小分子多肽KP‑6在制备治疗慢性肾脏病的药物中的用途的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及一种独特的小分子多肽在治疗慢性肾脏病(CKD)中的用途，具体是涉及KP-6多肽在制备治疗CKD药物中的用途。

背景技术：

慢性肾脏病(CKD)最终进展至终末期肾功能衰竭(ESRD)，患者终身依赖“肾脏替代治疗”来维持生命。在过去的几十年中，伴随着人类社会的人口老龄化，CKD患病率呈现逐年上升趋势(Nat Rev Nephrol,2011,7:684-696)。有资料表明，CKD正成为一种“公众健康问题”，严重危害人类健康并消耗大量卫生资源。然而，目前临床上尚缺乏有效延缓CKD进展的药物。针对CKD的发病机制，寻找有效地抑制或延缓CKD进展的药物无疑是当前肾脏病学界的当务之急，成为亟待攻克的战略重点之一。

肾脏纤维化是CKD的共同途经，其特征是细胞外基质过量表达和沉积，导致组织结构损伤，疤痕形成，毛细血管丢失和组织缺氧，最终肾脏功能衰竭。大量研究表明，Wnt/β-catenin信号的持续激活是肾脏纤维化和CKD发生发展的一个关键途经(Kidney Int Supple2014,4:84-90)。因此，寻找阻断Wnt/β-catenin信号途经的对策，对于抑制肾脏纤维化的发生发展具有重要的理论意义和临床应用价值。

Wnt的配体在体内可以与不同的蛋白质结合，从而调节其生物学活性。蛋白质相互作用通常是通过特定的氨基酸序列所组成的结构域完成的。本发明涉及通过筛选多肽文库，发现一个特异的小分子多肽(KP-6)，能抑制肾脏纤维化的关键信号通路。KP-6多肽无前人报道，它在氨基酸序列结构上与抗衰老蛋白klotho分子的一段序列同源。有文献报道，klotho能结合Wnt配体，阻断Wnt/β-catenin信号传导(JAm SocNephrol.2013,24:771-785)，从而抑制肾脏纤维化，延缓慢性肾病进展。

KP-6作为一种新颖的、有效的小分子多肽，抑制肾组织损伤和肾脏纤维化、延缓或/和逆转慢性肾脏病的病程。

单侧输尿管结扎(UUO)是经典的CKD动物模型，其特点是可以快速完整地展示梗阻肾脏间质纤维化不同病理阶段和特征，包括炎细胞浸润、小管细胞的增殖和凋亡、肌成纤维细胞的活化、纤连蛋白(Fibronectin)和I型胶原(Collagen I)的沉积。缺血-再灌注(IRI)模型是经典的急性肾损伤(AKI)向慢性肾脏病(CKD)进展的模型。单侧肾脏进行缺血-再灌注(IRI)手术后10天，然后合并进行对侧肾脏的切除(UIRI)，能够明显展示慢性肾脏纤维化的病理过程，其造模方法简便易行，成功率高，且具备手术切口小、手术时间短及并发症少的优点，建立的模型适合于急性肾损伤向慢性肾纤维化进展的研究。

在病理上，通常采用Masson染色，来观察组织细胞外胶原蛋白沉积情况。而更具体的组织纤维化则常常应用肌成纤维细胞的标志α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤连蛋白和I型胶原的免疫染色和免疫印迹方法(Western blotting)来定性、定量观察和评估。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供小分子多肽(命名为KP-6)在制备治疗慢性肾脏病的药物中的用途。所述多肽KP-6的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：QPVVTLYHWDLPQRLQDAYGGWANRALADH。

根据本发明所述的用途的进一步特征，所制备的药物包括：治疗上有效的小分子多肽(命名为KP-6)，以及药学上可接受的辅料。

本发明的目的还在于提供小分子多肽KP-6的衍生物在制备治疗慢性肾脏病的药物中的用途。

根据本发明所述的用途的进一步特征，KP-6的衍生物包括：含有KP-6氨基酸序列的更短肽段、氨基酸替代后的KP-6相关多肽，以及化学修饰后的KP-6及其更短肽段。

本发明的实验证明，小分子多肽(KP-6)在小鼠动物实验中无明显毒副作用。发明人对KP-6进行单侧输尿管梗阻(UUO)和单侧缺血再灌注损伤(UIRI)肾病模型实验。结果表明：与UUO或UIRI模型组比较，KP-6组肾脏间质胶原沉积显著减少，α平滑肌肌动蛋白、纤连蛋白均显著降低，β连环蛋白(β-catenin)及其下游靶基因表达明显下调，表明KP-6能拮抗Wnt/β-catenin信号通路，有效抑制UUO和UIRI肾脏组织纤维化。

综上所述，KP-6具有显著抑制肾脏组织纤维化和CKD进展的作用，且无明显毒副作用，因此可用于制备有效治疗慢性肾脏病的药物。

附图说明

图1是KP-6的筛选和鉴定。人肾小管上皮细胞(HKC-8)转染Wnt1质粒之后，给予不同的小分子多肽处理。图1中，A图显示第1到第6号小分子多肽对Wnt1表达后纤维化相关蛋白的拮抗作用；B图第6号小分子多肽(KP-6)对TGF-β表达后纤维化相关蛋白的拮抗作用；C图显示KP-6的氨基酸序列。

图2是UUO模型各组小鼠肾脏Masson染色图。图2中，左：假手术组；中：UUO模型组；右：UUO+KP-6。

图3是UUO模型各组小鼠肾脏纤维化指标的免疫染色图。该图中，Sham：假手术组；UUO：模型对照组；UUO+KP-6：用药组。

图4是UUO模型各组小鼠肾组织β-catenin及其下游靶基因蛋白水平的免疫印迹图。其中，图4A为免疫印迹检测的代表性结果；图4B为所有结果的统计图。Sham：假手术组；UUO：模型对照组；UUO+KP-6：用药组。

图5是UIRI模型各组小鼠肾脏Masson染色图。该图中，左：假手术组；中：UIRI模型组；右：UIRI+KP-6。

图6是UIRI模型各组小鼠肾脏纤维化指标的免疫染色图。该图中，Sham：假手术组；UIRI：模型对照组；UIRI+KP-6：用药组。

图7是免疫印迹法检测各组小鼠肾脏β-catenin及其下游靶基因蛋白水平。其中，图7A为免疫印迹检测的代表性结果；图7B为所有结果的统计图。

具体实施方式

下面仅以实施例的方式结合附图对本发明做进一步的说明。

实施例一：KP-6小分子多肽的筛选

1.实验材料：

细胞：人肾小管上皮细胞。

培养液：含10％FBS的DMEM/F129(1:1)培养液。

培养条件：37℃含5％CO₂培养箱。

小分子多肽文库：由计算机设计产生18条多肽序列，平均每条长度为30氨基酸，交由南京金斯瑞生物科技公司人工合成，建成小分子多肽文库，进行以下实验。

2.实验处理：

(I)将培养好的人肾小管上皮细胞以1.5×10⁶种于6孔细胞培养板，培养1天，饥饿24小时，提前1小时给予18种不同的小分子多肽(10μg/ml)。然后转染Wnt1质粒，24小时后收取蛋白，进行Western blot实验，筛选其中对Wnt1诱导纤连蛋白抑制最强的肽段。

(II)将培养好的人肾小管上皮细胞以1.5×10⁶种于6孔细胞培养板，培养1天，提前1小时给予肽段6号(KP-6)(10μg/ml)。然后，加入TGF-β(2ng/ml)刺激，24小时后收取蛋白，进行Western blot实验。

3.实验结果

(I)实验结果如图1A所示，部分小分子肽段能抑制Wnt1所介导的纤连蛋白(Fibronectin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达。其中第6肽段(命名为KP-6)抑制作用最强。

(II)如图1B所示，KP-6能抑制TGF-β所引起的纤维化相关基因的表达。因此，KP-6作为一种新颖的小分子多肽，能拮抗Wnt和TGF-β活性，阻断体内关键的促纤维化信号通路，从而抑制纤维化相关蛋白的表达。

(III)KP-6的氨基酸序列

多肽KP-6的氨基酸序列为QPVVTLYHWDLPQRLQDAYGGWANRALADH(SEQ ID NO.1)。

实施例二：小分子多肽KP-6对小鼠UUO模型肾脏纤维化的抑制作用

1.实验动物：C57小鼠，雌雄匹配，体重20-22g，SPF级。

先将动物称重、编号，选择健康、体重在20-22g的小鼠12只，随机分为3组，每组4只。包括假手术组、模型对照组及用药组。

2.实验分组

1)假手术组：室温，3％戊巴比妥钠以1ml/公斤体重麻醉小鼠后，选择左侧腹2-3cm为切口；局部消毒后，逐层切开皮肤、皮下、肌层及腹膜，发现左侧输尿管后，随即逐层缝合。局部消毒后，核实标记，置于相应鼠笼。

2)模型对照组：同上麻醉、消毒。逐层切开皮肤、皮下、肌层及腹膜，找到左侧输尿管后，于输尿管上1/3段结扎，逐层缝合。局部消毒后，核实标记，置于相应鼠笼。

3)用药组：同上麻醉、消毒。逐层切开皮肤、皮下、肌层及腹膜，找到左侧输尿管后，于输尿管上1/3段结扎，逐层缝合。局部消毒后，核实标记，置于相应鼠笼。

3.实验过程

KP-6水溶性的粉末用无菌的生理盐水稀释为25mg/ml的储存浓度。实验各组分笼饲养。假手术组仅观察。模型对照组仅给予生理盐水尾静脉注射。用药组予以UUO开始后的连续6天以含有0.5mg/kg体重的KP-6的1ml生理盐水尾静脉注射。饲养7天后杀死各组小鼠，均取左侧肾脏，分别予以10％中性缓冲甲醛固定及液氮冷冻组织。甲醛固定组织在经脱水、包埋、切片、制片后，分别予以Masson染色及平滑肌肌动蛋白α、纤连蛋白免疫染色。冰冻组织匀浆后提取蛋白，用免疫印迹法(Western Blot)检测β-catenin及其靶基因表达水平。

4.实验结果

1)Masson染色检测肾脏组织纤维化程度

(I)、KP-6减少UUO小鼠肾间质胶原沉积

实验结果如图2所示，用药组小鼠肾间质胶原沉积明显低于模型对照组。

(II)、KP-6减少UUO小鼠肾间质纤维化

实验结果如图3所示，与模型对照组比较，用药组小鼠肾间成纤维细胞特异性蛋白1(Fsp1)、平滑肌肌动蛋白α(α-SMA)水平明显降低。

(III)、KP-6抑制UUO小鼠的异常活化的β-catenin信号通路

实验结果如图4所示，与模型对照组比较，用药组小鼠肾脏的β-catenin蛋白及其下游靶基因蛋白PAI-1和MMP-7明显降低。

实施例三：小分子多肽KP-6对小鼠UIRI模型肾脏纤维化的抑制作用

1.实验动物：BABL/c小鼠，雄性，体重20-22g，SPF级。

先将动物称重、编号，选择健康、体重在20-22g的小鼠18只，随机分为3组，每组6只。包括生理盐水组、模型对照组及用药组。

2.实验各组

1)假手术组：室温，3％戊巴比妥钠以1ml/公斤体重麻醉小鼠后，选择左侧腹2-3cm为切口；局部消毒后，逐层切开皮肤、皮下、肌层及腹膜，发现左侧肾蒂后随即逐层缝合。局部消毒后，核实标记，置于相应鼠笼。

2)模型对照组：同上麻醉、消毒。逐层切开皮肤、皮下、肌层及腹膜，找到左侧肾蒂后用无损伤微型动脉夹迅速阻断左侧肾蒂，可见肾脏有鲜红变成紫黑色，表示夹闭成功，将小鼠置于37度的金属加热板上，计时35分钟，手术结束后逐层缝合。局部消毒后，核实标记，置于相应鼠笼。于术后第10天行右侧肾切除，同上麻醉、消毒。行右侧背部1-2cm切口，先结扎右侧肾蒂，再切除右侧肾，手术结束后逐层缝合。局部消毒后，核实标记，置于相应鼠笼。

3)用药组：同上麻醉、消毒。逐层切开皮肤、皮下、肌层及腹膜，找到左侧肾蒂后用无损伤微型动脉夹迅速阻断左侧肾蒂，可见肾脏有鲜红变成紫黑色，表示夹闭成功，将小鼠置于37度的金属加热板上，计时35分钟，手术结束后逐层缝合。局部消毒后，核实标记，置于相应鼠笼。于术后第10天行右侧肾切除，同上麻醉、消毒。行右侧背部1-2cm切口，先结扎右侧肾蒂，再切除右侧肾，手术结束后逐层缝合。局部消毒后，核实标记，置于相应鼠笼。

3.实验过程

KP-6水溶性的粉末用无菌的生理盐水稀释为25mg/ml的储存浓度。各组分笼饲养。假手术组仅观察。模型对照组仅给予生理盐水尾静脉注射。用药组予以缺血再灌注损伤开始后的连续10天以含有0.5mg/kg体重的KP-6的1ml生理盐水尾静脉注射。饲养第11天杀死各组小鼠，收集血标本，均取左侧肾脏，分别予以10％中性缓冲甲醛固定及液氮冷冻组织。甲醛固定组织在经脱水、包埋、切片、制片后，分别予以Masson染色及平滑肌肌动蛋白α、纤连蛋白免疫染色。冰冻组织匀浆后提取蛋白，用免疫印迹法(Western Blot)检测β-catenin及其靶基因表达水平。

4.实验结果

1)Masson染色检测肾脏组织纤维化程度

(I)、KP-6减少UIRI小鼠肾间质胶原沉积

实验结果如图5所示，用药组小鼠肾间质胶原沉积明显低于模型对照组。

(II)、KP-6减少UIRI小鼠肾间质纤维化

实验结果如图6所示，与模型对照组比较，用药组小鼠肾组织成纤维细胞特异性蛋白1、平滑肌肌动蛋白α、纤连蛋白水平明显降低。

(III)、KP-6抑制UIRI小鼠的异常活化的β-catenin信号通路

实验结果如图7所示，与模型对照组比较，用药组小鼠肾脏的β-catenin蛋白及其下游靶基因蛋白PAI-1和Snail明显降低。

综上所述，KP-6可以明显减少UUO、UIRI小鼠肾间质胶原蛋白沉积，显著降低UUO、UIRI小鼠肾组织纤连蛋白、I型胶原α-SMA表达水平，并可以明显抑制CKD模型中的异常活化的β-catenin信号通路。因此，KP-6可以成为有效抑制CKD进展的新药。

SEQUENCE LISTING

<110> 南方医科大学南方医院

<120> 小分子多肽KP-6在制备治疗慢性肾脏病的药物中的用途

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Gln Pro Val Val Thr Leu Tyr His Trp Asp Leu Pro Gln Arg Leu Gln

1 5 10 15

Asp Ala Tyr Gly Gly Trp Ala Asn Arg Ala Leu Ala Asp His

20 25 30