大黄酸超分子水凝胶及其制备方法和应用与流程

本发明涉及中药技术领域，尤其涉及一种大黄酸超分子水凝胶制备方法和应用。

背景技术：

大黄酸是源于中药大黄的一种游离型蒽醌类物质，分子式是CH₁₅H₈O₆。大黄酸是一种来源于天然的抗氧化剂和抗炎物质，毒副作用较小，而且具有很好的抗氧化和抗炎作用，因此在抗肿瘤，抗炎，泻下，神经保护，调脂等方面具有较高活性。

小胶质细胞作为一种中枢神经系统胶质细胞，是参与大脑免疫炎症反应的主要效应细胞。在阿尔茨海默病、帕金森病、脑外伤、脑水肿等小胶质细胞介导的炎症性疾病中，当中枢神经系统受到损伤后，静息状态的小胶质细胞被激活，迁移至损伤的脑细胞区。活化的小胶质细胞可分泌诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）、白介素6（IL-6）和白介素12（IL-12）等多种细胞炎症因子，这些炎症因子参与炎症反应的免疫应答。因此，抑制小胶质细胞的活化从而减轻炎症因子的表达对治疗阿尔茨海默病、帕金森病、脑外伤、脑水肿等小胶质细胞介导的中枢神经系统疾病发挥着重要的神经保护作用。

大黄酸对小胶质细胞介导的中枢神经系统疾病有良好的抗炎药理作用，但是，大黄酸的刚性结构使其溶解性差，导致了生物利用度降低。另一方面，由于传统的中药剂型在人体有一定的药物半衰期，并且在病变部位作用的时间较短，难以起到应有的疗效。因此需要一种新的剂型来提高大黄酸的缓释效果。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种具有抗炎、抗菌、抗肿瘤等特性的大黄酸超分子水凝胶，可解决大黄酸溶解性差、半衰期短的问题，并保留了大黄酸的生物活性。本发明还提供了上述大黄酸超分子水凝胶的制备方法，制备工艺简单。本发明还提供了上述大黄酸超分子水凝胶在制备治疗阿尔茨海默病、帕金森病、脑外伤、脑水肿等小胶质细胞介导的炎症性脑病的药物中应用，治疗效果明显。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种大黄酸超分子水凝胶，包括大黄酸和NaHCO₃溶液，所述大黄酸溶解于NaHCO₃溶液中。

上述的大黄酸超分子水凝胶，优选的，所述大黄酸的浓度大于4 mg/mL，所述NaHCO₃溶液的浓度为0.2～0.5 mol/L。

上述的大黄酸超分子水凝胶，优选的，所述大黄酸的浓度为5～8 mg/mL。

作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种大黄酸超分子水凝胶的制备方法，将大黄酸溶于NaHCO₃溶液中，超声分散得到大黄酸超分子水凝胶。

上述的制备方法，优选的，所述大黄酸的浓度大于4 mg/mL，所述NaHCO₃溶液的浓度为0.2～0.5 mol/L。

上述的制备方法，优选的，所述大黄酸的浓度为5～8 mg/mL。

上述的制备方法，优选的，所述超声分散的功率为70～120 W；超声分散的时间为30～60 min，所述超声分散的温度不超过37 ℃。

作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的大黄酸超分子水凝胶或上述制备方法制备得到的大黄酸超分子水凝胶在制备治疗小胶质细胞介导相关疾病的药物或在制备用于治疗小胶质细胞介导的炎症性脑病药物中的应用。

作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的大黄酸超分子水凝胶或上述制备方法制备得到的大黄酸超分子水凝胶在制备用于减轻或治疗小胶质细胞炎症性疾病药物中的应用。

作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的大黄酸超分子水凝胶或上述制备方法制备得到的大黄酸超分子水凝胶在制备用于治疗阿尔茨海默病、帕金森病、脑外伤、脑水肿药物或在制备用于保护神经细胞药物的应用。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

（1）本发明提供了一种大黄酸超分子水凝胶，大黄酸超分子水凝胶的形貌是纳米纤维，其有自缓释的，不仅解决了大黄酸溶解性差的问题，而且保留了大黄酸的生物活性，又延长了大黄酸在病变位置的作用时间，增强了药物的治疗效果。本发明制备的大黄酸超分子水凝胶，首次提出了以中药单体大黄酸作为凝胶因子，在NaHCO₃溶液中利用π-π键、氢键、离子键、疏水作用等非共价键作用通过自组装成具有三维网状结构的大黄酸超分子水凝胶，

（2）本发明提供了一种大黄酸超分子水凝胶的制备方法，在水凝胶形成过程中，超声作用促使体系迅速形成微小晶核，然后生长成纤维状骨架结构，纤维之间相互搭接形成网络结构，进而基于表面张力作用与水结合形成凝胶，制备过程简单，成本低，可商业化，适于大规模生产有望运用在组织工程、药物缓释、伤口愈合、抑制炎症和神经保护等生物医药领域。

附图说明

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。

图1为本发明实施例1中大黄酸溶液和大黄酸超分子水凝胶的扫描电子显微镜（SEM）图。

图2为本发明实施例2中大黄酸溶液和大黄酸超分子水凝胶的数码照片图。

图3为本发明实施例2中大黄酸超分子水凝胶和大黄酸粉末的傅里叶红外谱图。

图4为本发明实施例3中大黄酸超分子水凝胶的紫外谱图。

图5为本发明实施例4中大黄酸超分子水凝胶和大黄酸对LPS诱导BV2细胞生成诱导型一氧化氮合酶（iNOS）水平的影响。

图6为本发明实施例4中大黄酸超分子水凝胶和大黄酸对LPS诱导BV2细胞生成肿瘤坏死因子α（TNF-α）炎症因子水平的影响。

图7为本发明实施例4中大黄酸超分子水凝胶和大黄酸LPS诱导BV2细胞生成白介素6（IL-6）炎症因子水平的影响。

图8为本发明实施例4中大黄酸超分子水凝胶和大黄酸LPS诱导BV2细胞生成白介素12（IL-12）炎症因子水平的影响。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。

以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。

实施例1

本发明的一种大黄酸超分子水凝胶，包括大黄酸和NaHCO₃溶液，大黄酸溶解于NaHCO₃溶液中，采用以下制备方法制备得到：

（1）称取1.68 g NaHCO₃于烧杯中，加入超纯水搅拌溶解，然后转移到100 mL容量瓶中，加水定容，配置浓度0.2 mol/L的NaHCO₃溶液。

（2）分别称取1 mg、2 mg和6 mg大黄酸于相应的螺口瓶中，向每个螺口瓶中边震荡边加入1 mL浓度为0.2 mol/L的NaHCO₃溶液，然后以100 W的超声功率进行超声分散30 min，温度不超过37℃，分别制备出1 mg/mL、2 mg/mL的大黄酸溶液和6 mg/mL大黄酸超分子水凝胶。

分别将1 mg/mL、2 mg/mL的大黄酸溶液和6 mg/mL大黄酸超分子水凝胶进行电镜扫描。

电镜扫描的实验步骤：

1、硅片的清洗：先用水虎鱼（浓硫酸（v）∶双氧水（v）=7∶3）超声清洗15 min，然后用乙醇超声清洗15 min，最后用蒸馏水超声清洗15 min（2次），用氮气把硅片吹干。

2、将1 mg/mL、2 mg/mL的大黄酸溶液和6 mg/mL大黄酸超分子水凝胶，分别取10 μL于吹干净的硅片上，在冷冻12 h，放入冷冻干燥机中干燥12 h，然后进行电镜扫描。由于生物样品导电性差，扫描之前要喷金处理。

图1为本实施例1 mg/mL、2 mg/mL的大黄酸溶液和6 mg/mL的大黄酸超分子水凝胶电镜扫描结果。a、b、c分别为1 mg/mL、2 mg/mL、6 mg/mL的大黄酸超分子水凝胶，如图所示，当大黄酸浓度为1 mg/mL（溶液状态），所得到的SEM形貌是针状的纳米棒结构。随着浓度增加到2 mg/mL 时，纳米棒逐渐变粗，继续增加浓度到6 mg/mL时，最终获得的是具有三维网络空间结构大黄酸超分子水凝胶。随着浓度的增大，大黄酸分子从针状纳米棒通过非共价作用自组装形成纳米纤维。

实施例2

本发明的一种大黄酸超分子水凝胶，包括大黄酸和NaHCO₃溶液，大黄酸溶解于NaHCO₃溶液中，采用以下制备方法制备得到：

（1）称取1.68 g NaHCO₃于烧杯中，加入超纯水搅拌溶解，然后转移到100 mL容量瓶中，加水定容，配置浓度0.2 mol/L的NaHCO₃溶液。

（2）分别称取4 mg 和5 mg大黄酸于螺口瓶中，向螺口瓶中边振动边加入1 mL步骤（1）的NaHCO₃溶液，然后以70W的超声功率进行超声分散30 min，温度不超过37℃，制备出4 mg/mL的大黄酸溶液和5 mg/mL大黄酸超分子水凝胶。

用数码相机记录大黄酸溶液和大黄酸超分子水凝胶的外观。图3中，（a）为大黄酸溶液数码照片图，（b）为大黄酸超分子水凝胶的数码照片图。在大黄酸粉末中加入0.2 mol/L的NaHCO₃溶液获得乳状液，浓度达到5 mg/mL时，超声30 min后，大黄酸分子单体通过π-π键、氢键、离子键、疏水作用等非共价键作用通过自组装形成大黄酸超分子水凝胶，当浓度为4 mg/mL时，超声后不能形成大黄酸超分子水凝胶，得到的是大黄酸溶液，如图2（a）所示，所以5 mg/mL是大黄酸超分子水凝胶的临界凝胶浓度。

傅里叶红外测试实验步骤：把6 mg/mL的大黄酸超分子水凝胶冷冻干燥得到干凝胶，然后分别称取等质量的冻干水凝胶与一定质量的溴化钾压片，得到片状的样品，进行红外测试，大黄酸粉末固体作为对照。

图3为大黄酸超分子水凝胶和大黄酸粉末的傅里叶红外谱图。图3中曲线a是大黄酸粉末；曲线b是大黄酸超分子水凝胶。曲线a 中3448 cm^-1属于的O-H的伸缩振动吸收峰，1962 cm^-1和1630 cm^-1分别属于C=O的非对称和对称伸缩振动吸收峰，出现在1692 cm^-1和1452 cm^-1的吸收峰属于芳环骨架的伸缩振动峰，位于1268 cm^-1处的峰属于C-O的伸缩振动峰，出现在808 cm^-1处的峰属于O-H的弯曲振动吸收峰；曲线b 为大黄酸在碱性NaHCO₃中自组装形成大黄酸超分子水凝胶的图谱。在3446 cm^-1处是O-H的伸缩振动吸收峰，出现在1635 cm^-1处的峰属于C=O称伸缩振动吸收峰，这表明大黄酸超分子水凝胶的形成是通过氢键相互作用的，在1692 cm^-1处的峰消失了，在1378 cm^-1处出现了相对较宽的峰，说明了在自组装形成大黄酸超分子水凝胶的过程中发生了π-π堆积，氢键相互作用。

实施例3

一种本发明的大黄酸超分子水凝胶，包括大黄酸和NaHCO₃溶液，大黄酸溶解于NaHCO₃溶液中，采用以下方法制备得到：

（1）称取1.68 g NaHCO₃于烧杯中，加入超纯水搅拌溶解，然后转移到100 mL容量瓶中，加水定容，配置浓度0.2 mol/L的NaHCO₃溶液。

（2）分别称取5 mg、6 mg、7 mg和8 mg大黄酸于相应的螺口瓶中，向螺口瓶中边振动边加入1 mL实施例1的NaHCO₃溶液，以100 W的超声功率进行超声分散30 min，温度不能超过37℃，分别制备出5 mg/mL、6mg/mL、7 mg/mL和8 mg/mL的大黄酸超分子水凝胶。

分别将本实施例中5 mg/mL、6 mg/mL、7 mg/mL和8 mg/mL的大黄酸超分子水凝胶进行紫外测试。

测试结果如图4所示，不同浓度下的大黄酸超分子水凝胶紫外光谱显示，随着浓度的增大，其紫外吸收峰出现红移，可能是大黄酸分子发生π-π堆积。π-π堆积越显著，红移现象越明显。

实施例4

一种本发明的大黄酸超分子水凝胶在治疗小胶质细胞介导的炎症性疾病中的应用，具体方法包括以下步骤：

1. 药物的配制：

含药培基1的配制：取浓度为6 mg/mL的大黄酸超分子水凝胶母液，加入培养基中稀释得到含药培基1，含药培基1中大黄酸超分子水凝胶浓度4.5 μg/mL。

含药培基2的配制：取浓度为6 mg/mL的大黄酸单体母液，加入到培养基中，配制含药培基2，含药培基2中大黄酸单体浓度4.5 μg/mL。

2. 大鼠小胶质细胞（BV2细胞系）炎症性模型的制备：

大黄酸组：取处于对数生长期的BV2细胞，用胰酶消化液消化，制成细胞悬液；铺板，保证每孔70%的覆盖率。过夜，细胞贴壁；去除BV2细胞的培基，加入含药培基2，并标号；待于含药培基2处理30 min后，每孔加入1 μg/mL的脂多糖（LPS），处理48 h后收集细胞和上清液，进行后续检测。

大黄酸超分子水凝胶组：取处于对数生长期的BV2细胞，用胰酶消化液消化，制成细胞悬液；铺板，保证每孔70%的覆盖率。过夜，细胞贴壁；去除BV2细胞的培基，加入含药培基1，并标号；待含药培基1处理30 min后，每孔加入1 μg/mL的LPS，处理48 h后收集细胞和上清液，进行后续检测。

LPS组：取处于对数生长期的BV2细胞，用胰酶消化液消化，制成细胞悬液；铺板，保证每孔70%的覆盖率。过夜，细胞贴壁；去除BV2细胞的培基，加入新鲜不含药物的培基，并标号，30 min后，加入1 μg/mL的LPS，处理48 h后收集细胞和上清液，进行后续检测。

空白组：取处于对数生长期的BV2细胞，用胰酶消化液消化，制成细胞悬液；铺板，保证每孔70 %的覆盖率。过夜，细胞贴壁；去除BV2细胞的培基，加入新鲜不含药物的培基，并标号。

3. ELISA法测定小胶质细胞诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素6（IL-6）和白介素12（IL-12）的表达：

（1）实验仪器：台式高速冷冻离心机湘仪 （H1650R）；全自动酶标洗板机汇松 （PW-812）；多功能酶标分析仪汇松 （MB-530）；恒温培养箱光明（DHP-500）；自动平衡离心机湘仪（L530）；干净试管和离心管；容量瓶；系列可调节移液器及吸头。

（2）样本采集；分别收集每孔板中的细胞上清，于10000 rpm离心10 min，仔细吸取上清，-20℃冰箱保存留作实验的样本，实验之前从冰箱取出，自然解冻。

（3）实验试剂的配制：

本实施例中，试剂盒为武汉华美生物科技有限公司生产的ELISA法试剂盒，其中各试剂盒的批号如下：一氧化氮合酶试剂盒为Lot:A16039818，肿瘤坏死因子的试剂盒为Lot：Z06939817，白介素6的试剂盒为Lot:Z01039820，白介素12的试剂盒为Lot:Z01039822。

标准品：从试剂盒中取出一支标准品，于10000 rpm离心30 s。用1 mL 样本稀释液（本实施例为10 mmol/L的PBS（磷酸氢二钠～磷酸二氢钾），PH值为7.3，0.05 % 的吐温-20(体积比)，0.5%的牛血清蛋白（BSA）溶解，并用枪头对准冻存管底部反复吸打5次以助溶解，充分混匀得到标准品S₇，放置备用；取7个1.5 mL离心管，编号为S₆～S₀。将离心管依次排列，各加入250 μL样本稀释液。吸取250 μL标准品S₇到第一个离心管中（S₆），轻轻吹打混匀。从S₆中吸取250 μL到第二个EP管（S₅），轻轻吹打混匀，以此类推进行标准品的倍比稀释。S₀为样本稀释液。

洗涤工作液：将浓洗涤液（本实施例为0.02 mol/L PBS (PH=7.4)加上0.05%吐温-20）按1∶25倍用去离子水进行稀释，具体为：用量筒量取240 mL去离子水，倒入烧杯或其他洁净容器中，再量取10 mL浓洗涤液，均匀加入，搅拌混匀，在临用前配妥。浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。

生物素标记抗体工作液： 将生物素标记抗体液（本实施例为10 mg/mL生物素 N- 羟基琥珀酰亚胺酯溶液）按1∶100倍用生物素标记抗体稀释液进行稀释，具体为：10 μL生物素标记抗体液加990 μL生物素标记抗体稀释液，轻轻混匀，在临用前10 min内配妥。

辣根过氧化物酶标记亲和素工作液：辣根过氧化物酶标记亲和素（本实施例采用的为武汉华美生物科技有限公司生产的辣根过氧化物酶标记亲和素）按1∶100倍用辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液进行稀释，具体为：10 μL辣根过氧化物酶标记亲和素加990 μL辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液，轻轻混匀，在临用前10 min。

（4）操作步骤：

4.1、将各种试剂移至室温（18～25℃）平衡至少30 min，按前述方法配置试剂，备用。

4.2、加样：分别设标准孔和待测样本孔，每孔分别加标准品或待测样本100 μL，轻轻晃动混匀，覆上板贴，置37 ℃温育2 h。

4.3、弃去液体，甩干，不用洗涤。

4.4、每孔加生物素标记抗体工作液100 μL，覆上新的板贴，置37℃温育1 h。

4.5、弃去孔内液体，甩干，采用配制的洗涤工作液洗板3次。每次洗板，将洗涤工作液浸泡2 min，200 μL每孔，甩干。

4.6、每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100 μL，覆上新的板贴，置37℃ 温育1 h。

4.7、弃去孔内液体，甩干，洗板5次。每次浸泡2 min，200 μL每孔，甩干。

4.8、依序每孔加底物溶液90 μL，37℃ 避光显色15 min。

4.9、依序每孔加终止液（本实施例为2 mol/L H₂SO₄溶液）50 μL，终止反应。

4.10、在反应终止后5 min内用酶标仪在450 nm波长依序测量各孔的光密度（OD值），计算各个炎症因子的含量。实验结果分别见图5、图6、图7和图8。

图5为大黄酸超分子水凝胶和大黄酸对LPS诱导BV2细胞诱导型一氧化氮合酶（iNOS）水平的影响，从图5可以看出：与空白组比(^#p＜0.01)，LPS组iNOS水平显著增加，说明LPS 刺激BV2细胞产生iNOS水平明显增加；与LPS组比较，大黄酸组iNOS表达水平明显降低（^△p＜0.05），大黄酸超分子水凝胶组iNOS表达水平也显著下降（*p＜0.01），这说明大黄酸和大黄酸超分子水凝胶均能抑制iNOS的表达水平；与大黄酸组比，大黄酸超分子水凝胶组iNOS表达水平明显下降（^□p＜0.01），这说明大黄酸超分子水凝胶抑制iNOS的表达明显优于大黄酸。

图6为大黄酸超分子水凝胶和大黄酸对LPS诱导BV2细胞肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平的影响，从图6可以看出：与空白组比( ^#p＜0.01 )，LPS组TNF-α水平显著增加，说明LPS 刺激BV2细胞产生TNF-α水平明显增加；与LPS组比较，大黄酸组TNF-α表达水平明显降低（^△p＜0.05），大黄酸超分子水凝胶组TNF-α表达水平也显著下降（^*p＜0.01），这说明大黄酸和大黄酸超分子水凝胶均能抑制TNF-α的表达水平；与大黄酸组比，大黄酸超分子水凝胶组TNF-α表达水平明显下降（^□p＜0.01），这说明大黄酸超分子水凝胶抑制TNF-α的表达明显优于大黄酸。

图7为大黄酸超分子水凝胶和大黄酸对LPS诱导BV2细胞白介素6（IL-6）水平的影响，从图7可以看出：与空白组比(^#p＜0.01)，LPS组IL-6水平显著增加，说明LPS 刺激BV2细胞产生IL-6水平明显增加；与LPS组比较，大黄酸组IL-6表达水平明显降低（^△p＜0.05），大黄酸超分子水凝胶组IL-6表达水平也显著下降（^*p＜0.01），这说明大黄酸和大黄酸超分子水凝胶均能抑制IL-6的表达水平；与大黄酸组比，大黄酸超分子水凝胶组IL-6表达水平明显下降（^□p＜0.01），这说明大黄酸超分子水凝胶抑制IL-6的表达明显优于大黄酸。

图8为大黄酸超分子水凝胶和大黄酸对LPS诱导BV2细胞白介素12（IL-12）水平的影响，从图8可以看出：与空白组比(^#p＜0.01)，LPS组IL-12水平显著增加，说明LPS刺激BV2细胞产生IL-12水平明显增加；与LPS组比较，大黄酸组IL-12表达水平明显降低（^△p＜0.05），大黄酸超分子水凝胶组IL-12表达水平也显著下降（^*p＜0.01），这说明大黄酸和大黄酸超分子水凝胶均能抑制IL-12的表达水平；与大黄酸组比，大黄酸超分子水凝胶组IL-12表达水平明显下降（^□p＜0.01），这说明大黄酸超分子水凝胶抑制IL-12的表达明显优于大黄酸。

综上所述，本发明的大黄酸超分子水凝胶能减少显著降低一氧化氮合酶、肿瘤坏死因子、白介素6、白介素12等细胞炎症因子的表达，这表明，从而大黄酸超分子水凝胶可以用于治疗或减轻阿尔茨海默病、帕金森病、脑外伤、脑水肿等小胶质细胞介导的中枢神经系统疾病，在制备治疗小胶质细胞介导相关疾病药物、小胶质细胞炎症性疾病药物、阿尔茨海默病、帕金森病、脑外伤、脑水肿药物、小胶质细胞介导的炎症性脑病药物、保护神经细胞药物中发挥着重要的作用。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。