莱菔硫烷在制备治疗白血病药物中的应用的制作方法

本发明涉及莱菔硫烷的新用途技术领域，具体涉及莱菔硫烷在治疗白血病药物中的应用。

背景技术：

莱菔硫烷（sulforaphane，sfn）是一种存在于西兰花和其它十字花科蔬菜中的异硫氰酸盐物质，具有抗增殖能力，目前研究发现sfn对卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤细胞的生长具有抑制作用，是一种新型的抗癌成分。但是，sfn对造血肿瘤细胞的作用及机制则报道较少。

细胞周期失控是引起恶性增殖性疾病的重要原因之一。急性白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病，白血病细胞因为增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等机制在骨髓和其它造血组织中大量增殖，并浸润其它组织和器官，同时正常造血受抑制。bcl-2基因家族是与细胞凋亡紧密相关的家族，其中bcl-2和bax分属bcl-2家族中的抑制凋亡和促进凋亡的两部分，bcl-2发挥保护细胞的作用，减少细胞凋亡，而bax则发挥诱导细胞凋亡的作用，两者在细胞内的表达维持在平衡状态，形成一个凋亡调节系统，共同调控细胞增殖和凋亡。当bax过度表达时形成bax-bax同源二聚体，促进细胞凋亡；随着bcl-2表达量上升，bax同源二聚体便分开，bcl-2与bax可以形成比bax-bax更稳定的bax-bcl-2二聚体，则抑制细胞的凋亡。因此，bax/bcl-2两蛋白之间的比例关系是决定对细胞凋亡抑制作用强弱以及恶性肿瘤预后的关键因素。含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解（caspase），caspase是一组存在于细胞质中具有类似结构的蛋白酶。caspase与真核细胞凋亡密切相关，并参与细胞的生长、分化与凋亡调节，也是细胞凋亡通路的重要组成部分。其中，caspase-3被认为是一个涉及在不同的细胞系凋亡执行最常见的成员，这些蛋白质控制线粒体外膜通透性（momp）和线粒体膜间隙蛋白如细胞色素c的释放。

在各类成人白血病中，以急性髓系白血病（acutemyeloidleukaemia，aml）发病率最高，且化疗缓解率较低。kgla细胞和k562细胞是分别来源于急性髓系白血病耐药的细胞株和慢性白血病急性变的患者中分离建立的细胞株，是目前研究急性髓系白血病的理想模型，本发明以不同浓度的sfn作用kg1a细胞和k562细胞，观察其对白血病细胞增殖、凋亡及相关基因表达的影响，分析sfn抑制白血病细胞增殖的作用和机制。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供莱菔硫烷的新用途，即莱菔硫烷在制备治疗白血病药物中的新应用。

实际上，本发明涉及莱菔硫烷在制备治疗白血病药物中的新应用，即莱菔硫烷通过调控细胞凋亡抑制白血病细胞的增殖。

具体的，本发明涉及莱菔硫烷在制备治疗白血病药物中的新应用，即莱菔硫烷通过调控bax基因、bcl-2基因和caspase-3基因诱导白血病细胞凋亡进而抑制白血病细胞的增殖。

本发明所涉及莱菔硫烷在制备治疗白血病药物中的新应用，即莱菔硫烷通过上调bax基因和caspase-3基因及下调bcl-2基因促进白血病细胞凋亡进而抑制白血病细胞的增殖。

进一步限定，所述的白血病细胞为kg1a细胞和k562细胞。

本发明首次系统探讨了sfn对急性白血病细胞kg1a和k562细胞凋亡的影响，结果证明sfn可以通过调控bax基因、bcl-2基因和caspase-3基因促进急性白血病细胞凋亡，这不仅是理论上的突破，而且具有潜在的临床意义，为治疗白血病提供了一种全新的思路和潜在的治疗路径。

附图说明

图1是sfn对kgla细胞和k562细胞增殖活力的影响图，cck8检测和显微镜观察显示不同浓度的sfn（0、4、8、12μmol/l）作用于kgla细胞和k562细胞后，细胞增殖活力随着细胞浓度和作用时间延长而降低；

图2是流式细胞仪检测sfn对kgla细胞和k562细胞凋亡的影响图，结果显示不同浓度的sfn（0、4、8、12μmol/l）作用kgla细胞48h的早期凋亡率分别为0、3.12%、13.33%、28.18%，不同浓度的sfn（0、4、8、12μmol/l）作用k562细胞48h的早期凋亡率分别为0、2.81%、10.68%、30.27%；

图3是westernblotting检测sfn对白血病细胞中bax基因、bcl-2基因和caspase-3基因蛋白表达的影响图；

图4是rt-pcr检测sfn在白血病细胞中对凋亡基因bax、bcl-2和caspase-3的影响图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。

实施例

1、实验材料

莱菔硫烷（批号28911701）购自美国lktlaboratories公司，纯度98%。1640培养液和胎牛血清为美国gibco公司产品。cck-8试剂盒购自日本dojindo公司，annexin-v/pi细胞凋亡检测试剂（美国bd公司，批号5121706），rna提取试剂盒、逆转录试剂盒、pcr试剂2×taqpcrmastermix、dnamarker均购自上海天根，琼脂糖（西班牙biowest），引物由上海生物工程公司合成，兔抗人baxmab、兔抗人bcl-2mab、兔抗人caspase-3mab为美国abcam公司产品，抗人gapdhpab及hrp-羊抗兔pab为世纪康为公司提供。流式细胞仪（facscaibur型）为美国bd公司产品，mk3酶标仪和nd2000超微量分光光度计系美国thermo公司产品，凝胶图像分析系统由英国genegenius公司生产，流式细胞仪为美国bd公司，eclipseti-s倒置显微镜购自日本nikon公司。

2、细胞培养

人急性髓系白血病细胞kgla和k562细胞株由本实验室保存，以含10%胎牛血清rpmi1640培养基培养，培养基中预先加入青霉素l00u/ml、链霉素100μg/ml、谷氨酰胺100μmol/l，置体积分数为5%的co2培养箱于37℃培养，根据细胞生长状态及时换液传代，取对数生长期细胞做后续试验。

3、细胞增殖实验

将传代培养的对数生长期细胞，计数，按照每孔细胞密度为1×10⁵/l接种于96孔培养板内，分别加入终浓度分别为0、2、4、6、8、10、12μmol/l的sfn（0.9%ns溶解稀释为2×10³μmol/l），37℃培养24h、48h、72h后，每孔加入cck-8试剂10ul继续孵育4h，在酶联免疫检测仪od值为450nm处测量各孔的od值，实验重复3次，取平均值。细胞相对存活率=（实验组-空白组）/（对照组-空白组）×100%。根据kg1a细胞存活率，绘制细胞生长曲线，选取合适sfn浓度做后续实验。

4、流式分析细胞凋亡

收集0、4、8、12μmol/lsfn处理后的kg1a细胞1×10⁶/l，用预冷pbs洗涤细胞2次，加入100μl的1×bindingbuffer悬浮细胞；加5μl的annexinv-fitc混匀后，再加入5μl的pi染色，4℃避光孵育15min后，加入400μl的1×bindingbuffer悬浮细胞，上流式细胞仪检测。每管获取10000个细胞，用cellquest分析软件分析凋亡率。

5、westernbloting分析bax、bcl-2和caspase-3的蛋白

收集0、4、8、12μmol/lsfn作用48h后的kg1a细胞，用冰预冷的sds裂解缓冲液溶解20min，12000×g离心15min，抽提蛋白，bca蛋白浓度检测试剂盒测定蛋白含量，蛋白上样量为30μg，10wt%sds-page电泳；电转到pvdf膜，5wt%的脱脂奶粉封闭，1:1000一抗4℃过夜，tbst洗膜3次之后，1:5000二抗室温2h，再用tbst洗涤3次，ecl化学发光液显影拍照。用imagej对实验结果进行分析。

6、rt-pcr检测bax、bcl-2和caspase-3的mrna表达

收集0、4、8、12μmol/lsfn处理48h后的kg1a细胞，用trizol法提取总rna，用核酸蛋白定量仪检测rna纯度和浓度，纯度在1.8-2.0之间，浓度在1-3μg/μl。用逆转录试剂盒进行逆转录合成cdna，转录体系为20ul。bax引物序列上游引物：5’-tttgcttcagggtttcatcc-3’，下游引物5’-cagttgaagttgccgtcaga-3’，扩增产物246bp；bcl-2引物序列上游引物：5’-ggatgcctttgtggaactgt-3’，下游引物：5’-agcctgcagctttgtttcat-3’，扩增产物236bp；caspase-3：5’-tgtttgtgtgcttctgagcc-3’，5’-cacgccatgtcatcatcaac-3’，扩增产物817bp；内参β-actin引物序列上游引物：5’-agagctacgagctgcctgac-3’，下游引物5’-agcactgtgttggcgtacag-3’，扩增产物183bp。所用引物由上海生工生物技术有限公司合成。pcr反应体系为20μl，pcr扩增试剂盒taqpcrmastermix10μl，上下游引物各0.4μl，cdna1μl，95℃预变性3min，94℃30s，扩增参数55℃30s，72℃60s，30个循环，72℃延伸5min。取5μlpcr产物上样于1wt%的琼脂糖凝胶中，于80v电泳30min。取出凝胶置于凝胶成像分析系统中观察，imagej软件进行扫描灰度值并分析结果。

7、实验结果

1、从图1可以清楚看到sfn对kg1a细胞和k562细胞的生长增殖具有明显的抑制现象，并且随着sfn作用时间延长和剂量增大其增殖呈明显下降趋势。

2、从图2可以看出sfn可以诱导白血病细胞的凋亡，在sfn作用kg1a细胞和k562细胞48h后，经过annexinv-fitc/pi双染，流式细胞仪检测发现随着sfn浓度的增加，kg1a细胞的早期凋亡率逐渐增加，0、4、8、12μmol/lsfn作用kg1a细胞和k562细胞48h后，早期凋亡率分别为0、3.12%、13.33%、28.18%和0、2.81%、28.18%和30.27%。由此可知sfn可以诱导白血病细胞凋亡，并且随着sfn浓度的增加，kg1a细胞和k562细胞的早期凋亡率呈逐渐增加趋势。

3、从图3可以看出用0、4、8、12μmol/l的莱菔硫烷干预kg1a细胞、k562细胞48h后，bax和caspase-3蛋白表达显著增高，各浓度组与0μmol/l比较差异有统计学意义（p﹤0.05），而bcl-2表达有所下降，12μmol/l与0μmol/l比较差异有统计学意义（p﹤0.05）。结果表明莱菔硫烷可能通过上调bax基因，下调bc-l2基因表达促进细胞凋亡，并且这种表达调控存在于蛋白表达水平。

4、图4采用了pt-pcr检测方法，结果进一步验证了莱菔硫烷具有上调bax基因和caspase-3基因及下调bcl-2基因的功能，莱菔硫烷可以通过上调bax基因和caspase-3基因及下调bcl-2基因促进白血病细胞凋亡，进而抑制白血病细胞的增殖。

以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。

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<110>新乡医学院

<120>莱菔硫烷在制备治疗白血病药物中的应用

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