一种益生菌冻干制剂及其生产方法和应用与流程

本发明属于水产制剂技术领域，特别涉及一种改善水质保持水产动物健康的益生菌冻干制剂以及其生产方法和应用。

背景技术：

随着现代集约化、高效率水产养殖业的快速发展，水产养殖业的生产速度越来越快，抗生素使用量也越来越多，致使水质污染，水产品的品质下降，而随着生活水平的提高，人们却越来越追求消费高品质更安全的水产品。减少水产养殖业抗生素使用量以及水污染等当前存在的问题，益生菌制剂是促进水产养殖业健康绿色发展的大势所趋，但是传统的益生菌水剂以及喷雾干燥的粉剂都存在保存效期短，益生菌含量少等的缺点，所以开发一种能长效保存，益生菌含量高的益生菌制剂尤为重要。

技术实现要素：

解决的技术问题：本发明克服现有技术中保质期以及益生菌含量低等存在的不足，而提供一种益生菌冻干制剂及其生产方法和应用。

技术方案：一种益生菌冻干制剂的生产方法，步骤为：分别利用发酵罐对枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)和粪肠球菌(enterococcusfaecalis)分别进行液体发酵培养至稳定期，所获得的发酵培养液混合均匀后，冷冻干燥制得益生菌冻干制剂。

优选的，上述枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和粪肠球菌经液体发酵后的od600值分别为2.48、2.06和2.35。

优选的，上述枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和粪肠球菌的发酵培养液按体积比1:1:2混合。

优选的，上述液体发酵培养方法为：按液体培养基基质重量1％-2％接种种子液；枯草芽孢杆菌用液体发酵用培养基组成为：按每升含牛肉膏3g、葡萄糖10g、蛋白胨10g、氯化钠5g配制；凝结芽孢杆菌用液体发酵用培养基组成为：按每升含牛肉膏6g、蛋白胨20g、氯化钠4g、葡糖糖16g、酵母粉6g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁1g、硫酸锰0.25g、碳酸钙1g配制；粪肠球菌用液体发酵用培养基组成为：按每升含牛肉膏10g、蛋白胨10g、葡糖糖20g、酵母膏5g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.5g、乙酸钠5g、柠檬酸氢二铵2g配制。

优选的，上述冷冻干燥的冻干曲线流程为预冻待物料温度达到-45℃开始计时3h预冻结束，开始主冻干过程:每5h提升5℃，共4次，然后，每3h提升5℃，共2次，最后，每1.5h提升5℃，共1次。

优选的，上述方法制备得到的益生菌冻干制剂，其特征在于枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)大于10¹⁰cfu/g、凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)大于10⁸cfu/g、粪肠球菌(enterococcusfaecalis)大于10¹⁰cfu/g。

上述益生菌冻干制剂在水产健康养殖生产中的应用。

上述益生菌冻干制剂在南美白对虾养殖生产中的应用。

应用的具体方法为，用纯净水或池塘水将冻干品稀释后泼洒使用，使用量为：前期疾病预防每瓶用6亩/米*水，以后每15天泼洒一次；早期发病时使用每瓶用4-5亩/米*水。

有益效果：①本发明的改善水产品品质的益生菌冻干制剂，益生菌及其代谢产物活性高，改善水质，促进水产动物健康，提高了生产效率。②本发明益生菌冻干制剂将混合益生菌发酵液低温冻干，避免了益生菌保存效期短及菌含量不足的问题。③本发明益生菌冻干制剂有效地改善水质，包括分解水中蛋白质，稳定水体的ph值，清除水体中的有害毒素。④本发明益生菌冻干制剂保持水产动物健康提高水产品品质，有助于钙、铁、维生素的吸收，抑制肠道不耐酸的厌氧病原菌生长和繁殖，并加强对动物的免疫力和抗病能力减少抗生素的使用量。

附图说明

图1为水产养殖场河蟹育苗阶段使用冻干制剂对养殖水体ph值影响试验图；

图2为水产养殖场河蟹育苗阶段使用冻干制剂对养殖水体溶氧量影响试验图；

图3为水产养殖场河蟹育苗阶段使用冻干制剂对养殖水体氨氮浓度的影响试验图。

具体实施方式

以下实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

实施例1

一种改善水质保持水产动物健康的益生菌冻干制剂的生产方法，制备步骤为：分别利用发酵罐对枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)和粪肠球菌(enterococcusfaecalis)分别进行液体发酵培养，按液体培养基基质重量1％-2％接种种子液；枯草芽孢杆菌用液体发酵用培养基组成为：按每升含牛肉膏3g、葡萄糖10g、蛋白胨10g、氯化钠5g配制；凝结芽孢杆菌用液体发酵用培养基组成为：按每升含牛肉膏6g、蛋白胨20g、氯化钠4g、葡糖糖16g、酵母粉6g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁1g、硫酸锰0.25g、碳酸钙1g配制；粪肠球菌用液体发酵用培养基组成为：按每升含牛肉膏10g、蛋白胨10g、葡糖糖20g、酵母膏5g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.5g、乙酸钠5g、柠檬酸氢二铵2g配制。

培养条件和时间：枯草芽孢杆菌37℃，140转/min培养24h，凝结芽孢杆菌35℃，145转/min培养24h，粪肠球菌37℃，115转/min培养36h。

所得各益生菌的发酵培养液按1:1:2的体积比例混匀得混合菌液；在低温冷冻干燥机中按照设定冻干曲线，预冻待物料温度达到-45℃开始计时3h预冻结束，开始主冻干过程:每5h提升5℃(4次)，然后，每3h提升5℃(2次)，最后，每1.5h提升5℃(1次)进行冻干制剂制作，真空冷冻干燥法预先将复配菌液里面的水分冻结，然后在真空无菌的环境下将复配菌液里面被冻结的水分升华，从而得到冷冻干燥的冻干制剂。

本实施例的特点在低温环境下真空干燥配菌液里面的水份，保留其原有的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)和粪肠球菌(enterococcusfaecalis)的微生物活性和其代谢产物如蛋白酶、淀粉酶活性。而目前益生菌添加剂行业中广泛采用的方法是喷雾干燥制成的粉剂以及水剂，使其活性成分大大下降。该方法有效地防止了益生菌理化及生物特性的改变，对菌体细胞结构和特征的损伤较小，使其快速进入休眠状态，有效保护了益生菌以及其发酵代谢产物有效成份的稳定性。如蛋白质、微生物类不会发生变性和丢失其生物活性；冻干制品在干燥后形态疏松、颜色基本不发生改变，加水后能够快速溶解并恢复原有水溶液的理化特性和生物活性。由于干燥在真空条件下进行，对于一些易氧化的物质具有很好的保护作用。制品经过冻干后水份含量非常低，使制品的稳定性提高，受污染的机会减小，这不仅方便了运输还延长了制品保存期限。

不同益生菌制剂的水分、活菌数以及蛋白酶活性

-----表示未检测到

从上表中可以看出，与普通的益生菌水剂产品相比，益生菌冻干制剂含有较低的水分含量，高数量级菌落的枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、粪肠球菌和蛋白酶活性。

国内目前益生菌制剂一般是多种菌的液体水剂或者是单一菌种的菌粉，本发明配方无论是益生菌含量还是蛋白酶产量都较前两种产品高，并且该复合菌制剂的冻干制剂对于改善水质，提高水产品成活率以及产品质量都有积极重要的作用，而且由于冻干制剂较其他两种水分含量更低，制品的稳定性提高，不仅方便了运输还延长了制品保存期限。虽然现在市面上有很多液体和颗粒的益生菌制剂，但是低温冷冻干燥制作的益生菌制剂没有，而且在菌种使用方面，本专利的冻干益生菌制剂包含了高数量级菌落的枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、粪肠球菌。其中，枯草芽孢杆菌能分解养殖池中的有毒有害物质，净化水质；分解池中残饵、粪便、有机物等,具有很强的清理水中垃圾小颗粒的作用；枯草芽孢杆菌具有较强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性，使水产类动物对饲料的吸收利用更加充分；枯草芽孢杆菌还能够刺激水产动物免疫器官的发育，增强机体免疫力；减少对虾病害发生，明显提高对虾产量，从而提高经济效益，而且无污染，无残留。

凝结芽孢杆菌可以产生大量乳酸等有机酸，稳定水体ph值，调节肠道内微生物菌群的平衡，提高机体的免疫力和抗病力，减少肠道疾病的发生。凝结芽孢杆菌在肠道繁殖的过程中还会分泌淀粉酶和蛋白酶，促进机体对营养物质的消化和吸收；其产生的b族维生素、氨基酸、短链脂肪酸等物质能增加小肠的蠕动速度，从而改善肠道的消化功能。另外，凝结芽孢杆菌在肠道内定居后还能产生大量抑制有害菌的凝固素和l(+)乳酸等抑菌物质，因此，对胃肠道炎症有一定的治疗作用。

粪肠球菌能增强巨嗜细胞的活性，促进动物的免疫反应，提高抗体水平。粪肠球菌在动物肠道内可形成生物薄膜附着于动物肠道粘膜上，并且发育、生长和繁殖，可形成乳酸菌屏障，抵御外来病菌病毒及霉菌毒素等的副影响，而芽孢杆菌等都是过路菌，没有这个功能。粪肠球菌能把部分蛋白质分解成酰胺和氨基酸，把大部分的碳水化合物的无氮浸出物转化为l型乳酸，可以对钙质合成l-乳酸钙，促进养殖动物对钙质的吸收。粪肠球菌粪肠球菌能够产生多种抗菌物质，这些抗菌物质对动物体内常见的致病菌具有良好的抑制作用。

使用以上混合菌种来配合生产冻干粉制剂，对水产动物产生有益作用比单一菌种或者其他菌种更好；在实际生产中，由于考虑到产出混合菌液的气味以及发挥协同作用等，如芽孢杆菌等都是过路菌，不能定值肠道，而粪肠球菌具有这个功能，最终选择了枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和粪肠球菌以1:1:2的体积比例混合，这个混合比例，以便各种菌种都能发挥出良好的作用。本专利的冻干粉的益生菌制剂可能会对以后益生菌制剂发展具有积极的引导作用。

室温储存条件下不同益生菌产品所含活菌数(cfu/g)随时间变化

从上表中可以看出，与普通的益生菌液体产品以及喷雾粉剂产品相比，益生菌冻干制剂在常温条件下具有更长的保存效期。常温下360天时，在菌含量上，只降低一个数量级，显著高于液体产品和喷雾粉剂产品。

实施例2

水产养殖场河蟹育苗阶段使用冻干制剂对养殖水体ph值、溶氧量和氨氮的影响试验：选用15立方米的水泥育苗池试验池和对照池各两组，水温19-25℃。试验组按每瓶可用6亩/米*水的添加量对试验池泼洒，泼洒后每天测水温，对照组正常饲喂，除未添加益生菌制剂外其他情况保持一致，每星期一取样水测试1次，上午投料前采样，采集前将水桶中的养殖水充分混合均匀，在离水面15cm处取水样，每次采集点相同，取水时间为上午10时。测定一次ph和透明度，水样的采集和测定参考《水和废水检测分析方法》(第四版)。从使用冻干制剂至最后一次测试为35天。氨氮浓度测定，采集水样100ml，于5000rpm，离心5min，取上清液。测试使用的为水质测试盒，准确率90％以上。测试结果如图1～图3所示。

结果分析

使用冻干制剂后，ph值降低，之后基本稳定，透明度有所改善。35天内溶解氧平均增加35.9％，最佳时段在使用冻干制剂后的两星期，试验池溶解氧比对照池增加43.7％，这与许多用户反映15天时水质最佳的情况相一致。氨氮比对照组下降57％，降幅最大值在后期，35天时试验池仅为对照池的二分之一。

使用冻干制剂，可显著改善水体环境即提溶解氧，抑制病害，降低氨氮、减少换水次数。一次泼洒有效期可达30-40天。这对缺乏水资源，排灌不便的养殖塘具有重要意义。

实施例3

冻干制剂对南美白对虾生长和免疫指标的影响试验：

(1)试验方法：将大小、体重均匀的南美白对虾饥饿处理1d后分别等量随机放养到编号为对照组、抗生素组和冻干制剂试验组，每组3个重复，每个重复200尾虾，对照组用基础日粮，抗生素组作为阳性对照，用黄霉素添加到饵料中100mg/kg(有效含量4％)，冻干粉制剂组按使用说明使用，正常投喂饵料，饲养30d，每3d换水1次，以水浑浊程度适当调整换水频率，每次换水量为20％～30％，每池换水量基本一致。池水为已曝气的自来水，添加适量的海盐。试验期间每天按虾体质量的5％～6％投喂，投料2次，分别在9：30和17：30投喂饲料，投放量为虾体重的10％～15％，根据摄食量适当调节。

(2)采样方法以及测定指标：养殖试验结束前，在各重复组虾中随机取30只，称重计算生长指标；存活率则从养殖开始到结束期间计算；将虾饥饿24h，从每池中随机取6尾对虾，对虾心脏取血,按1：2的比例和对虾抗凝剂充分混合，利用血球计数板进行血细胞计数。另取30尾虾心脏采血后，混合置于无菌离心管中4℃静置过夜后，3000r/min离心10min，取上层血清置于-80℃超低温冰箱保存，进行酚氧化酶活力和碱性磷酸酶活力的测定。从每个池中随机取10尾虾,无菌操作将虾解剖，去除肠道粪便，置于灭菌的玻璃匀浆器中，加入10ml无菌生理盐水匀浆。再依次以10倍系列稀释，选择合适的稀释度测弧菌及细菌总数。

(3)试验结果：

生长指标如表1：

表1益生菌冻干粉制剂对南美白对虾的生长指标的影响

免疫指标如表2：

表2益生菌冻干粉制剂对南美白对虾免疫机能的影响

肠道菌群指标如表3：

表3益生菌冻干粉制剂对南美白对虾肠道细菌总数和弧菌总数的影响lgcfu/g

(4)结果分析：在生长指标上，与对照组相比，使用抗生素和益生菌冻干制剂后，均显著提高了南美白对虾增重率，降低了饵料系数，提高了南美白对虾的成活率。对虾的免疫系统不完善，主要由非特异性免疫力构成。血细胞数、酚氧化酶活力和碱性磷酸酶活力均是衡量虾非特异性免疫力的重要指标。在免疫指标上可以看出，与对照组相比，抗生素和益生菌冻干粉制剂碱性磷酸酶的活性均显著提高，这对于南美白对虾机体代谢以及免疫机能具有重要意义。酚氧化酶(phenoloxidase，po)又称酪氨酸酶，参与无脊椎动物的防御反应。在酚氧化酶活性上，益生菌冻干粉制剂组显著高于对照组，但与抗生素组无显著差异，这说明益生菌冻干制剂能显著提高南美白对虾的免疫机能。在肠道总细菌数量上，可以看出抗生素组低于对照组和益生菌冻干粉制剂组显示出抗生素，弧菌作为水体中的的病原菌，抗生素组和益生菌冻干粉制剂组的弧菌总数显著低于对照组显，这显示出益生菌冻干粉制剂和抗生素对弧菌的抑制作用。

综合以上南美白对虾生长指标、免疫机能指标、肠道总细菌数和弧菌总数等指标可以看出，益生菌冻干粉制剂可以减少甚至替代抗生素在南美白对虾养殖中的应用。

以上为对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细的描述，通过对本发明实施例的上述说明，仅适用于帮助本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对本领域的专业技术人员，依据本发明实施例，在本文所公开的原理和新颖特点相一致的情况下，对这些实施例均会有多种修改，并在其它实施例中实现。综上所述，本发明实施内容不应理解为对本发明的限制。