抗氧化剂的制作方法

本公开涉及抗氧化剂。

背景技术：

在体内利用氧进行代谢的过程中会产生活性氧(ros：reactiveoxygenspecies)。所产生的活性氧中的大部分经抗氧化物质或抗氧化酶的作用而被除去，过剩产生的活性氧会对dna、脂类、酶、蛋白质这样的重要生物成分进行氧化。众所周知，这些生物成分的氧化关系到促使衰老，会引发皮肤的皱纹、斑、暗沉等。并且，生物成分的氧化还关系到糖尿病、高血压、动脉硬化等疾病的发作。因此，去除体内的活性氧的抗氧化剂对美容以及维持健康十分有用。

作为抗氧化剂的有效成分，白藜芦醇受到关注。白藜芦醇多用于以美容或改善健康功能为目的的功能性食品等(参照专利文献1)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2012-100589号公报

技术实现要素：

发明要解决的问题

在如上所述的背景下，本申请的发明人对将白藜芦醇的抗氧化功效增强到现有技术的水准以上的方法反复进行了研究探讨。结果发现通过将白藜芦醇与特定成分一并使用，会显著增强白藜芦醇的抗氧化功效。

本公开提供一种可发挥良好的抗氧化功效的抗氧化剂。

解决问题的技术方案

本公开提供一种抗氧化剂，其含有(a)6-甲基亚磺酰基己基异硫氰酸酯(以下称为6-msitc)、以及(b)白藜芦醇作为主要成分，其中，所述(a)6-甲基亚磺酰基己基异硫氰酸酯与所述(b)白藜芦醇的配合比为，相对于1摩尔所述(a)6-甲基亚磺酰基己基异硫氰酸酯，所述(b)白藜芦醇为0.06摩尔以上且小于16摩尔。

根据本申请的发明人的研究结果，若以如上所述的特定的配合比混合所述(a)6-甲基亚磺酰基己基异硫氰酸酯和所述(b)白藜芦醇，则发现由两组分会产生协同效应，由此发挥高抗氧化功效，而该高抗氧化功效是在单独使用白藜芦醇的情形下无法获取的。由后述的实施例具体明示如上所述的功效。若对使用本公开的抗氧化剂的情形与单独使用白藜芦醇的情形进行比较，则为了体现相同程度的抗氧化功效，本公开的抗氧化剂所需的白藜芦醇的量少于单独使用白藜芦醇时的量。

因此，根据本公开的抗氧化剂，能够在不降低抗氧化功效的同时降低白藜芦醇的配合量。或者，根据本公开的抗氧化剂，能够在不增加白藜芦醇的配合量的同时增强抗氧化功效。

附图说明

图1是示出在白藜芦醇单独处理区以及在6-msitc单独处理区中的活性氧的产生抑制率的图。

图2是示出在6-msitc单独处理区以及在白藜芦醇与6-msitc的混合处理区中的活性氧的产生抑制率的图。

图3是示出在白藜芦醇单独处理区以及在白藜芦醇与6-msitc的混合处理区中的活性氧的产生抑制率的图。

图4是示出由白藜芦醇与6-msitc的混合处理产生的协同效应的图。

具体实施方式

[抗氧化剂的概要]

本公开的“抗氧化剂”是指具有抗氧化功效的制剂。大量产生活性氧的情形表示氧化作用高，抑制活性氧的产生的情形表示具备抗氧化功效。

本公开的抗氧化剂中的主要成分为，6-甲基亚磺酰基己基异硫氰酸酯(6-methylsulfinyhexylisothiocyanate)(简称：6-msitc)、以及白藜芦醇(resveratrol)[别称：反式-1，2-(3，4’，5-三羟基二笨)乙烯]。

本公开使用的白藜芦醇除可以是利用有机化学合成或利用微生物合成的高纯度白藜芦醇之外，还可以使用来自植物的提取物。作为所述植物可列举例如葡萄、落花生、花生米以及虎杖等蓼科植物等。此外，白藜芦醇也可以使用市售品。

本公开使用的6-msitc可以通过化学合成法获取，也可以是从植物提取精炼而成的6-msitc。作为所述植物可列举例如：藜木科(bataceae)、十字花科(brassicaceae)、伯乐树科(bretschneideraceae)、山柑科(capparaceae)、番木瓜科(caricaceae)、大戟科(euphorbiaceae)、环蕊科(gyrostemonaceae)、池花科(limnanthaceae)、辣木科(moringaceae)、瘤药树科(pentadiplandraceae)、商陆科(phytolaccaceae)、海桐科(pittosporaceae)、木犀草科(resedaceae)、刺茉莉科(salvadoraceae)、烈味三叶草科(tovariaceae)、旱金莲科(tropaeolaceae)的植物等。具体有，例如山嵛菜(wasabiajaponica)[别称：山葵]、西洋山嵛菜(armoraciarusticana)[别称：西洋山葵]、白楔(batismaritima)、芥菜(brassicajuncea)、花椰菜(brassicaoleraceavar.italica)、拟南芥(arabidopsisthaliana)、荠菜(capsellabursa-pastoris)、豆瓣菜(nasturtiumofficinale)、伯乐树属(bretschneiderasinensis)、续随子(capparisspinosa)、番木瓜(caricapapaya)、drypetesroxburghii(中文名不详)；putranjivaroxburghii(中文名不详)、tersoniabrevipes(中文名称不详)、荷包蛋花(limnanthesdouglasii)、辣木(moringaoleifera)、pentadiplandrabrazzeana(中文名不详)、垂序商陆(phytolaccaamericana)、bursarisspinosevar.incana(中文名不详)、白木犀草(resedaalba)、山柑藤(salvadorapersica)、芹味草(tovariapendula)、旱金莲(tropaeolummajus)等。不过，本公开可使用的6-msitc不限于从上述植物获取，也可以使用所有含6-msitc的天然资源作为原料。

作为所述植物的提取精炼方法，可列举例如从作为十字花科植物的山嵛菜或西洋山嵛菜提取6-msitc的方法等。该提取方法的详细情形已由日本专利3919489号公报公开。

本公开的抗氧化剂中的所述(a)6-甲基亚磺酰基己基异硫氰酸酯与所述(b)白藜芦醇的配合比优选为，相对于1摩尔所述(a)6-甲基亚磺酰基己基异硫氰酸酯，所述(b)白藜芦醇为0.06摩尔以上且小于16摩尔，更优选为，相对于1摩尔所述(a)6-甲基亚磺酰基己基异硫氰酸酯，所述(b)白藜芦醇为0.06摩尔以上且为8摩尔以下。以如上的配合比一并使用(a)6-甲基亚磺酰基己基异硫氰酸酯与(b)白藜芦醇，由此，与单独使用(a)6-甲基亚磺酰基己基异硫氰酸酯或单独使用(b)白藜芦醇的情形相比，可以获得显示高抗氧化功效的抗氧化剂。并且，这样的高抗氧化功效超过将单独使用等量的(b)白藜芦醇的情形下获得的抗氧化功效与单独使用等量的(a)6-甲基亚磺酰基己基异硫氰酸酯的情形下获得的抗氧化功效单纯相加的程度。由此可以认为(a)6-甲基亚磺酰基己基异硫氰酸酯和(b)白藜芦醇相互协同地提高彼此的抗氧化功效。

本公开的抗氧化剂可以含在食品、化妆用品以及准药品中。

本公开的食品、化妆用品以及准药品含有本公开的抗氧化剂。因此，本公开的食品、化妆用品以及准药品所发挥的协同性抗氧化功效是在单独使用白藜芦醇的情形下无法获取的。

含有本公开的抗氧化剂的食品的形态为任意形态，没有限定。作为具体的食品形态可列举例如，一般食品、一般饮用品、营养补充品、健康食品、功能性标识食品、特定保健用食品等保健功能食品以及特殊用途食品、软性饮料、茶类饮料、能量饮料、葡萄酒等酒精饮料、糕点、米饭类、面包类、面条类、副食类、调料等。

含有本公开的抗氧化剂的化妆用品以及准药品的形态为任意形态，没有限定。作为具体的化妆用品以及准药品可列举例如，内服剂、外用剂、化妆水、乳液、面霜、软膏剂、敷面膏、皮肤清洁剂、洗发精、护发素、入浴剂等。

此外，含有本公开的抗氧化剂的化妆用品以及准药品的剂型没有限定。作为具体的化妆用品以及准药品的剂型可列举例如，胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、液体剂、乳剂、霜剂、凝胶剂、软膏剂、膜剂、摩丝(mousse)等。

本公开的抗氧化剂除作为主要成分的6-msitc和白藜芦醇，在无损本公开的效果的范围内，作为副成分，根据需要可以适当混合一般用于食品、化妆用品以及准药品的各种任意成分。

以下列举实施例以对本公开进行更详细说明，但本公开不限于这些实施例。

[实施例1：抑制活性氧产生的效果]

(1-1)细胞培养条件

在二氧化碳培养箱(5％co2、37℃)内，在试验培养基中将hl-60细胞(细胞编号：rcb3683；来源：日本理化学研究所生物资源中心)培养到直至对数生长期为止。该试验培养基使用rpmi-1640培养基(产品目录号：r8758、销售商：sigma-aldrichijapan株式会社)，含10％fbs(胎牛血清；产品目录号：171012；销售商：cellculturebioscience公司)，未添加抗生素。

(1-2)受验物质的配制

使6-甲基亚磺酰基己基异硫氰酸酯(6-msitc)(原液浓度5.235mol/l)溶解于乙醇以制得6-msitc浓度为100mmol/l的储备溶液。使白藜芦醇(产品目录号：r0071；销售商：东京化成工业株式会社)溶解于乙醇以制得白藜芦醇浓度为20mmol/l的储备溶液。使作为刺激诱导剂的佛波醇12-豆蔻酸酯13-乙酸酯(pma)(产品目录号：162-23591；销售商：和光株式会社)溶解于二甲基亚砜(dmso)(产品目录号：13445-74；销售商：nacalaitesque株式会社)，以制得pma浓度为400μmol/l的储备溶液。在后述试验中，对分化成嗜中性粒细胞的hl-60细胞施加pma刺激，由此产生活性氧。使作为分化诱导剂的视黄酸(产品目录号：r2625；销售商：sigma-aldrichijapan株式会社)溶解于乙醇，以制得视黄酸浓度为100mmol/l的储备溶液。为了使溶剂浓度同一化，均使用乙醇溶剂(1000倍液)对上述这些受验物质进行稀释，从而制得各稀释系列，然后将各稀释系列添加到试验培养基中而加以使用。

(1-3)细胞毒性试验

以6-msitc以及白藜芦醇为试样，评价6-msitc以及白藜芦醇对分化成嗜中性粒细胞的hl-60细胞是否具有毒性。

对悬浮有已分化成嗜中性粒细胞的hl-60细胞的悬浮液进行了离心分离。除去上清液从而获得hl-60细胞。使hl-60细胞以细胞数为1×10⁶个/ml的状态混悬在rpmi-1640培养基(无血清培养基)中。将90μl的该细胞悬浊液放入96孔板的各孔中。向各孔内的悬浊液中添加10μl的含有试样的培养基(由rpmi-1640培养基(无血清培养基)调制)，并进行搅拌从而获得培养液。将孔板放入二氧化碳培养箱(5％co2、37℃)内，对培养液中的hl-60细胞培养10分钟。之后，向培养液中添加100μl的含100nmol/lpma的20％fbs/pbs(dullbecco磷酸盐缓冲生理盐水；商品目录号：05913；销售商：日水制药株式会社)，并进行搅拌。将孔板放入二氧化碳培养箱(5％co2、37℃)内，对培养液中的hl-60细胞培养30分钟。之后，向各孔内的培养液中添加活细胞数量测量试剂sf(产品目录号：07553-44；销售商：nacalaitesque株式会社)并使活细胞数量测量试剂sf的最终浓度为10％。利用活细胞数量测量试剂sf(wst-8)测量孔内的培养液的吸光度，由此来评价细胞增殖性。所实施的试验次数为3次。

其结果为，当受验物质为6-msitc时，在6-msitc为20μmol/l时不显示细胞毒性。当受验物质为白藜芦醇时，在白藜芦醇为250μmol/l以下时不显示细胞毒性，而在白藜芦醇为1250μmol/l以上时显示细胞毒性。因此，在后述的(1-4)项的试验中使用了20μmol/l的6-msitc试验浓度，以及1.25μmol/l、20μmol/l、40μmol/l、80μmol/l、160μmol/l的白藜芦醇试验浓度。此外，对由白藜芦醇发挥的抑制活性氧产生效果的试验进行了预备试验，发现使活性氧的产生抑制率为约50％时的白藜芦醇浓度是320μmol/l。因此在后述的(1-4)项的试验中还使用该320μmol/l的白藜芦醇试验浓度。

(1-4)抑制活性氧产生的效果的试验

以单独的6-msitc、单独的白藜芦醇、以及、白藜芦醇与6-msitc的混合液作为试样，进行了对分化成嗜中性粒细胞的hl-60细胞产生活性氧的抑制效果试验。白藜芦醇与6-msitc的混合液是1.25μmol/l、20μmol/l、40μmol/l、80μmol/l、160μmol/l、320μmol/l的白藜芦醇分别与20μmol/l的6-msitc的混合液。

将hl-60细胞以1×10⁶个/ml的浓度而悬浮的悬浮液3ml接种到6孔孔板的各孔中。在接种的同时，向悬浮液中添加视黄酸和dmso，并使视黄酸最终浓度为1μmol/l、dmso最终浓度为1.25％，从而获得培养液。将孔板放入二氧化碳培养箱(5％co2、37℃)内，对培养液中的hl-60细胞培养9天，以使hl-60细胞分化成嗜中性粒细胞。

通过离心分离回收培养液，并除去培养上清液，从而获得hl-60细胞。使hl-60细胞以细胞数为1×10⁶个/ml的状态而混悬在rpmi-1640培养基(无血清培养基)中。向发光测量用96孔板的各孔中放入90μl的该细胞悬浊液，并且添加10μl的含试样的培养基(由rpmi-1640培养基(无血清培养基)调制)(试样试验区)。此外，作为试样对照，利用未向细胞悬浊液中添加含有该试样的培养基的情形(无添加对照区)。此外，作为溶剂对照，利用向试验培养基中添加乙醇，并使乙醇的最终浓度为0.2％的情形(媒介物(vehicle)对照区)。之后，搅拌各培养基，并将孔板放入二氧化碳培养箱(5％co2、37℃)内，对培养基内的hl-60细胞培养10分钟。培养后，向各培养基中添加100μl的含100nmol/lpma以及1mmol/l光泽精的20％fbs/pbs。添加后进行搅拌，并在二氧化碳培养箱(5％co2、37℃)内对孔板培养5分钟。之后，利用酶标仪测量各孔的发光，由此测量活性氧产生量。所实施的试验次数为5次。

由活性氧产生量计算出活性氧的产生抑制率的结果示于图1、图2、图3。各试样试验区中的活性氧产生抑制率(百分率)的计算是通过使从无添加对照区的活性氧产生量减去各试样试验区的活性氧产生量而得的值除以无添加对照区的活性氧产生量而进行计算的。与此相同，媒介物对照区的活性氧产生抑制率(百分率)的计算是通过使从无添加对照区的活性氧产生量减去媒介物对照区的活性氧产生量而得的值除以无添加对照区的活性氧产生量而进行计算的。

图1示出在试样单独处理区、即，在6-msitc单独处理区、以及在白藜芦醇单独处理区中活性氧产生抑制率。试样单独处理区将媒介物对照区作为对照组，进行了差异显著性检验。实施t检验(studentt-test)、将p<0.05(零假设小于5％)判断成具有显著性差异，并记载在图中。

其结果为，与媒介物对照区相比，在20μmol/l的6-msitc单独处理区中，显著抑制了活性氧的产生，从而确认到对分化成嗜中性粒细胞的hl-60细胞的抗氧化功效。此外，与媒介物对照区相比，在80μmol/l、160μmol/l、320μmol/l的白藜芦醇单独处理区中，分别确认到对分化成嗜中性粒细胞的hl-60细胞的显著抗氧化功效。

图2示出白藜芦醇与6-msitc的混合处理区(以下称为混合处理区)、6-msitc单独处理区中的活性氧产生抑制率。混合处理区将6-msitc单独处理区作为对照组，进行了与上述检验相同的差异显著性检验。

其结果为，与6-msitc单独处理区相比，在混合处理区中，确认到对分化成嗜中性粒细胞的hl-60细胞的显著抗氧化功效。

图3示出混合处理区、白藜芦醇单独处理区中的活性氧产生抑制率。混合处理区将白藜芦醇单独处理区作为对照组，进行了与上述检验相同的差异显著性检验。

其结果为，与白藜芦醇单独处理区相比，在混合处理区中，确认到对分化成嗜中性粒细胞的hl-60细胞的显著抗氧化功效。

由以上结果可知，与以白藜芦醇或6-msitc分别进行单独处理的情形相比，通过白藜芦醇与6-msitc的混合处理，显著促进了对活性氧产生的抑制，由此可以认为协同地抑制了活性氧的产生。但是也可以认为通过混合处理而显示了叠加效应而并非协同效应。因此，以下对白藜芦醇单独处理区中的活性氧产生抑制率(δ1)与混合处理区中白藜芦醇的活性氧产生抑制率(δ2)进行比较。

具体而言，δ1是通过从白藜芦醇单独处理区中的活性氧产生抑制率减去媒介物对照区中的活性氧产生抑制率而计算出的值。δ2是通过以下方式算出的，即，先计算从混合处理区中的活性氧产生抑制率减去媒介物对照区中的活性氧产生抑制率而得的值，然后从该值中减去从6-msitc单独处理区的活性氧产生抑制率减去媒介物对照区中的活性氧产生抑制率而得的值而计算出的。

当δ2/δ1的值超过“1”时，定义为具有协同效应。即定义为，当δ2/δ1的值超过“1”时，并非为单独处理的叠加效应，而是通过两物质的协同效应使彼此的功能比两物质各自单独的功能更高。其结果示于图4。

其结果为，通过20μmol/l的6-msitc分别与1.25μmol/l、20μmol/l、40μmol/l、80μmol/l、160μmol/l的白藜芦醇的混合处理，而发挥了协同的抗氧化功效。特别是，1.25μmol/l的白藜芦醇与20μmol/l的6-msitc的混合处理最能发挥协同效应。

由此可知，当6-msitc与白藜芦醇的配合比为相对于1摩尔6-msitc(20μmol/l)使白藜芦醇为0.06摩尔(1.25μmol/l)以上时，可发挥协同的抗氧化功效，而该功效是在单独使用白藜芦醇的情形下无法获取的功效。此外可知，当6-msitc与白藜芦醇的配合比为相对于1摩尔6-msitc(20μmol/l)使白藜芦醇小于16摩尔(320μmol/l)时，可发挥协同的抗氧化功效，而该功效是在单独使用白藜芦醇的情形下无法获取的功效。

[实施例2：营养补充剂的制造]

将100kg的山嵛菜根茎磨碎后在37℃进行1.5小时酶促反应，以生成6-msitc。加入300kg的50％乙醇并搅拌1.5小时，进行圧搾而获得300kg提取物。对获得的提取物进行加热浓缩从而使醇挥发，并加入2.0kg糊精并进行喷雾干燥。获得的粉末含1.0％的6-msitc。

将100mg该粉末与100mg白藜芦醇粉末(白藜芦醇含量5％)混合并填充在硬胶囊(3号)中，从而制造出营养补充剂。该营养补充剂中的6-msitc以及白藜芦醇的含量分别为1.0mg以及5.0mg。

因此，通过配合少量6-msitc，即使高价的白藜芦醇的配合量减少到一半的程度，仍能够制造体感效应相同的营养补充剂。

[变形例]

上述实施例2中示出了营养补充剂中的6-msitc以及白藜芦醇的含量分别为1.0mg以及5.0mg的示例，不过不限于此。营养补充剂中的6-msitc以及白藜芦醇的配合比也可以为，相对于1摩尔6-msitc，白藜芦醇为0.06摩尔且小于16摩尔，尤其优选相对于1摩尔6-msitc，白藜芦醇为0.06摩尔以上且为8摩尔以下。

上述实施例2中示出了营养补充剂的剂型为硬胶囊的示例，不过不限于此，也可以为例如，软胶囊、片剂(压片品)等。

上述实施例2中示出了以山嵛菜的根茎作为原料而制造6-msitc的示例，不过也可以以山嵛菜的叶作为原料，还可以一并使用山嵛菜的根茎和山嵛菜的叶。此外，上述实施例中使用了山嵛菜，不过不限于此，例如也可以以西洋山嵛菜(西洋山葵)的根茎、叶等作为原料，还可以一并使用山嵛菜和西洋山嵛菜。

以上、对本公开的实施例进行了说明。不过，本公开不限于如上所述的实施例，在不脱离本公开主旨的范围内能够以各种方式进行实施。此外，对不同的实施例进行适当组合而获得的构成也均包含在本公开的范畴内。