车叶草苷在制备防治神经退行性疾病药物中的应用的制作方法

本发明属于防治神经退行性疾病领域，尤其涉及一种车叶草苷在防治衰老及阿尔茨海默病和帕金森病方面的应用。

背景技术：

神经退行性疾病是大脑和脊髓的神经元丧失的疾病状态，如阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease，AD），帕金森病（Parkinson’s Disease，PD），亨廷顿症（Huntington Disease，HD）等（R Medzhitov. Inflammation 2010: new adventures of an old flame. Cell, 2010, 140: 771-776）。针对神经退行性疾病的手段包括：抗神经元凋亡（如Caspase-3蛋白酶抑制剂、PPARs激动剂），神经递质调节，抗神经炎症，抗氧化，神经细胞再生等。衰老是人类生命过程中的必然规律，也会导致脑部的神经元的数目逐渐减少，甚至被认为是AD、PD等神经系统退行性改变的最初级阶段。因此，早期介入，通过抗衰老也是防治神经退行性疾病的有效手段（Collier，et al., Ageing as a primary risk factor for Parkinson’s disease: evidence from studies of non-human primates. Nature Reviews Neuroscience. 2011, 12: 359-366）。

端粒酶（Telomerase）是端粒复制所必须的一种特殊的DNA聚合酶，若激活端粒酶，就可以增加细胞分裂次数，从而延长寿命。在阿尔茨海默（Alzheimer’s Disease，AD）病人及实验模型中发现，端粒缩短是引发淀粉样蛋白（Aβ）聚集和Tau蛋白过度磷酸化以及认知功能障碍的重要因素，通过激活端粒酶手段，延长端粒长度或延缓端粒缩短的速度，有可能对抗衰老和防治AD具有重要意义（Jaskelioff et al., Telomerase reactivation reverses tissue degeneration in aged telomerase-deficient mice, Nature, 2010, 469, 102–106 ; Cai et al., Telomere Shortening and Alzheimer’s Disease, Neuromol Med , 2013, 15: 25–48）。

一些天然组分在神经细胞再生和抗衰老方面具有良好的生物活性，如环烯醚萜苷具有良好的神经保护作用（董天娇等. 天然环烯醚萜化合物研究进展，中草药，2011，42：185-194.）。地黄中的梓醇具有降血糖、抗衰老等多种药理作用，在脑缺血损伤、老年痴呆症、帕金森病以及衰老神经疾病等方面具有良好中的作用，其机制包括抗氧化作用和提高神经可塑性等方面（蔡其燕等. 梓醇在神经系统作用的研究进展，现代生物医学进展，2010，10：3589-3591.）。因此，环烯醚萜类成分成为筛选抗衰老和抗神经退行性疾病的重要来源。在前期的研究中，发现从田间常见杂草——拉拉藤属植物猪殃殃（Galium aparine L. var. tenerum Gren.et (Godr.) Rebb.）中分离得到小分子化合物车叶草苷（Asperuloside），且资源丰富，制备成本较低。该化合物也见于蔓生拉拉藤（赵春超，凤眼草和蓬子菜化学成分及生物活性研究，沈阳药科大学博士论文，2007）和白花蛇舌草（杨亚滨等. 白花蛇舌草化学成分的研究，云南大学学报(自然科学版)，2007，29 ( 2) : 187-189）。

拉拉藤属植物富含环烯醚萜类成分，这些萜类化合物具有良好的抗肿瘤、抗炎、抗菌等活性(蔡小梅，猪殃殃化学成分的研究, 贵州大学硕士论文，2009)。拉拉藤中的小分子化合物京尼平苷是一种新的GLP-1 受体激动剂，能够提高细胞的抗氧化能力。京尼平苷及苷元京尼平(genipin)明显提高AD 模型动物的学习记忆能力，改善认知功能状态，认为其在对抗Aβ 毒性作用、抗氧化应激、抗内质网应激及抗炎等多方面具有良好效果，并能促进神经生长，修复受损神经元(王磊等.中国药理学通报，2012，28(5)：604-607)。鉴于环烯醚萜类小分子化合物在抗神经退行性疾病中的良好应用前景，研究了拉拉藤属植物猪殃殃的抗衰老活性，发现从该植物中分离得到的车叶草苷具有较好的激活端粒酶作用及抗衰老活性。

本发明涉及的是天然小分子化合物车叶草苷（附图1）在制备端粒酶激活、抗衰老和抗神经退行性疾病药物或膳食补充剂方面的用途。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种车叶草苷在制备防治神经退行性疾病药物中的应用，旨在充分利用毒副作用较小的植物资源，发现具有基于端粒酶的防治阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病的药物和膳食补充剂。

通过对车叶草苷的药理活性研究，发现车叶草苷具有良好的激活端粒酶作用、促进衰老型BJ成纤维细胞的增殖及延长衰老型果蝇寿命等生物活性。在BJ成纤维细胞模型中，车叶草苷对HEK 293T细胞的端粒酶具有中等强度的激活作用；明显地促进BJ细胞的增殖，并且对衰老期的BJ细胞中的端粒酶具有温和的促进作用，显示出延长细胞寿命、抗衰老、抗AD等神经疾病的潜力；果蝇实验中车叶草苷能显著延长果蝇寿命，增强动物体内过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性，降低脂质过氧化物的降解产物丙二醛（MDA）的含量，抑制体内氧化应激（ROS）效应。因此车叶草苷用于制备防治神经退行性疾病具有良好的治疗潜力。

本发明涉及的药物车叶草苷来源丰富，生产成本低，水溶性好，安全无毒，具有适合制备防治神经退行性疾病的药物和膳食补充剂的特点。同时，其作用机制涉及到激活端粒酶、端粒酶相关的氧化应激及神经炎症等机制。

附图说明：

图1为车叶草苷的化学结构。

图2为车叶草苷对HEK293T细胞端粒酶的影响图；其中图A:凝胶结果图；图B: 端粒酶相对活性统计图。

图3为车叶草苷对BJ细胞增殖的作用图；其中，图A: 27PD的BJ细胞；B: 34PD的BJ细胞。

图4为车叶草苷对衰老BJ细胞端粒酶的作用图；其中图A:凝胶结果图；图B: 端粒酶相对活性统计图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

上车叶草苷购于海一林生物科技有限公司；

HEK 293T细胞和BJ 成纤维细胞购自美国ATCC；

TRAPEZE^®端粒酶试剂盒购自美国EMD millipore；

黑腹果蝇 购自第二军医大学；

CAT、SOD和MDA试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

实施例1：

采用TRAP实验评价车叶草苷对HEK 293T细胞端粒酶活性的影响：HEK 293T细胞接种于12孔板中，置于37 ℃，5% CO₂孵箱培养48 h，分别加入车叶草苷，其终浓度分别为0.01，0.1，1.0，10 μM，空白组为0.1% DMSO，复孔。 继续孵育48 h后收集细胞。离心除去培养液，加入PBS洗涤，Chaps消化，离心，取上清液，参照TRAPEZE^®端粒酶试剂盒操作说明，测定车叶草苷对端粒酶的活性（图2A）。

结果：车叶草苷对端粒酶具有明显的激活作用，在0.01，0.1，1.0，10 μM浓度下，端粒酶活性分别增加149.6%，156.9%，156.9%和220.4%（图2B）。结果表明车叶草苷具有基于端粒酶机制的促神经细胞再生的潜力。

实施例2：

车叶草苷对衰老细胞的促生长作用：

车叶草苷促BJ成纤维细胞生长实验：BJ 成纤维细胞接种于 12 孔板中，置于37 ℃，5% CO₂孵箱培养36 h，加入车叶草苷，其终浓度分别为0.01，0.1，1.0，10，100 μM，空白组为0.1% DMSO，复孔。继续孵育36 h后用MTT法测定其吸光度，结果如图3所示，可见，车叶草苷对BJ细胞（BJ 27PD）的细胞增长率相对空白对照组分别为：8.1%，1.8%，-0.2%，-3.4%和-2.4%（图3A），说车叶草苷在0.01-0.1 μM范围内对BJ 27PD细胞具有一定的促生长作用；对更加衰老34 PD的BJ细胞的细胞增长率相对空白对照组分别为：10.3%，7.2%，7.2%，0.7%和-0.92%（图3B），在0.01-1.0 μM范围内对BJ 34 PD细胞具有明显的促生长作用，而稍高的浓度：10 μM和100 μM对细胞增殖没有促进作用。34 PD的BJ细胞生长明显慢于27 PD BJ细胞， 车叶草苷对明显衰老的BJ细胞的促生长作用更明显。

车叶草苷激活衰老BJ细胞端粒酶实验：BJ 成纤维细胞（30-35 PD）接种于 12 孔板中，分别加入车叶草苷（0.01，0.1，1.0 μM），37 ℃下 5% CO₂ 孵箱培养，每 24 h 更换一半含药物车叶草苷的培养基。细胞增加至 75%时收集细胞，离心除去培养液，PBS 洗涤，Chaps 裂解，离心，取上清液，参照TRAPEZE^®端粒酶试剂盒操作说明，凝胶在 Storm^®成像系统中扫描（图4A），利用 ImageQuant TL 软件计算车叶草苷对端粒酶激活的影响。空白组为 0.1 % DMSO。

结果见图3A。与空白组比较，在0.01，0.1和1.0 μM三组中，端粒酶活性分别增加28.7%，88.1%和8.9%，阳性对照药TA-65组（0.1 μM）端粒酶的活性增加53.5%（图4B）。说明车叶草苷在0.01 μM-1.0 μM 浓度下具有明显的激活端粒酶的作用。上述结果表明车叶草苷在合适的浓度范围内具有基于端粒酶机制的抗神经细胞衰老和防治神经退行性疾病的潜力。

实施例3：

采用果蝇实验评价车叶草苷对氧化应激效应的影响：

果蝇培养基（青岛海博生物技术有限公司）：每250 g培养基含琼脂粉8.2 g、玉米粉108.5 g、蔗糖81.5 g、酵母粉9.2 g、苯甲酸钠1.3 g。20.87 g培养基加热溶于100 mL蒸馏水中，稍冷后加入0.65 mL丙酸，灭菌后备用。在基础培养基中添加车叶草苷，终浓度分别为10 μM和50 μM。

果蝇寿命实验：收集48 h羽化黑腹果蝇成虫，随机分组，每组雄性果蝇200只，每96 h更换新鲜培养基。实验开始后，每天定点观察，记录果蝇死亡数，直到各组果蝇全部死亡为止。计算果蝇的半数死亡时间、最高寿命、平均寿命和平均延寿率，其中平均延寿率(% )= (给药组平均寿命-对照组平均寿命) /对照组平均寿命×100%。实验数据见表1，说明车叶草苷具有良好的延长果蝇寿命的作用。

表1. 车叶草苷对果蝇寿命的影响 (Mean±SD)

^**与对照组比较，p<0.01, ^*与对照组比较，p<0.05

CAT、 SOD 和MDA的测定：收集48 h羽化黑腹果蝇成虫，随机分组试验。每组雄性果蝇100只。每96 h更换新鲜培养基。在给药后第30天时，用生理盐水制成8%的组织匀浆；以4000 rpm 离心10 min，按照CAT、 SOD 和MDA试剂盒说明分别测定每组上清液CAT、SOD及MDA水平，实验数据见表2。

表2. 车叶草苷对果蝇中CAT、SOD及MDA的影响 (Mean±SD，n=5)

^**为与对照组比较，p<0.01；^*为与对照组比较，p<0.05。

由表1和2可见，车叶草苷可以明显延长果蝇寿命，提高果蝇体内CAT和SOD的水平，其高、低剂量组增长比例分别为39.1%、17.9%（CAT）和52.0%、20.4%（SOD），降低脂质过氧化物的降解产物MDA含量的比例分别为18.4%和5.7%，表明车叶草苷有较好抗衰老和抗氧化应激作用。

以上实验结果说明车叶草苷具有良好的活化端粒酶和抗体内氧化应激能力，能够促进衰老细胞增殖，延长果蝇寿命，在治疗神经退行性疾病方面具有良好的应用潜力。