本发明涉及基因载体领域,具体地,涉及一种靶向缺血心肌的纳米化microRNA精准诊疗系统及其制造方法。
背景技术:
近年来,心血管疾病已经成为世界范围内发病率和死亡率最高的疾病之一。尽管基因治疗已经取得了令人满意的效果,但是安全有效的传递载体仍然是瓶颈所在。常用的心肌转运载体可分为病毒载体和非病毒载体。由于具有较高的转染效率,病毒载体的应用仍然具有绝对优势。但是,由于病毒载体引起的机体免疫反应较强,使其临床应用受到制约。作为病毒载体的有效补充,近年来非病毒载体的研究日益深入。
非病毒载体具备无传染性,没有载体容量限制,材料来源广泛,化学结构可控制,且易于大量制备,可负载基因,如:反义寡核苷酸,有着病毒载体不可替代的作用。
但是,目前的非病毒载体往往存在转染效率低,目的基因多数只能实现瞬间表达,其运送系统的颗粒较大,容易引发免疫反应和被机体所清除。
针对该缺陷,在现有的对非病毒载体的基础研究中,体外转染最常用的载体(媒介)包括阳离子脂质体和阳离子聚合物,如:Lipo2000、聚乙烯亚胺PEI25000、PEI18000等,此类产品均是目前公认的对多种细胞具有较高转染效率的商品化转染试剂之一,所以常被用来作为评价其他siRNA递送载体有效性的标准。
然而,研究表明,长期使用Lipofectamine 2000TM系列产品递送siRNA会增加细胞的自噬水平,诱发体内炎症。此外脂质体的血浆稳定性差,在血液中粒径、表面电位及脂质成分都有改变的趋势。而PEI系列产品的生物毒性明显。这些都限制了脂质体和PEI在临床上的应用。
因而,目前急需一种转染效果佳,稳定性佳,且无毒性或毒性较低的载体。
此外,目前针对心血管疾病的治疗产品中,用于负载基因的载体,往往在治疗时无靶向性,因此,不能解决病变部位富集的情况下的靶向治疗的问题。
技术实现要素:
本发明旨在克服上述缺陷,提供一种新型的对基因具有保护作用、转染效果佳、毒性极低、通过在载体上还连接有具有缺血心肌靶向性的多肽AT1来实现靶向治疗效果的纳米基因材料。
本发明提供的纳米基因材料,其特征在于:包括具有靶向性的纳米基因载体;上述纳米基因载体由氨基酸聚合物、修饰性聚乙二醇、血管紧张素Ⅱ的功能序列多肽制备而成;
其中,上述氨基酸聚合物和血管紧张素Ⅱ的功能序列多肽分别与修饰性聚乙二醇两端的修饰基团发生化学反应后获得具有靶向性的纳米基因载体。
进一步地,本发明的纳米基因材料,还具有这样的特点:上述氨基酸聚合物为由赖氨酸、丝氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺中的一种或多种氨基酸形成的聚合物或共聚物中的一种或多种。
优选自由赖氨酸制备的聚合物,或包含有质量百分比含量为45-80%的赖氨酸的共聚物。
进一步地,本发明的纳米基因材料,还具有这样的特点:上述修饰性聚乙二醇的结构如下所示:
其中,m为80-500的整数;
R1为酰胺基、烯烃基、环烯烃基、带有双键的杂环基;
上述酰胺基的结构式如下所示:
即、修饰性聚乙二醇的结构如下所示:
R3为烯烃基、环烯烃基、带有双键的杂环基;
上述烯烃基的结构式如下所示:
即、修饰性聚乙二醇的结构如下所示:
n1和n2为0到20的整数;当链长越长时,该材料的表面活性越好。
上述环烯烃基的结构式如下所示:
上述带有双键的杂环基的结构式如下所示:
R2为酯基;
上述酯基的结构式如下所示:
R4为烷基、芳基、杂环基;
上述杂环基的结构式如下所示:
Rx1-20选自氢、烷基、烷氧基、氨基或C-Rx1-20为羰基;
Rx1-20优选氢、甲基、乙基、甲氧基、氨基及C-Rx1-20为羰基;
Y为氮、氧、硫;
n为0-20的整数,当链长越长时,该材料的表面活性越好。
进一步地,本发明的纳米基因材料,还具有这样的特点:上述氨基酸聚合物的聚合度为50-500;优选为80-160;
上述氨基酸聚合物的的分子量为10000-100000;优选为15000以上;
上述修饰性聚乙二醇的分子量为1000-10000;优选为1500以上。
此外,本发明还提供了上述纳米基因材料的制备方法,其特征在于:
步骤一、配置反应物:
将氨基酸聚合物溶解于溶剂中配置成溶液A;
将修饰性聚乙二醇溶解于溶剂中配置成溶液B;
将血管紧张素Ⅱ的功能序列多肽溶解于溶剂中配置成溶液C;
步骤二、将溶液B滴加入溶液A中,于10-50℃的温度下,反应1-5小时;
步骤三、在保护气保护的条件下,加入溶液C,于10-50℃的温度下,反应8-24小时;
步骤四、将获得的溶液透析24-96小时后,冷冻干燥。
如权利要求5上述的一种纳米基因材料的制备方法,其特征在于:
上述溶剂选自pH为7-8的磷酸缓冲盐溶液、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃、醇、醚、酯中的一种或几种;
上述聚赖氨酸、修饰性的聚乙二醇与血管紧张素Ⅱ的功能序列多肽的摩尔比为1:2-100:1-100;
优选地,上述聚赖氨酸、修饰性的聚乙二醇与血管紧张素Ⅱ的功能序列多肽的摩尔比为1:2-10:2-8。
进一步地,本发明提供的上述纳米基因材料的制备方法,还具有这样的特点:即、在步骤三和四之间,还设有中和步骤;
上述中和步骤为:于步骤三的溶液中加入半胱胺等中和用试剂,于10-50℃的温度下,反应1-5小时;
上述半胱胺的制备方法为:将半胱胺盐酸盐溶解于二次水中,加入有机碱震荡混合5-20分钟,冷却后,采用有机溶剂萃取后,蒸除溶剂后获得半胱胺;
上述修饰性聚乙二醇与半胱胺盐酸盐的摩尔比为1:50-150;优选为1::80-100;
上述有机碱与半胱胺盐酸盐的摩尔比为1:0.1-10;优选为1:1-1.5。
进一步地,本发明的纳米基因材料,还具有这样的特点:即、上述具有靶向性的纳米基因载体在静电作用下负载基因;
上述基因可以选自反义寡核苷酸、反义表达质粒、表达质粒等基因;
上述负载的过程为:将具有靶向性的纳米基因载体加入基因中,吹打均匀后于30-40℃的条件下孵育0.5-2小时;
上述具有靶向性的纳米基因载体与基因的质量比为1:0.01-15;
上述具有靶向性的纳米基因载体与基因的质量比优选为1:1-10。
进一步地,本发明的纳米基因材料,还具有这样的特点:即、上述聚氨基酸为聚合度为95-135的树枝状聚赖氨酸;
上述修饰性聚乙二醇的分子量为1500-2500,其两端的修饰基团分别为NHS和MAL。
进一步地,本发明的纳米基因材料,还具有这样的特点:
上述基因为用于心肌缺血治疗的基因;
上述基因为miRNA-1的反义寡核苷酸。
进一步地,本发明的纳米基因材料,还具有这样的特点:上述具有靶向性的纳米基因载体在静电作用下负载miRNA-1的反义寡核苷酸;
上述负载的过程为:将具有靶向性的纳米基因载体加入miRNA-1的反义寡核苷中,吹打均匀后于30-40℃的条件下孵育0.5-2小时。
该具有靶向性的纳米基因载体与基因的质量比为0.01-15:1;优选为0.1-10:1;最优选为0.5-8:1。
进一步地,本发明的纳米基因材料,还具有这样的特点:上述纳米基因材料为具有缺血心肌靶向性的纳米基因载体。
该纳米基因材料还可以为未连接有血管紧张素Ⅱ的功能序列多肽的纳米基因载体,即、DGL-PEG/AMO-1,其制备方法和原料比例,同于DGL-PEG-AT1/AMO-1。
本发明的作用和效果:
在本发明中,提供了一种新型的纳米基因载体,该载体具有缺血心肌靶向性的作用,且毒副作用小。
如图1所示,在本发明中,氨基酸聚合物和血管紧张素Ⅱ的功能序列多肽分别与修饰性聚乙二醇两端的修饰基团发生化学反应后获得具有靶向性的纳米基因载体,其后,通过将该纳米基因载体与反义寡核苷酸、反义表达质粒、表达质粒等负载获得具有靶向功能的纳米基因载体。
具体地,氨基酸作为生物体内构成蛋白质分子的基本单位,与生物的生命活动有着密切的关系。它在基体内具有特殊的生理功能,是生物体内不可缺少的营养成分之一。而在在本发明中选用的聚氨基酸,基于氨基酸的基本特性,当应用于载体后,仍能具有良好的生物相容性等效果,带有电荷的聚氨基酸在本发明中为优选方案,由于自身带有的电荷效果,可与其他带有反向电荷的物质发生分子间的静电作用力,从而实现类似于自组装的效果。
另外,在本发明中,聚氨基酸选用的最优选案例中的DGL(树枝状聚赖氨酸),是一种阳离子聚合物,是由赖氨酸(人体必需氨基酸)聚合而成的,其具有良好生物相容性的同时、其生物可降解性和压缩DNA的能力极佳,其表面有大量的氨基,可被修饰,且带有正电,当其被其他基团修饰后,由于自身带有的正电荷,可与其他带有负电荷的物质发生分子间的静电作用力,从而实现负载因子或反义寡核苷酸的效果。
此外,本发明中选用聚乙二醇作为反应组分之一,由于其本身为一种优良的表面活性剂,当其与聚氨基酸上的基团发生取代等反应后,能实现在聚氨基酸的表面形成一层水化层的效果,从而能减小聚氨基酸的毒性,降低其在体内被巨噬细胞系统吞噬的可能性。
另外,在本发明中,选用的PEG为两端均设有修饰基团的PEG,从而使其通过该基团上的活性基与聚氨基酸等物质发生反应,实现各组分之间的联合的同时,提高产品的表面张力和兼容性。
另外,在本发明的最优选方案中,将其两端分别连接NHS和MAL基团,该NHS基团可与聚氨基酸表面的氨基发生取代等反应,将DGL和PEG连接起来;而MAL基团可与多肽AT1(血管紧张素Ⅱ的功能序列多肽)上的巯基-HS发生加成反应,从而将多肽AT1与PEG连接起来,进而构建起DGL和AT1的连接关系。
此外,在本发明中使用的AT1,其为:当心肌梗死(心肌细胞缺血缺氧)时,细胞表面的血管紧张素Ⅱ受体-1(AT1R)升高。所以在体外化学合成AT1R的配体中的一段功能序列(称AT1)连接在纳米材料表面,可靶向结合缺血心肌的AT1R,从而对缺血心肌具有一定的靶向作用。
在本发明中,体外合成的AT1多肽,其氨基酸序列如下所示:
Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe;
AT1R的配体的功能序列如下所示:
Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe;
其中间的Gly-Gly-Gly-Gly为间隔序列,Cys是中含有巯基-HS,是化学连接的功能基团。
此外,在本发明中,使用AMO-1(miRNA-1的反义寡核苷酸)作为负电荷的供电体,与上述合成基材通过静电实现组装的结果。
miRNA-1在心肌梗死或者细胞缺血缺氧时升高,可促进心肌细胞的凋亡,是心肌细胞的损害因子。而AMO-1是指miRNA-1的反义寡核苷酸,是化学合成的与miRNA互补的单链RNA。其在细胞质中可与成熟的miRNA-1发生互补配对,使得miRNA-1的损害作用减弱,上述各化合物的序列如下所示:
miRNA-1序列:5’-UGGAAUGUAAAGAAGUGUGUAU-3’
AMO-1序列:5’-AUACACACUUCUUUACAUUCCA-3’
在优选方案中,AMO-1带负电,可以与带正电DGL-PEG或DGL-PEG-AT1通过静电作用形成纳米颗粒。
附图说明
附图1、纳米材料形成和材料结构的示意图;
附图2、纳米材料核磁图谱;
附图3、纳米材料负载AM0-1后的粒径和电位图;
附图4、纳米材料负载AM0-1后的透射电镜图;
附图5、纳米材料负载AMO-1凝胶电泳图
附图6(a)、纳米材料对H9C2细胞毒性4小时对比图;
附图6(b)、纳米材料对H9C2细胞毒性8小时对比图;
附图7(a1)、激光共聚焦观察4小时对比图;
附图7(a2)、流式细胞检测4小时对比图;
附图7(b1)、激光共聚焦观察8小时对比图;
附图7(b2)、流式细胞检测8小时对比图;
附图8、活死染色实验结果对比图;
附图9、原代心肌细胞免疫荧光染色对比图;
附图10、原代心肌细胞水平治疗实验结果,各处理组miRNA-1量的对比图;
其中,对照组:正常细胞(normal组)给予DEPC水、缺氧细胞(control组)给予DEPC水、缺氧细胞(NC组)给予DGL-PEG-AT1/AMO-1-NC;实验组:缺氧细胞(PEI组)给予PEI/AMO-1、缺氧细胞(DGL-PEG组)给予DGL-PEG/AMO-1、缺氧细胞(DGL-PEG-AT1组)给予DGL-PEG-AT1/AMO-1;
附图11、DGL-PEG-AT1细胞水平靶向性验证图(红色:BODIPY,蓝色:DAPI);
附图12、DGL-PEG-AT1动物水平靶向性图(A,动物水平;B,离体脏器);
附图13、DGL-PEG-AT1/AMO-1对小鼠心肌梗死组织中miR-1的下调作用图。
具体实施方式
1、原料和设备的准备
1)原料:
树枝状聚赖氨酸(Dendrigraftpoly-L-lysines,DGL);
端马来酰亚胺端N-羟基琥珀酰亚胺聚乙二醇(α-Malemidyl-ω-N-hydroxysuccinimidyl polyethylene glycol,NHS-PEG2000-MAL);
AT1(靶向多肽序列:
Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe);
半胱胺盐酸盐;二氯甲烷,三乙胺。
2)设备:
定容瓶(1000mL,2000mL),烧杯(500mL,2L,5L),2个烧瓶(25mL),磁子,磁力搅拌器(可显示温度和转速),1个瓶塞,1个橡皮盖,2个针头(长短),2条橡皮管,MWCO:8000-14000透析袋。
2、试剂准备(根据实际使用的需要还可配置其他浓度和pH的缓冲溶液)
1)配置1000mL 0.2M的PBS原液(pH=7.4)
准备:250mL量筒,500mL烧杯,1000mL的定容瓶,二次水,Na2HPO4-12H2O,NaH2PO4-2H2O具体步骤:
a)分别称量Na2HPO4-12H2O 58.01868g,NaH2PO4-2H2O 5.92838g,混合放入500mL的烧杯中,加入500mL的二次水,充分搅拌溶解。b)将烧杯中的溶液倒入1000mL的定容瓶中,加入二次水定容至1000mL。(可将二次水先加入烧杯中冲洗烧杯壁,再加入到定容瓶中,因为烧瓶壁可能有部分溶质的残留)
c)用精密pH试纸测pH,确认pH值在7.4左右(7.2-7.4)
2)配置500mL的10mM的PBS缓冲液
a)取2.5mL原液,定容到50mL(稀释20倍)---做反应用
b)取100mL原液,定容到2000ml---透析用
(注:后面透析和反应用的PBS浓度都是10mM)
实施例一、DGL-PEG的合成
a)称量22mg(1μmol)的DGL(MW:25000)溶于5mL PBS缓冲液(10mM;pH=7.4)(浓
度0.2μmol/mL)(称量后将固体DGL置于10mLep管中);
在本实施例中,还可使用其他分子量的DGL,如:MW=10000、18000、20000、27000、30000、50000、80000或100000。
b)称量100mg(50μmol)的NHS-PEG2000-MAL(MW:2000)溶于5mL的DMSO中;
在本实施例中,还可使用其他分子量的NHS-PEG2000-MAL,如:MW=1000、1800、2100、2700、3000、4500、6500、8000或10000。
在本实施例中,针对反应条件的科研过程中,还根据需取代基团的不同,对于DGL与NHS-PEG2000-MAL的反应比进行调整,如:DGL与NHS-PEG2000-MAL的摩尔比为1:2、1:5、1:10、1:15、1:25、1:30、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:80、1:100不等。
在本实施例中,针对反应条件的科研过程中,还根据反应的需要,对反应液的浓度进行调整,如:浓度为1μmol/ml、10μmol/ml、50μmol/ml、100μmol/ml、120μmol/ml、150μmol/ml、210μmol/ml、650μmol/ml、1000μmol/ml、1200μmol/ml、1500μmol/ml不等。一般来说,当取代反应发生的反应位较多(多于20的取代)的情况下,采用100μmol/ml以上的浓度进行反应,当取代反应发生的反应位较少(少于20的取代)的情况下,采用100μmol/ml以下的浓度进行反应;
c)将b)缓慢滴加入a)中(500-1000转/分的混合条件下),55℃反应3h;
在本实施例中,针对反应条件的科研过程中,还根据需取代数量的不同,其反应温度可以调整为10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、40℃、45℃不等,其反应时间为0.5小时、1小时、1.5小时、2小时、2.5小时不等。一般来说,当取代反应发生的反应位较多(多于20的取代)的情况下,反应时间大于2小时,当取代反应发生的反应位较少(少于20的取代)的情况下,反应时间小于2小时,进行反应;
d)称量90.88mg(800μmol)半胱胺盐酸盐(MW:113.61)于20mL的ep管中,加入15mL
二次水,分两次进行超声溶解;
在本实施例中,针对反应条件的科研过程中,根据需取代基团、取代数量的不同,对于NHS-PEG-MAL:半胱胺盐酸盐的反应比可进行调整,NHS-PEG-MAL:半胱胺盐酸盐的摩尔比为1:50、1:60、1:70、1:80、1:85、1:95、1:110、1:120、1:130、1:140、1:150不等。一般来说,当取代反应发生的反应位较多(多于20的取代)的情况下,摩尔比采用少于1:85的比例,当取代反应发生的反应位较少(少于20的取代)的情况下,摩尔比采用多于1:85的比例;
e)待完全溶解后,加入三乙胺(MW:101.19;密度:0.726g/mL)65.8μL,充分震荡5min(用手摇晃即可,ep管会有些发热)。
在本实施例中,针对反应条件的科研过程中,半胱胺盐酸盐:三乙胺的摩尔比可以调整为1:0.5、1:0.8、1:1、1:1.5、1:1.9、1:2、1:5、1:10。
f)待反应完全后,加入10mL二氯甲烷,多次萃取,将获得的萃取液减压蒸除后获得固体;
将得到的固体溶于5mLPBS(10mM,pH=7.4)中,加入c的产物中,于55℃反应3h。
在本实施例中,针对反应条件的科研过程中,还根据需取代数量的不同,其反应温度可以调整为10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、40℃、45℃不等,其反应时间为0.5小时、1小时、1.5小时、2小时、2.5、3小时、4小时、4.5小时、5小时不等。一般来说,当取代反应发生的反应位较多(多于20的取代)的情况下,反应时间大于2小时,当取代反应发生的反应位较少(少于20的取代)的情况下,反应时间小于2小时,进行反应;
g)将d)中最终的溶液加入MWCO=8000-14000Da的透析袋中在一次水中透析48h。
在本实施例中,针对反应条件的科研过程中,还根据反应的需要,透析的时间可以为12小时、36小时、56小时、72小时、96小时不等;
h)冻干。
实施例二、DGL-PEG-AT1的合成
反应方程式如下所示:
a)称量22mg(1μmol)的DGL(MW:25000)溶于5mL PBS缓冲液(10mM;pH=7.4)(浓
度0.2μmol/mL)(称量后将固体DGL置于10mLep管中);
在本实施例中,还可使用其他分子量的DGL,如:MW=10000、18000、20000、27000、30000、50000、80000或100000。
b)称量100mg(50μmol)的NHS-PEG2000-MAL(MW:2000)溶于5mL的DMSO中;
在本实施例中,还可使用其他分子量的NHS-PEG2000-MAL,如:MW=1000、1800、2100、2700、3000、4500、6500、8000或10000。
在本实施例中,针对反应条件的科研过程中,还根据需取代基团的不同,对于DGL与NHS-PEG2000-MAL的反应比进行调整,如:DGL与NHS-PEG2000-MAL的摩尔比为1:2、1:5、1:10、1:15、1:25、1:30、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:80、1:100不等。
在本实施例中,针对反应条件的科研过程中,还根据反应的需要,对反应液的浓度进行调整,如:浓度为1μmol/ml、10μmol/ml、50μmol/ml、100μmol/ml、120μmol/ml、150μmol/ml、210μmol/ml、650μmol/ml、1000μmol/ml、1200μmol/ml、1500μmol/ml不等。一般来说,当取代反应发生的反应位较多(多于20的取代)的情况下,采用100μmol/ml以上的浓度进行反应,当取代反应发生的反应位较少(少于20的取代)的情况下,采用100μmol/ml以下的浓度进行反应;
c)将b)缓慢滴加入a)中(500-1000转/分的混合条件下),55℃反应3h;
在本实施例中,,针对反应条件的科研过程中,还根据需取代数量的不同,其反应温度可以调整为10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、40℃、45℃不等,其反应时间为0.5小时、1小时、1.5小时、2小时、2.5小时不等。一般来说,当取代反应发生的反应位较多(多于20的取代)的情况下,反应时间大于2小时,当取代反应发生的反应位较少(少于20的取代)的情况下,反应时间小于2小时,进行反应;
d)称量35.88mg(25μmol)AT1(MW:1377.55,纯度96%)溶于500μL DMSO中;
在本实施例中,针对反应条件的科研过程中,还根据需取代基团的不同,对于DGL与AT1的反应比进行调整,如:DGL与AT1的摩尔比为1:1、1:5、1:10、1:15、1:25、1:30、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:80、1:100不等。
在本实施例中,针对反应条件的科研过程中,还根据反应的需要,对反应液的浓度进行调整,如:浓度为1μmol/ml、10μmol/ml、50μmol/ml、100μmol/ml、120μmol/ml、150μmol/ml、210μmol/ml、650μmol/ml、1000μmol/ml、1200μmol/ml、1500μmol/ml不等。一般来说,当取代反应发生的反应位较多(多于20的取代)的情况下,采用100μmol/ml以上的浓度进行反应,当取代反应发生的反应位较少(少于20的取代)的情况下,采用100μmol/ml以下的浓度进行反应;
e)将d)加入c)中,氮气(或氦气、氩气等)保护,室温反应20h。
在本实施例中,针对反应条件的科研过程中,还根据反应的需要对其反应时间进行调整,其反应时间还可以为8小时、10小时、15小时、20小时、24小时不等。一般来说,当取代反应发生的反应位较多(多于20的取代)的情况下,反应时间大于15小时,当取代反应发生的反应位较少(少于20的取代)的情况下,反应时间小于15小时,进行反应;
f)称量90.88mg(800μmol)半胱胺盐酸盐(MW:113.61)于20mL的ep管中,加入15mL
二次水,分两次进行超声溶解;
在本实施例中,针对反应条件的科研过程中,根据需取代基团、取代数量的不同,对于NHS-PEG-MAL:半胱胺盐酸盐的反应比可进行调整,NHS-PEG-MAL:半胱胺盐酸盐的摩尔比为1:50、1:60、1:70、1:80、1:85、1:95、1:110、1:120、1:130、1:140、1:150不等。一般来说,当取代反应发生的反应位较多(多于20的取代)的情况下,摩尔比采用少于1:85的比例,当取代反应发生的反应位较少(少于20的取代)的情况下,摩尔比采用多于1:85的比例;
g)待完全溶解后,加入三乙胺(MW:101.19;密度:0.726g/mL)65.8μL,充分震荡5min
(用手摇晃即可,ep管会有些发热)。
在本实施例中,针对反应条件的科研过程中,半胱胺盐酸盐:三乙胺的摩尔比可以调整为1:0.5、1:0.8、1:1、1:1.5、1:1.9、1:2、1:5、1:10。
h)待反应完全后,加入10mL二氯甲烷,多次萃取,将获得的萃取液减压蒸除后获得固体;
将得到的固体溶于5mLPBS(10mM,pH=7.4)中,加入e的产物中,于55℃反应3h。
在本实施例中,,针对反应条件的科研过程中,还根据需取代数量的不同,其反应温度可以调整为10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、40℃、45℃不等,其反应时间为0.5小时、1小时、1.5小时、2小时、2.5、3小时、4小时、4.5小时、5小时不等。一般来说,当取代反应发生的反应位较多(多于20的取代)的情况下,反应时间大于2小时,当取代反应发生的反应位较少(少于20的取代)的情况下,反应时间小于2小时,进行反应;
i)将f)中最终的溶液加入MWCO=8000-14000Da的透析袋中在PBS中透析48h,再在一次
水中透析48小时。
在本实施例中,针对反应条件的科研过程中,还根据反应的需要,两次透析的时间可以为12小时、36小时、56小时、72小时、96小时、120小时不等;
f)冻干
注:一次水中透析后,会产生少许沉淀,离心后取上清,冻干,沉淀弃掉。
实施例三、负载反义寡核苷酸
在本实施例中,选用AMO-1,纳米材料(NHS-PEG或NHS-PEG-MAL)和AMO-1按照质量比(20:1)负载。将纳米材料和AMO-1溶于DEPC水,在200μL的ep管中先加入AMO-1,再加入材料,吹打混匀,涡旋30s后置于47℃温箱中孵育1小时。(原理:静电作用;DGL带正电,AMO-1带负电)
(注1:miRNA-1在心肌细胞缺氧时升高,对促进心肌细胞的凋亡,是心肌细胞的损害因子。AMO-1是指miRNA-1的反义寡核苷酸,是化学合成的与miRNA互补的单链RNA。其在细胞质中可与成熟的miRNA-1发生互补配对,使得miRNA-1的损害作用减弱。)
(注2:miRNA-1序列:5’-UGGAAUGUAAAGAAGUGUGUAU-3’
AMO-1序列:5’-AUACACACUUCUUUACAUUCCA-3’)
在本实施例中,针对反应条件的科研过程中,根据需求的不同,对于纳米材料:AMO-1的反应比可进行调整,AMO-1:纳米材料的质量比为1:1、1:5、1:8、1:10、1:15、1:25、1:30、1:40、1:50、1:60、1:65、1:70、1:80、1:90、1:100不等。
实施例四、理化分析和表征
本表征的产品为采用实施例一的方法和实施例二的方法获得的载体。
其中,DGL-PEG为选用聚赖氨酸、修饰性的聚乙二醇的摩尔比为1:5的产物;
DGL-PEG-AT1为选用聚赖氨酸、修饰性的聚乙二醇与血管紧张素Ⅱ的功能序列多肽的摩尔比为1:5:2.5的产物;
(1)1HNMR检测图谱
如图2所示,a(δ=1-1.8ppm)为赖氨酸上的3个CH2上的H,是DGL的特征峰。b(δ=3.6ppm)为PEG的重复序列O-CH2-CH2-O,d为(δ=6.8ppm)为MAL上的H,e(δ=2.6ppm)为NHS上的H,均为MAL-PEG-NHS的特征峰。C为AT1苯环上的H,是AT1的特征峰。DGL-PEG中a,b峰存在,说明PEG和DGL连接,e峰消失,说明NHS发生反应;d峰消失,说明半胱胺盐酸盐与MAL发生反应。DGL-PEG-AT1中出现了c峰,说明AT1成功连接在DGL-PEG-MAL上。由此推断,DGL,NHS-PEG-MAL,AT1成功连接在一起。
(2)粒径和电位
将合成的DGL-PEG-AT1在DEPC水中负载AMO-1后(纳米材料/AMO-1的质量比为8:1),如图3所示,用粒度仪检测其粒径约150nm,电位约+3mv。
(3)电镜
如图4所示,电镜结果显示:DGL-PEG-AT1/AMO-1(质量比为8:1)非水合粒径为50nm。
(4)材料负载能力的测定
DGL-PEG-AT1/AMO-1分别以质量比为0,0.5,1,2,4,6,8负载在一起。3%琼脂糖凝胶电泳跑胶,用SYBRⅡ染色。(原理:裸的AMO-1带负电,在凝胶电泳中可跑出,可被SYBRⅡ染色;当DGL-PEG-AT1包裹AMO-1时,AMO-1表面负电减少,在电泳中跑出的减少,若是完全被包裹,AMO-1不能跑出加样孔中。)
如图5所示:裸的AMO-1跑出了加样孔(白色条带),当DGL-PEG-AT1/AMO-1质量比为2:1时,出现了拖带现象,说明AMO-1被材料包裹,但是还没有完全包裹,当DGL-PEG-AT1/AMO-1质量比为8:1时,未看到AMO-1跑出加样孔,加样孔中也未见白色条带,说明AMO-1被完全包裹。当凝胶电泳跑15min时,可见裸AMO-1组的条带基本消失(可能AMO-1已经降解),但2:1的孔仍可看到拖带的白色条带,说明材料对AMO-1有一定保护作用,可一定程度减少AMO-1的降解。
(5)细胞毒性实验
将枝化PEI(bPEI),DGL,DGL-PEG,DGL-PEG-AT1分别配置成6个浓度:1mg/mL,500ug/mL,200ug/mL,100ug/mL,50ug/mL,20ug/mL,将其作用于H9C2细胞,4h或者8h后,用MTT法检测其对细胞增值的影响(细胞毒性)。
如图6(a)和6(b)所示:随着材料浓度和作用时间的增加,细胞活性逐渐降低。bPEI的毒性明显大于DGL,DGL-PEG-MAL,DGL-PEG-AT1。材料浓度小于100ug/mL时,DGL-PEG-MAL,DGL-PEG-AT1作用的细胞活性均大于80%(毒性较小),材料浓度大于100ug/mL时,对细胞毒性明显增加。可选择100ug/mL作为后续治疗量。
(6)细胞吞噬实验
验证H9C2细胞对PEI(3.9ug/2mL),DGL-PEG(24ug/2mL),DGL-PEG-AT1(24ug/2mL)负载AMO-1-FAM(3ug/2mL)的吞噬效果。
如图7(a1)、7(b1)、7(a2)和7(a2)所示:A1,B1中蓝色为细胞核(DAPI染色),绿色为AMO-1-FAM,位于细胞质或者细胞核位置。激光共聚焦显示,作用8h时,PEI,DGL-PEG,DGL-PEG-AT1负载AMO-1-FAM组的H9C2细胞中,绿色荧光均比4h时明显增强。
8h时DGL-PEG和DGL-PEG-AT1组的绿色荧光较PEI组强。流式细胞检测结果显示结果与之相符。
说明,H9C2细胞对DGL-PEG,DGL-PEG-AT1负载的AMO-1吞噬效果较PEI强,即DGL-PEG,DGL-PEG-AT1组较PEI组进入细胞的AMO-1多。
(7)活死染色实验
如图8所示:红色为死细胞(Ethidium homodimer-1染色),绿色为活细胞(Calcein AM染色)。(由于图8中显示,细胞8h时H9C2细胞对DGL-PEG,DGL-PEG-AT1负载的AMO-1吞噬效果较PEI强,再根据图7的细胞毒性实验结果显示PEI毒性大,推测,细胞对PEI负载的AMO-1吞噬作用弱可能是由于PEI毒性大,为了进一步验证这一假设,用和材料图8中同样的条件下,做活死染色。)结果显示,PEI组与DGL-PEG,DGL-PEG-AT1相比,细胞稀疏,并且红色荧光较绿色荧光多,据此推断可能细胞对PEI负载的AMO-1吞噬作用弱的原因是PEI对细胞毒性大。
(8)心肌原代细胞免疫荧光染色
当心肌梗死(心肌细胞缺血缺氧)时,细胞表面的血管紧张素Ⅱ受体(AT1R)升高。所以在体外化学合成AT1R的配体中的一段功能序列连接在纳米材料表面,可靶向结合缺血心肌的AT1R,从而对缺血心肌具有一定的靶向作用。
为验证SD大鼠原代心肌细胞缺血缺氧时AT1R是否升高,将原代心肌细胞做缺氧处理后,进行免疫荧光染色。
如图9所示:红色代表AT1R,位于细胞膜表面,蓝色代表细胞核。缺氧细胞表面的红色荧光明显增加,由此可进一步证实缺氧的SD大鼠原代心肌细胞的AT1R升高。
(9)原代心肌细胞水平治疗实验
用PEI(3.9ug/2mL),DGL-PEG(24ug/2mL),DGL-PEG-AT1(24ug/2mL)负载AMO-1(3ug/2mL)与缺氧的SD大鼠原代心肌细胞(1%O2,24h,低糖DMEM)共培养4h后,在正常条件下(21%O2,低糖DMEM)培养24h,提取总RNA,用Real-time PCR检测其miRNA-1的变化。
如图10所示:*代表P﹤0.05,n=3,如图,缺氧细胞(control)组未治疗时,miRNA-1较正常细胞(normal)组明显升高;DGL-PEG,DGL-PEG-AT1组的miRNA-1较缺氧细胞(control)组明显下降(达到了治疗作用),且DGL-PEG-AT1组较DGL-PEG组miRNA-1降低更明显(可能由于AT1对缺氧细胞的靶向性作用,使得DGL-PEG-AT1负载AMO-1后,被心肌细胞摄取的更多,治疗作用更明显)。然而,PEI组不仅没有下调miRNA-1,使细胞中miRNA-1较缺氧细胞(control)组增加(可能由于其细胞毒性作用引起)。
(10)DGL-PEG-AT1细胞水平靶向性验证实验
如图11所示,将用BODIPY标记的DGL-PEG和DGL-PEG-AT1分别与SD乳鼠的原代心肌细胞在缺氧环境下(1%O2,5%CO2,and 95%N2)孵育4h后,清洗,固定,DAPI染核,在激光共聚焦显微镜下观察红色荧光强度。结果表明,DGL-PEG-AT1组的红色荧光明显强于DGL-PEG组,提示DGL-PEG-AT1可与缺氧的心肌细胞膜升高的血管紧张素Ⅱ受体(AT1R)结合,具有心肌靶向性。
(11)DGL-PEG-AT1动物水平靶向性实验
如图12所示,建立C57BL/6小鼠的心肌梗死模型24h后,分别尾部静脉注射PBS,BODIPY标记DGL-PEG,BODIPY标记DGL-PEG-AT1,作用1h时进行活体成像。活体成像结束后,取小鼠的重要脏器进行离体成像。(A)活体水平和(B)离体水平(从上到下:心脏,肝脏,脾脏,肺脏和肾脏)结果均显示,与DGL-PEG组相比,DGL-PEG-AT1组心脏聚集的荧光强度更大。这表明DGL-PEG-AT1对缺血心脏具有靶向性。
(12)DGL-PEG-AT1/AMO-1对小鼠心肌梗死组织中miR-1的下调作用
如图13所示,实验分组为:Control(正常小鼠);MI(心肌梗死+PBS);DGL-PEG/AMO-1(心肌梗死+DGL-PEG/AMO-1);DGL-PEG-AT1/AMO-1(心肌梗死+DGL-PEG-AT1/AMO-1),DGL-PEG-AT1/NC(心肌梗死+DGL-PEG-AT1/NC)。建立C57BL/6小鼠的心肌梗死模型24h后,尾部静脉给药。给药24h后,取出心肌梗死及周围1mm范围内的心肌组织,提取RNA,并荧光定量PCR定量miRNA-1。(已知,AMO-1可下调心肌中的miRNA-1)
结果显示,与MI组和DGL-PEG/AMO-1组相比,DGL-PEG-AT1/AMO-1组的miRNA-1水平均明显下降(P〈0.001;P〈0.01;n=3)。分析可能是DGL-PEG-AT1/AMO-1对缺血心肌的靶向作用,使得AMO-1在缺血心肌中作用增强。
上述实施例的变形例:
在上述实施例中,以聚合度为123的聚赖氨酸DGL、聚乙二醇两端修饰基为NHS和MAL为原料进行了基因载体的制备。
在实际研发的过程中,还对上述两种原料分别进行了替换的实验,基于其合成的方法与实施例二至三中的方法雷同,此处不再做具体论述,具体实验组合如下表所示:
负载能力指纳米基材与AMO-1的质量比;
毒性评分为0-10分,以PEI为10分,DGL-PEG-AT1为1分;
细胞吞噬评分为0-10分,以PEI为1分,DGL-PEG-AT1为10分;
治疗效果评分为0-10分,以PEI为1分,DGL-PEG-AT1为10分;
从上述实施例可以看出,该靶向纳米基因载体可为心肌缺血或者心肌梗死患者的基因治疗提供一定的实验基础。该载体可负载AMO-1,也可负载用于心肌缺血治疗的其它基因。