一种具有抗炎作用的甾体化合物及其制备方法与流程

本发明涉及药物化学领域。更具体地，涉及一种具有抗炎作用的甾体化合物及其制备方法。

背景技术：

海马是海龙目海龙科海马属动物，是中国天然产物药用动物的典型代表，《本草经集注》记载海马的功效：“主易产”；《本草拾遗》进一步对其性味归经进行了描述，曰：“其色黄褐，性温、平，无毒。主妇人难产，带之于身，神验”；《本草图经》则对其炮制方法进行说明，曰：“妇人将产，烧末被服。《异鱼图》云，主难产及血气痛”；《本草纲目》记载为：“海马，雌雄成对，其性温暖，故难产及阳虚多用之，如蛤蚧、郎君子之功也。暖水藏，壮阳道，消瘕块，治疔疮肿毒”；另在《药材学》中有“温通任脉，用于喘息及久喘”的记载。2010年版《中国药典》记载：“海马味甘、咸，性温，归肝、肾经；具有温肾壮阳，散结消肿的功效，主要用于阳痿，遗尿，肾虚作喘，癥瘕积聚，跌扑损伤；外用痈肿疔疮”。对三斑海马进行乙醇粗提的得到甾体化合物已有报道，但未见对三斑海马进行化学成分研究，从其乙醇浸提物中分离鉴定出具有抗炎活性的化合物的报道。

技术实现要素：

本发明的一个目的在于提供一种甾体化合物在制备具有抗炎作用的药物或制剂中的应用；

本发明的另一个目的在于提供上述甾体化合物的制备方法。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

3β-羟基-胆甾-5-烯-7-酮在制备具有抗炎作用的药物或制剂中的应用。

一种制备3β-羟基-胆甾-5-烯-7-酮的方法，包括以下步骤：

(1)三斑海马粉末样品制备：三斑海马去内脏后迅速低温冷冻，经真空冷冻干燥处理后，进行低温超微粉碎；

(2)甾体化合物提取与分离：

a、粗提工序：三斑海马粉末样品用无水乙醇冷浸，减压回收溶剂，得浸膏A；

b、萃取工序：浸膏A悬浮于蒸馏水中，经乙酸乙酯萃取，减压浓缩，得浸膏B；

c、纯化工序：浸膏B经硅胶柱层析用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，收集体积比为3:1的石油醚-乙酸乙酯的洗脱流分；接着经反相柱ODS-C18用甲醇:水多次梯度洗脱，收集体积分数为70％-90％的甲醇溶液的洗脱流分；最后利用薄层色谱法进行纯化，即得3β-羟基-胆甾-5-烯-7-酮。

进一步，所述硅胶柱层析为200-300目硅胶柱层析。

进一步，所述薄层色谱法用到的溶剂为石油醚-丙酮，其体积比为3:1。

本发明的有益效果如下：

本发明甾体化合物具有抗炎作用，可有效抑制炎症介质和细胞因子的产生和其蛋白的表达，能应用于制备具有抗炎作用的药物或制剂中。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1示出3β-羟基-胆甾-5-烯-7-酮对RAW 264.7细胞活力的影响：**表示与空白组(Con)具有极显著差异(P<0.01)；

图2示出3β-羟基-胆甾-5-烯-7-酮对RAW 264.7细胞TNF-α、1L-1β、iNOS mRNA表达水平的影响：(a)药物处理24h；(b)药物处理48h；(c)药物处理72h；

##表示与空白组有极显著差异(P<0.01)；**表示与LPS处理组有极显著差异(P<0.01)。

图3示出荧光显微镜下观察不同处理组TNF-α、1L-1β、iNOS蛋白在细胞中的表达和定位。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例1 3β-羟基-胆甾-5-烯-7-酮的制备

(1)三斑海马粉末样品制备：三斑海马采集后去内脏迅速低温冷冻保存，经真空冷冻干燥处理后，采用低温超微粉碎机进行粉碎处理，粉末样品于-20℃冰箱冷冻保存备用；

(2)化合物的提取与分离：

a、粗提工序：三斑海马粉末样品用无水乙醇冷浸，减压回收溶剂，得浸膏A；

b、萃取工序：浸膏A悬浮于蒸馏水中，经乙酸乙酯萃取，减压浓缩，得浸膏B；

c、纯化工序：浸膏B经200目硅胶柱层析用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，收集体积比为3:1的石油醚-乙酸乙酯的洗脱流分；接着经反相柱ODS-C18用甲醇:水多次梯度洗脱，收集体积分数为70％-90％的甲醇溶液的洗脱流分；最后利用薄层色谱法(溶剂为石油醚-丙酮，其体积比为3:1)进行纯化，即得3β-羟基-胆甾-5-烯-7-酮。

实施例2 3β-羟基-胆甾-5-烯-7-酮的制备

(1)三斑海马粉末样品制备：三斑海马采集后去内脏迅速低温冷冻保存，经真空冷冻干燥处理后，采用低温超微粉碎机进行粉碎处理，粉末样品于-20℃冰箱冷冻保存备用；

(2)化合物的提取与分离：a、粗提工序：三斑海马粉末样品用无水乙醇冷浸，减压回收溶剂，得浸膏A；

b、萃取工序：浸膏A悬浮于蒸馏水中，经乙酸乙酯萃取，减压浓缩，得浸膏B；

c、纯化工序：浸膏B经300目硅胶柱层析用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，收集体积比为3:1的石油醚-乙酸乙酯的洗脱流分；接着经反相柱ODS-C18用甲醇:水多次梯度洗脱，收集体积分数为70％-90％的甲醇溶液的洗脱流分；最后利用薄层色谱法(溶剂为石油醚-丙酮，其体积比为3:1)进行纯化，即得3β-羟基-胆甾-5-烯-7-酮。

试验例1 3β-羟基-胆甾-5-烯-7-酮对巨噬细胞(RAW264.7)细胞活力的影响

分别选用了0.625、1.25、2.5、5、10、20μM浓度的3β-羟基-胆甾-5-烯-7-酮来处理RAW264.7细胞，结果显示(图1)，0.625-20μM浓度范围内的3β-羟基-胆甾-5-烯-7-酮对RAW264.7细胞不具有毒性。

试验例2 3β-羟基-胆甾-5-烯-7-酮对RAW264.7细胞TNF-α、1L-1β和iNOS基因表达量的影响

为了探讨3β-羟基-胆甾-5-烯-7-酮对活化后产生炎症细胞因子的影响，1.0μg/mL的LPS与不同浓度的3β-羟基-胆甾-5-烯-7-酮共同刺激巨噬细胞24h、48h和72h。用Realtime PCR检测细胞TNF-α、1L-1β和iNOS mRNA表达水平，结果如图2所示。在正常情况下(Con组)，巨噬细胞中TNF-α、1L-1β和iNOS mRNA的表达量均很少，由图可以发现，经LPS处理后细胞比空白对照组表达更多的TNF-α、1L-1β、iNOS mRNA，差异达到极显著(P<0.01)，表明用LPS来刺激RAW264.7细胞构建的细胞炎症反应模型是成功的。3β-羟基-胆甾-5-烯-7-酮剂量依赖性地抑制LPS诱导的炎症介质和细胞因子的产生，随着3β-羟基-胆甾-5-烯-7-酮浓度的增加，TNF-α、1L-1β、iNOS mRNA的表达量逐渐减少，与LPS处理组的差异均达到极显著(P<0.01)。当药物浓度为10μM和15μM时，部分TNF-α、1L-1β、iNOS mRNA的表达量与阳性对照药物Bay11-7082(10μM)、U0126(10μM)无显著差异(P>0.01)。

试验例3 3β-羟基-胆甾-5-烯-7-酮对RAW264.7细胞TNF-α、1L-1β和iNOS蛋白表达情况的影响

鉴于3β-羟基-胆甾-5-烯-7-酮在基因表达水平上对巨噬细胞活化后炎症细胞因子及诱导性酶的表达均有抑制作用，我们将1.0μg/mL的LPS与不同浓度的3β-羟基-胆甾-5-烯-7-酮共同刺激巨噬细胞48h，采用免疫荧光技术探讨3β-羟基-胆甾-5-烯-7-酮对这些炎症介质蛋白表达情况的影响，结果见图3和表1。由结果可发现，LPS刺激后的RAW264.7细胞TNF-α、1L-1β和iNOS的荧光强度均增强，与未刺激的空白对照组相比刺激巨噬细胞后，细胞的TNF-α、1L-1β和iNOS蛋白含量显著增多(P<0.01)，表明LPS刺激可诱导炎症介质和细胞因子蛋白的表达；不同浓度的3β-羟基-胆甾-5-烯-7-酮处理后，明显减弱了LPS引起的TNF-α、1L-1β和iNOS蛋白表达增多的这一作用(P<0.01)。

表1免疫荧光分析软件检测荧光值结果

注:**表示与LPS处理组(LPS)有极显著差异(P<0.01)

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。