酰胺盐酸盐
将N-[3-[(4aR,7aS)-2-苯甲酰胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-3,5-二氟-吡啶-2-甲酰胺(190 mg，0.31 mmol，异构体1)溶于THF(1 ml)中，并用甲醇(3 ml)和乙醇(3 ml)稀释。加入O-甲基羟胺盐酸盐(267 mg，3.1 mmol)和吡啶(253 µl，3.1 mmol)，将该反应升温至50℃，并搅拌过夜。在SCX柱上纯化反应物，使用3∶1的DCM∶甲醇，而后使用2∶1的DCM∶7N氨/甲醇。最后一次用硅胶纯化该物质，使用0%至10%的7N氨-甲醇/DCM的梯度，得到标题化合物的游离碱。将该物质溶于DCM(5 ml)中，并加入1M盐酸/乙醚(0.20 ml，200µmol)。真空除去溶剂，得到标题化合物(101 mg，60%)。ES/MS(m/e): 504(M+H)。
实施例10
N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4a,5,6,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a(4H)-基]-4-氟-苯基]-3,5-二氟-吡啶-2-甲酰胺
将草酰氯(10.5 ml，136.4 mmol)加入到3,5-二氟吡啶甲酸(19.9 g，125 mmol)的乙腈(617 ml)和二甲基甲酰胺(10.5 ml)溶液中。搅拌30分钟之后，将该溶液加入到新制备的、预先加热到50℃的(4aR,7aS)-7a-(5-氨基-2-氟-苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺(41.1 g，113 mmol)的溶液(在乙醇(823 ml)/水(823 ml)的混合物中)中。将该反应在50℃下保持1小时。将该反应混合物冷却至22℃，并蒸发溶剂。将该水溶液用DCM(1L)稀释，并用2M氢氧化钠将pH值调节至pH=11。分离有机层，并将水层用额外的DCM(2×400 ml)洗涤。合并有机提取物，用硫酸钠干燥，过滤，并蒸干。用硅胶色谱纯化粗品，使用氨化的甲醇2N/DCM(0-10% DCM)的梯度，得到标题化合物的灰白色固体(45 g，78%)。ES/MS(m/e): 504(M+1)。
体外试验方法∶
对于体外酶和细胞试验，在DMSO中制备试验化合物，形成10 mM储备溶液。将储备溶液在DMSO中连续稀释，获得十点稀释曲线，在96孔圆底板中，最终化合物浓度范围是10 mM至0.05nM，而后进行体外酶和全细胞试验。
体外蛋白酶抑制试验∶
人类BACE1的表达
利用RT-PCR，由整个脑cDNA克隆人类BACE1(登录号∶AF190725)。将氨基酸序列#1至460所对应的核苷酸序列插入到编码人类IgG1(Fc)多肽的cDNA中(参见Vasser等人，Science, 286, 735-741(1999))。将BACE1(1-460)和人类Fc的融合蛋白(名称为huBACE1:Fc)构建到pJB02载体中。在HEK293细胞中短暂地表达人类BACE1(1-460):Fc(huBACE1:Fc)。将250μg各自构成的cDNA与Fugene 6混合，并加入到1升HEK293细胞中。转染之后四天，采集条件培养基，进行纯化。
huBACE1:Fc的纯化
用蛋白A色谱纯化huBACE1:Fc。在少量的等分样品中，将酶在-80℃下储存。
BACE1 FRET试验
如上所述，制备试验化合物的系列稀释物。将化合物在KH2PO4缓冲液中进一步稀释20×。在相应的低蛋白结合的黑色板的A排至H排上，将10μL的每个稀释物加入到每个孔中，所述黑色板含有反应混合物(25μL的 50mM KH2PO4， pH4.6， 1mM TRITON® X-100， 1mg/ml牛血清白蛋白，以及15μM的FRET底物)(参见，Yang等人，J.Neurochemistry,91(6)1249-59(2004))。在板振荡器上，将内含物充分混合10分钟。将在KH2PO4缓冲液中的15μL的二百pM人类BACE1(1-460):Fc(参见，Vasser等人，Science，286，735-741(1999))加入到含有底物和试验化合物的板中，使反应开始。在板振荡器上简略混合之后，在激发波长355 nm和发射波长460 nm下，记录时间0时的混合物的RFU。用铝箔覆盖反应板，并在室温下、在黑暗的湿润烘箱中保持16至24小时。记录培养结束时的RFU，激发和发射设置与时间0所使用的相同。时间0时的RFU与培养结束时的RFU的差值代表在化合物处理条件下的BACE1的活性。将RFU差值相对于抑制剂浓度作图，并将曲线与四参数逻辑斯谛方程拟合，获得EC50值和IC50值(参见，Sinha等人，Nature,402, 537-540(2000))。
基本上如上所述，检验下面列举的化合物，针对BACE1显示出下列活性∶
表3
平均值±SEM；SEM=平均值的标准误差。
这些数据表明，表3的化合物体外抑制纯的重组BACE1酶活性。
测定β-分泌酶活性抑制的全细胞试验
HEK293Swe全细胞试验
测定β-分泌酶活性抑制的常规全细胞试验使用稳定地表达人类APP751 cDNA的人类胚肾细胞系HEK293p(ATCC登记号：CRL-1573)，其包含天然存在的双突变Lys651Met652至Asn651Leu652，通常称为Swedish突变(所述HEK293Swe)，并且显示过度产生Abeta(Citron等人，Nature，360，672-674(1992))。文献已经描述了体外Abeta降低试验(参见，Dovey等人，Journal of Neurochemistry,76, 173-181(2001); Seubert等人，Nature,361, 260(1993); 以及Johnson-Wood等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94, 1550-1555(1997))。
在存在/不存在目标浓度的抑制剂(在DMSO中稀释)的条件下，将细胞(HEK293Swe，3.5x104个细胞/孔，含有200μL培养基，包含10% FBS的DMEM)在37℃下培养4至24小时。培养结束时，分析条件培养基对于β-分泌酶活性的证据，例如，分析Abeta肽。使用单克隆的266作为捕获抗体，生物素化的3D6作为报道抗体，利用夹心ELISA测定总的Abeta肽(Abeta1-x)。另外，使用单克隆2G3作为Abeta1-40的捕获抗体，单克隆21F12作为Abeta1-42的捕获抗体，通过夹心ELISA，测定Abeta1-40和Abeta1-42肽。Abeta1-40和Abeta1-42 ELISA使用生物素化的3D6作为报道抗体。在这种条件下，化合物处理之后，条件培养基释放的Abeta的浓度与BACE1的活性对应。绘制10点抑制曲线，并且与四参数逻辑斯谛方程拟合，获得Abeta降低效果的EC50值和IC50值。基本上如上所述，检验下面列举的化合物，针对Abeta降低效果显示出下列活性∶
表4
。
这些数据表明，表4的化合物在全细胞中抑制天然Abeta的产生。
PDAPP原代神经元试验
在PDAPP转基因胚胎期的小鼠中产生的原代神经元培养物中，还进行验证性的全细胞试验。由胚胎期的16天PDAPP胚胎，制备原代皮层神经元，并在96孔板中培养(15 x 104个细胞/孔，在DMEM/F12(1:1)加上10% FBS中)。体外2天之后，用不含血清的DMEM/F12(1:1)(含有B27添加物和2µM(最终)Ara-C(Sigma，C1768))替换培养基。体外第5天，在存在/不存在目标浓度的抑制剂(在DMSO中稀释)的条件下，将神经元在37℃下培养24小时。培养结束时，分析条件培养基对于β-分泌酶活性的证据，例如，分析Abeta肽。使用单克隆的266作为捕获抗体，生物素化的3D6作为报道抗体，利用夹心ELISA测定总的Abeta肽(Abeta1-x)。另外，使用单克隆2G3作为Abeta1-40的捕获抗体，单克隆21F12作为Abeta1-42的捕获抗体，通过夹心ELISA，测定Abeta1-40和Abeta1-42肽。Abeta1-40和Abeta1-42 ELISA都使用生物素化的3D6作为报道抗体。在这种条件下，化合物处理之后，条件培养基释放的Abeta的浓度与BACE1的活性对应。绘制10点抑制曲线，并且与四参数逻辑斯谛方程拟合，获得Abeta降低效果的EC50值和IC50值。基本上如上所述，检验下面列举的化合物，针对Abeta降低效果显示出下列活性∶
表5
平均值±SEM；SEM=平均值的标准误差。
这些数据表明，表5的化合物在全细胞中抑制Abeta的产生。
体内抑制β-分泌酶
一些动物模型，包括小鼠、豚鼠、狗和猴子的模型，可以用于筛选化合物处理之后的体内抑制β-分泌酶活性。本发明使用的动物可以是野生型、转基因或基因敲除的动物。例如，按照Games等人在Nature 373(523-527(1995))中所述制备的PDAPP小鼠模型，以及其它非转基因的或基因敲除动物，用于分析在抑制化合物存在下的体内抑制Abeta和sAPPbeta的产生。通常，给予2至12个月大的PDAPP小鼠、基因敲除小鼠或非转基因动物配制在赋形剂中的化合物，赋形剂可以是，例如，玉米油、环糊精(cyclodextran)、磷酸盐缓冲液、PHARMASOLVE®或其它合适的赋形剂。给予化合物之后一至二十四小时，将动物杀死，取出脑以及脑脊液和血浆，用于分析Abetas、C99和sAPP片段(参见，May等人，Journal of Neuroscience, 31, 16507-16516(2011))。
对于标准体内药理学研究，给动物服用各种浓度的化合物，并与同时给药的赋形剂处理的对照组进行比较。对于一些时程研究，从选择的动物中获得脑组织、血浆或脑脊液，从时间0开始，形成基线。给予其它组化合物或合适的赋形剂，并在给药之后的不同时间，将动物杀死。从选择的动物中获得脑组织、血浆或脑脊液，分析APP断裂产物的出现，包括Abeta肽、sAPPbeta及其它APP片段，例如，利用特定的夹心ELISA试验。在试验的最后阶段，将动物杀死，根据情况，分析脑组织、血浆或脑脊液中出现的Abeta肽、C99和sAPPbeta。在化合物处理之后，还可以分析APP转基因动物的脑组织中的β-淀粉样蛋白斑块的数量。本文使用的“Abeta 1-x肽”是指从残基1开始和以残基28以上的C末端结尾的Abeta种类的总和。这可以检测大部分Abeta种类，并且通常称为“全部Abeta”。
与赋形剂处理的对照物或零时对照物相比较，给予抑制化合物的动物(PDAPP或其它APP转基因的或非转基因小鼠)，可以显示出Abeta或sAPPbeta在脑组织、血浆或脑脊液中的降低，以及β淀粉样蛋白斑块在脑组织中的减小。给予年幼的雌性PDAPP小鼠1、3或10 mg/kg口服剂量的实施例1的化合物之后三小时，相比于赋形剂处理的小鼠，Abeta 1-x肽在脑海马中的水平分别降低大约34%、48%和53%，在大脑皮质中分别降低大约43%、59%和66%。
给予1或3 mg/kg口服剂量的实施例3的化合物之后三小时，相比于赋形剂处理的小鼠，Abeta 1-x肽在脑海马中的水平分别降低大约38%和50%，在大脑皮质中分别降低大约34%和53%。
对于实施例4，给予0.3、1或3 mg/kg口服剂量的化合物之后3小时，相比于赋形剂处理的小鼠，Abeta 1-x肽在脑海马中的水平分别降低大约31%、39%和61%，在大脑皮质中分别降低大约28%、42%和64%。
给出了实施例1、3和4针对BACE酶的体外活性，这些Abeta降低效果与体内BACE抑制一致，并且进一步显示了实施例1、3和4的CNS渗透性。
这些研究表明，实施例1至9的化合物抑制BACE，并因此用于降低Abeta水平。
联用药研究
BACE抑制剂摄食试验性研究
为了确定通过单独的BACE抑制作用能使血浆和脑Abeta最小至显著降低的剂量，在饲喂含有BACE抑制剂(例如，式I的化合物或其可药用盐)的饲料(chow diet)的PDAPP小鼠中，进行试验性的药物动力学和药效研究。给年幼的PDAPP小鼠饲喂14天含有饲料(chow diet)的食物，饲料(chow diet)中含有3 mg/kg、10 mg/kg、30 mg/kg或100 mg/kg“quasi-bid”等效剂量的BACE抑制剂。在Sorvall混合器中，每克检定的啮齿类食物#8728CM(Harlan labs)，混合大约0.05、0.15、0.5或1.5 mgBACE抑制剂，混合10分钟，而后，在制成药粒之前，用Hobart混合器混合15分钟。根据亲本品系，将32只年幼的雌性PDAPP小鼠随机分为4组，每组8只，包括赋形剂处理组和三个BACE抑制剂的剂量组。使小鼠随意获取食物14天，随后杀死。用CO2使小鼠麻醉，通过心脏穿刺，将血液收集到涂有EDTA的微量离心管中，并在冰上储存。随后，在室温下，将血样在14,000 rpm下离心4分钟，收集血浆，转入未经处理的微量离心管中，然后在干冰上冷冻，并在-80℃下储存，直到分析为止。通过断头术杀死小鼠，将脑快速地显微解剖为两半，在干冰上快速冷冻，并在-80℃下储存，直到分析为止(一半用于Abeta分析，另一半用于化合物接触测定)。为了分析实质性的Abeta，使用组织匀浆机(tissue teare，985-370型，速度设定在5)，将脑样品在5.5M胍-HCl缓冲液(每一半脑使用0.5 ml)中均化大约1分钟。在室温下，使均化的脑样品下垂过夜。
对于AbetaELISA分析，收集提取物，在酪蛋白缓冲剂(1x PBS，含有0.25%酪蛋白，0.05% Tween 20，0.1%硫汞撒，pH7.4，以及蛋白酶抑制剂混合物(Sigma P9340，0.01 mg/ml))中至少稀释至1:10，并在14000 rpm下离心10分钟。对于血浆Abeta的分析，将样品在样品缓冲液(PBS；0.05% Triton X-405；0.04%硫汞撒，0.6% BSA)中稀释至1:2，而后利用ELISA进行分析。使用m266.2(抗Abeta13-28)和生物素化的3D6(抗Abeta1-5)分别作为捕获和报道抗体，通过夹心ELISA来测定人类血浆Abeta1-x。将未知物一式两份进行测定，通过用8点标准曲线推导(Soft Max Pro v. 5.0.1，Molecular Dynamics，使用4参数的参考曲线拟合)，测定pg/ml，而后对于稀释物进行调节。通过上述夹心ELISA测定实质的Abeta，将数值相对于蛋白水平(通过Bradford CoomassiePlus蛋白方法测定，一式两份)归一化，并且表示为pg/mg蛋白。
为了测定BACE抑制剂的组织和血浆水平，使用下列方法∶将0.1 mg/ml BACE抑制剂的储备溶液连续用甲醇/水(1:1，v/v)稀释，制备工作溶液，然后用于强化对照物血浆和脑均浆，得到1、5、10、20、50、100、500、1000、2000、4000和5000 ng/ml的分析物浓度。为了测定BACE抑制剂的组织和血浆水平，使用下列方法∶将0.1 mg/ml BACE抑制剂的储备溶液连续用甲醇/水(1:1，v/v)稀释，制备工作溶液，然后用于强化对照物血浆和脑均浆，得到1、5、10、20、50、100、500、1000、2000、4000和5000 ng/ml的分析物浓度。在分析之前，将脑样品用超声细胞粉碎仪在3体积的甲醇/水(1:4，v/v)中均质化。将每个研究样品的等分样品、合适的校准标准和对照基质样品转入96孔板中，而后与含有内标的乙腈混合。混合之后，将样品离心，使沉淀的蛋白形成颗粒。然后，将得到的上清液的等分样品转入到干净的96孔板中，用甲醇/水(1:1，v/v)稀释，并利用LC-MS/MS，分析10微升等分样品。使用通过校准曲线样品多重回归所测定的响应与浓度的关系，计算分析物浓度。
体内联用药研究
为了评价抗N3pGlu Abeta单克隆抗体(例如，抗N3pGlu-Abeta单克隆抗体VII(参见表1，mE8c-IgG2a；如美国专利US 8,679,498 B2、USSN 13/810,895所述))和BACE抑制剂(例如，式I的化合物或其可药用盐)的联合的斑块降低治疗，将大量PDAPP小鼠首先养至16至18个月大。基于性别、亲本品系和年龄，将成年PDAPP小鼠随机分为五个处理组。每个处理组有20至30只成年PDAPP小鼠。在研究开始时，为了测定病变的基线水平，将1组杀死作为零时，而后治疗(尸体解剖如下所述)。然后，如下处理四个剩余的组∶2组，得到安慰剂饲料(chow diet)，并且每周注射12.5mg/kg的对照物同型IgG2a抗体的对照动物；3组，每周注射12.5mg/kg抗N3pGlu-Abeta单克隆抗体的动物；4组，得到BACE抑制剂饲料(chow diet)的动物，在试验性摄食研究中预先确定了剂量，但通常是～3至30mg/kg/天；5组，得到BACE抑制剂饲料(chow diet)(～3至30mg/kg/天)，并且每周注射12.5mg/kg的抗N3pGlu-Abeta单克隆抗体的动物。由包含抗体的无菌的储备溶液(在PBS缓冲液中)稀释抗N3pGlu-Abeta单克隆抗体，并通过腹膜内注射给予动物。将BACE抑制剂与松散的饲料(chow diet)(根据目标剂量，每克饲料含有～0.15至1.5mg化合物)混合，并压缩成饲料颗粒。在研究开始时，记录动物体重，随后在第一个月的治疗中，每周记录，而后在研究期间，每月记录。在研究时间，还定期监测食物摄入。使动物得到总共4个月的研究治疗。使动物继续保持它们相应的饮食，直到尸体解剖为止，在最后一次抗体注射之后的一周，进行尸体解剖。在尸体解剖时，使动物麻醉，使用EDTA预冲洗的1ml注射器，通过心脏穿刺获得血液。将血样收集在冰上，并通过标准离心来分离血浆。随后，用冷的肝素化盐水灌注动物，取出脑，并解剖为左和右半球。将一个脑半球快速冷冻，并保存，用于组织分析。将剩余的脑半球解剖为由海马、皮层、小脑和中脑组成的组织片段，随后在干冰上冷冻。将血浆和组织样品在-80℃下储存，直到进行分析为止。
药物动力学评价
利用尸体解剖时获得的血浆样品，测定血浆药物动力学。在抗原结合ELISA试验中，测定血浆抗体水平，在该试验中，用抗原(Abetap3-42)涂渍板，随后用稀释的血浆样品或参考标准(包含抗N3pGlu单克隆抗体在试验缓冲液(PBS+对照鼠的血浆)中的连续稀释物)培养。将板洗涤之后，使用抗-鼠-HRP共轭抗体，而后用TMB显色，检测所结合的鼠的抗体。为了测定BACE抑制剂的组织(中脑)和血浆水平，使用下列方法∶将0.1 mg/ml BACE抑制剂的储备溶液连续用甲醇/水(1:1，v/v)稀释，制备工作溶液，然后用于强化对照物血浆和脑匀浆，得到1、5、10、20、50、100、500、1000、2000、4000和5000 ng/ml的分析物浓度。在分析之前，使用超声破碎机，将脑样品在3体积的甲醇/水(1:4，v/v)中均化。将每个研究样品的等分样品、合适的校准标准和对照基质样品转入96孔板中，而后与含有内标的乙腈混合。混合之后，将样品离心，使沉淀的蛋白形成颗粒。然后，将得到的上清液的等分样品转入到干净的96孔板中，用甲醇/水(1:1，v/v)稀释，并利用LC-MS/MS，分析10微升等分样品。使用通过校准曲线样品多重回归所测定的响应与浓度的关系，计算分析物浓度。
药效评价
通过夹心ELISA，在胍溶解的组织匀浆中，测定实质的Abeta浓度。使用珠磨(bead beater)技术，进行组织提取，其中，在包含1ml硅化的玻璃珠的2ml深孔盘中，在1 ml 5.5M胍/50mM Tris/0.5X蛋白酶抑制剂混合物(pH8.0)中提取冷冻组织(摇动密封板，摇动两个间隔时间，每个间隔3分钟)。通过夹心ELISA，分析所得到的组织溶胞产物中的Abeta1-40和Abeta1-42∶将珠磨(bead beater)样品在2% BSA/PBS-T中稀释至1:10，并通过样品滤板(Millipore)过滤。将样品、空白、标准样品、质量控制样品在2% BSA/PBST的0.55M胍/5 mM Tris中进一步稀释，而后装载到样品板上。将参考标准在样品稀释剂中稀释。将涂有捕获抗体21F12(抗Abeta42)或2G3(抗Abeta40)(15µg/ml)的板用样品培养，用生物素化的3D6(抗Abeta1-x)(在2% BSA/PBS-T中稀释)检测，而后使用1:20K稀释物NeutrAvidin-HRP(Pierce)(在2% BSA/PBS-T中)，并用TMB(Pierce)显色。由标准曲线推导出Abeta水平，计算最终组织浓度，用每毫克组织湿重的毫微克的Abeta表示。组织学测定沉积的Abeta所占有的海马和皮层的面积百分比。使用10 µg/ml的生物素化的3D6(抗Abeta1-x)或阴性对照鼠的IgG(生物素化)，培养恒冷连续冠状面(7至10µm厚)。使用对于生物素具有特异性的二代(secondary)HRP试剂，并用DAB-Plus(DAKO)观测沉积的Abeta。通过用Image Pro plus软件(Media Cybernetics)分析所记录的图像，在海马或皮层中的关注的限定区域内，将免疫反应性的Abeta沉积物定量。
这些研究可以表明，相对于单一的单疗法，抗N3pGlu-Abeta单克隆抗体和BACE抑制剂(例如，式I的化合物或其可药用盐)的联合治疗，可以促进Abeta的降低。
序列表
<110> Eli Lilly and Company
MAY, Patrick
MERGOTT, Dustin
<120> 联合治疗
<130> P20348
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建
<400> 1
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Arg Gly Lys Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建
<400> 2
Ala Val Ser Lys Leu Asp Ser
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建
<400> 3
Val Gln Gly Thr His Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建
<400> 4
Gly Tyr Asp Phe Thr Arg Tyr Tyr Ile Asn
1 5 10
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建
<400> 5
Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Tyr Ile Asn
1 5 10
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建
<400> 6
Trp Ile Asn Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建
<400> 7
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建
<400> 8
Glu Gly Thr Thr Val Tyr
1 5
<210> 9
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建
<400> 9
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Arg Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Ala Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly
85 90 95
Thr His Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 10
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建
<400> 10
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ile Thr Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 11
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建
<400> 11
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Thr Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 12
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建
<400> 12
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Arg Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Ala Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly
85 90 95
Thr His Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 13
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建
<400> 13
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ile Thr Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440
<210> 14
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建
<400> 14
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Thr Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
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His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440