本发明属于兽用生物制品
技术领域：
，具体涉及一种佐剂组合物及其制备方法和应用。
背景技术：
：佐剂是用于产生抗原性增加的疫苗或用于通过增加对抗原的非特异性免疫反应从而达到治疗和预防的材料。在抗原水平低时，佐剂用来在较长时间内维持针对抗原的强烈且快速的免疫反应，这些佐剂可以用于疫苗的制备。佐剂能够使用特殊抗原或者能够改变抗原的水平，从而调节针对抗原的免疫反应或者控制针对抗原的抗体类型和亚类。另外，佐剂还可以用以增强免疫反应，特别是对免疫不成熟或衰老的人，提高粘膜免疫性的诱导。大部分佐剂是通过反复实验在天然材料中发现的。在1925年世界范围内对佐剂的第一次报道中，ramon(法国)报道，食品中使用的木薯淀粉(casaba)与白喉和破伤风类毒素混合，将有效地增加抗原特异性抗体的产生。接着发现了铝佐剂的免疫增强作用，并开发了作为免疫调节剂的包含失活的灭活分枝杆菌的有效乳液型佐剂。聚丙烯酸作为佐剂在兽用疫苗中使用时，聚丙烯酸本身在生理环境下带负电荷，难以吸附带负电荷的抗原。另外聚丙烯酸在氯化钠溶液中发生沉淀，也影响了其作为佐剂的使用。现有技术普遍采用的技术方案是：在聚丙烯酸中添加其他佐剂和免疫增强剂形成复合佐剂使用。现有技术缺少既能增强聚丙烯酸的佐剂免疫效果和适用抗原范围，又能提高聚丙烯酸溶液的稳定性，制备简单且不产生副作用的佐剂组合物。ε-聚赖氨酸，由人体必需氨基酸l-赖氨酸的ε-氨基与另一l-赖氨酸的α-羧基形成ε-酰胺键连接而成的。现有技术没有其有佐剂作用的报道。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种佐剂组合物，该佐剂组合物具有很高的安全性和有效性，由其和抗原形成的疫苗组合物具有很好的稳定性以供长期贮存，且可安全有效地施用于很多种受试者中。为此，本发明第一方面提供了一种佐剂组合物，其包含丙烯酸系聚合物-ε-聚赖氨酸纳米颗粒。在本发明的一些实施方式中，100重量份的佐剂组合物中，包含0.001-5重量(干重)份的丙烯酸系聚合物-ε-聚赖氨酸纳米颗粒。优选地，100重量份的佐剂组合物中，包含0.01-3重量(干重)份的丙烯酸系聚合物-ε-聚赖氨酸纳米颗粒。进一步优选地，100重量份的佐剂组合物中，包含0.45-1重量(干重)份的丙烯酸系聚合物-ε-聚赖氨酸纳米颗粒。更进一步优选地，100重量份的佐剂组合物中，包含0.55-1重量(干重)份的丙烯酸系聚合物-ε-聚赖氨酸纳米颗粒。最优选地，100重量份的佐剂组合物中，包含0.6-0.75重量(干重)份的丙烯酸系聚合物-ε-聚赖氨酸纳米颗粒。当100重量份的佐剂组合物中包含的丙烯酸系聚合物-ε-聚赖氨酸纳米颗粒小于0.001重量份时，该佐剂组合物将不具有产生抗体的能力；当包含的丙烯酸系聚合物-ε-聚赖氨酸纳米颗粒大于5重量份时，该佐剂组合物的粘度将大大增加。本发明中，佐剂组合物中丙烯酸系聚合物-ε-聚赖氨酸纳米颗粒的重量份数，均为佐剂组合物中丙烯酸系聚合物-ε-聚赖氨酸纳米颗粒的干重。所述佐剂组合物的纳米颗粒可以分散在水或含水的电解质溶液中。本发明中，所述丙烯酸系聚合物-ε-聚赖氨酸纳米颗粒由丙烯酸系聚合物羧基反应基团的负电荷与ε-聚赖氨酸氨基反应基团质子化的正电荷的之间的静电相互作用，形成离子键制备而成。在本发明的一些具体实施方式中，所述丙烯酸系聚合物与ε-聚赖氨酸的质量比为(1-10):1。在本发明的另一些具体实施方式中，所述丙烯酸系聚合物-ε-聚赖氨酸纳米颗粒的粒径为200nm-1500nm。在本发明的一些实施方式中，所述丙烯酸系聚合物选自聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚(丙烯酸-co-甲基丙烯酸)和聚(丙烯酸-co-丙烯酰胺)中的一种或多种。但是，本发明所述的丙烯酸系聚合物不限于此，还可以为聚甲基丙烯酸酯(优选为聚丙烯酸的烷基酯)、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚丙烯腈、聚(丙烯酰胺-共-甲基丙烯酸丁酯)，这些化合物均为阴离子化合物，化合物中的羧基只是部分被取代，羧基依然存在。丙烯酸系聚合物在水中可膨胀至多达其原始体积的1000倍及其原始直径的10倍，以在暴露于ph环境高于羧酸化物基团的pka时形成凝胶。在较羧酸化物基团的pka更高的ph下，该羧酸化物基团离子化，导致负电荷基团间的排斥，使聚合物的体积膨胀增加。在本发明的一些优选实施方式中，所述丙烯酸系聚合物为聚丙烯酸，其平均当量为76，由平均直径约0.2-6.0μm的初始聚合物颗粒制得。进一步优选地，所述聚丙烯酸为市售的卡波姆(商品名)，它在所属
技术领域：
中通常还指与聚烯丙基蔗糖交联的丙烯酸的水溶性聚合物。在本发明的一些具体实施例中，所述的聚丙烯酸为市售的卡波姆934p(商品名)。本发明中，所述ε-聚赖氨酸的相对分子质量为1000kda-15000kda。若ε-聚赖氨酸的相对分子质量小于1000kda，其免疫增强作用将较低；若ε-聚赖氨酸的相对分子质量大于15,000kda，由其形成的佐剂组合物的粘度将大大增加。本发明第二方面提供了一种如本发明第一方面所述佐剂组合物的制备方法，其包括：将丙烯酸系聚合物溶液与ε-聚赖氨酸溶液在搅拌条件下混合，获得佐剂组合物。在本发明的一些实施方式中，所述丙烯酸系聚合物溶液与ε-聚赖氨酸溶液的ph值均为6.9-7.5；优选地，所述丙烯酸系聚合物溶液与ε-聚赖氨酸溶液的ph值为7.2。溶液的ph值过低会造成析出的丙烯酸系聚合物-ε-聚赖氨酸纳米颗粒的粒径过大；ph值过高会造成析出的丙烯酸系聚合物-ε-聚赖氨酸纳米颗粒较少。本发明中，溶解丙烯酸系聚合物及ε-聚赖氨酸的溶液优选为nacl溶液；具体地，所述nacl溶液的浓度为0.85％。在本发明的另一些实施方式中，所述丙烯酸系聚合物溶液与ε-聚赖氨酸溶液的质量比为(1-10):1。本发明第三方面提供了一种疫苗组合物，其包括本发明第一方面所述的佐剂组合物或本发明第二方面所述方法制备的佐剂组合物和免疫有效量的抗原。用语“免疫有效量”又称免疫保护量或产生免疫应答的有效量，为可在接受者体内有效诱导免疫原性应答的量。所述免疫应答可能足以用于诊断目的或其它试验，或可能适合用于预防疾病的征兆或症状，包括由病原体引起的感染所造成的不利的健康结果或其并发症。体液免疫力或由细胞介导的免疫力或此二者均可被诱导。动物对免疫原性组合物的免疫应答可通过例如测量抗体效价、淋巴细胞增殖分析而间接评估，或在以野生型毒株攻击后通过监测征兆或症状来直接评估，而该由疫苗提供的保护性免疫力可通过测量例如受试者的临床征兆如死亡率、发病率的减少、温度数值、受试者总体生理状况及总体健康和表现来评估。所述免疫应答可包括但不限于诱导细胞性和/或体液免疫力。用语“抗原”又称免疫原，是指任何刺激免疫应答的物质，是一种能够被抗体结合的分子，还能够诱导产生b-和/或t-细胞的体液免疫应答和/或细胞免疫应答，还具有一个或多个表位(b-和t-表位)。所述抗原为个别的或其任何组合的病毒(灭活的病毒、减毒及经修饰的活病毒)、细菌、寄生虫、核苷酸、多核苷酸、肽、多肽、重组蛋白质、合成的肽、蛋白质提取物、细胞(包括肿瘤细胞)、组织、碳水化合物(例如，多糖)、脂肪酸、磷壁酸(teichiocacid)、肽聚糖、脂质和糖脂。可作为抗原使用的病毒包括但不限于：鸟疱疹病毒、牛疱疹病毒、犬疱疹病毒、马疱疹病毒、羊疱疹病毒、猪疱疹病毒、猫病毒性鼻气管炎病毒、马立克氏病病毒、伪狂犬病病毒、鸟副黏病毒、牛呼吸道合胞体病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒、犬细小病毒、牛副流感病毒3、羊副流感病毒3、牛疫病毒、边界病病毒、牛病毒性腹泻病毒(bvdv)、i型bvdv、ii型bvdv、古典猪瘟病毒(classicalswinefevervirus)、鸟白血病病毒、牛免疫缺陷病毒、牛白血病病毒、牛结核病病毒、猪感染性贫血病毒、猫免疫缺陷病毒、猫白血病病毒(felv)、新城疫病毒(newcastlediseasevirus)、羊进行性肺炎病毒、羊肺腺癌病毒、犬冠状病毒(ccv)、泛嗜性ccv(pantropicccv)、犬呼吸道冠状病毒、牛冠状病毒、猫杯状病毒、猫肠冠状病毒、猫感染性腹膜炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪凝血性脑骨髓炎病毒、猪细小病毒、i型猪环病毒(pcv)、ii型pcv、猪生殖及呼吸综合征(prrs)病毒、传染性胃肠炎病毒、火鸡冠状病毒、牛流行热病毒、狂犬病轮状病毒、水泡性口炎病毒、慢病毒、鸟流感病毒、鼻病毒、马流感病毒、猪流感病毒、犬流感病毒、猫流感病毒、人流感病毒、东方马脑炎病毒(eee)、委内瑞拉马脑炎病毒、西尼罗河病毒、西方马脑炎病毒、人免疫缺陷病毒、人乳头状瘤病毒、水痘带状疱疹病毒、乙型肝炎病毒、鼻病毒和麻疹病毒中的一种或多种。肽抗原包括支气管败血性薄德特氏菌p68、gnrh、ige肽、feld1和癌症抗原中的一种或多种。可作为抗原使用的寄生虫包括但不限于：无形体属、肝片吸虫、球虫、艾美球虫属、犬新孢子虫、刚地弓形虫、贾第虫、恶丝虫、钩口线虫、锥虫属、利什曼原虫属、毛滴虫属、小球隐孢子虫、巴贝西虫、血吸虫、绦虫、类圆线虫、蛔虫、毛线虫、肉孢子虫、哈蒙德虫和等孢子球虫中的一种多多种。可作为抗原使用的细菌包括但不限于：醋酸钙不动杆菌(aceinetobactercalcoaceticus)、巴斯鲁安那醋酸杆菌(acetobacterpaseruianus)、胸膜肺炎放线杆菌(actinobacilluspleuropneumoniae)、嗜水气单胞菌(aeromonashydrophila)、脂环酸杆菌(alicyclobacillusacidocaldarius)、闪烁古球菌(arhaeglobusfulgidus)、短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(bacillusstearothermophillus)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、热链形芽孢杆菌(bacillusthermocatenulatus)、支气管败血性博德特氏菌(bordetellabronchiseptica)、洋葱伯克霍尔德菌(burkholderiacepacia)、谷伯克霍尔德菌(burkholderiaglumae)、大肠弯曲菌(campylobactercoli)、胎儿弯曲菌(campylobacterfetus)、空肠弯曲菌(campylobacterjejuni)、猪肠弯曲杆菌(campylobacterhyointestinalis)、鹦鹉热衣原体(chlamydiapsittaci)、沙眼衣原体(chlamydiatrachomatis)、衣原体属(chlamydophilaspp.)、黏性染色菌(chromobacteriumviscosum)、猪红斑丹毒丝菌(erysipelothrixrhusiopathieae)、单核球增多性李斯特菌(listeriamonocytogenes)、犬埃立克体(ehrlichiacanis)、大肠杆菌(escherichiacoli)、流感嗜血杆菌(haemophilusinfluenzae)、睡眠嗜血菌(haemophilussomnus)、猪螺杆菌(helicobactersuis)、细胞内劳森菌(lawsoniaintracellularis)、嗜肺军团菌(legionellapneumophilia)、莫氏杆菌属(moraxellsasp.)、牛分枝杆菌(mycobactriumbovis)、猪肺炎支原体(mycoplasmahyopneumoniae)、丝状支原体亚种(mycoplasmamycoidessubsp.)、lc丝状菌(mycoideslc)、产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens)、犬牙周臭味菌(odoribacterdenticanis)、溶血巴氏杆菌(pasteurella(mannheimia)haemolytica)、多杀巴氏杆菌(pasteurellamultocida)、发光光杆菌(photorhabdusluminescens)、喉管卟啉单胞菌(porphyromonasgulae)、牙龈卟啉单胞菌(porphyromonasgingivalis)、唾液卟啉单胞菌(porphyromonassalivosa)、痤疮丙酸杆菌(propionibacteriumacnes)、普通变形杆菌(proteusvulgaris)、威斯康辛绿脓杆菌(pseudomonaswisconsinensis)、绿脓杆菌、荧光假单胞菌c9(pseudomonasfluorescensc9)、荧光假单胞菌sikw1(pseudomonasfluorescenssikw1)、莓实假单胞菌(pseudomonasfragi)、浅黄假单胞菌(pseudomonasluteola)、食油假单胞菌(pseudomonasoleovorans)、假单孢菌b11-1(pseudomonasspb11-1)、富养产碱菌(alcaligeseutrophus)、不动嗜冷单胞菌(psychrobacterimmobilis)、普氏立克次体(rickettsiaprowazekii)、立克次氏立克次体(rickettsiarickettsia)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)、邦哥利沙门氏菌(salmonellabongiri)、肠沙门氏菌(salmonellaenterica)、都柏林沙门氏菌(salmonelladublin)、鼠伤寒沙门氏菌、霍乱沙门氏菌(salmonellacholeraseuis)、纽波特沙门氏菌(salmonellanewport)、黏质沙雷氏菌(serratiamarcescens)、钝顶螺旋藻(spirlinaplatensis)、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、猪葡萄球菌(staphylococcushyicus)、白色链霉菌(streptomycesalbus)、肉桂链霉菌(streptomycescinnamoneus)、猪链球菌(streptococcussuis)、除角质链霉菌(streptomycesexfoliates)、疥疮链霉菌(streptomycesscabies)、嗜酸热硫化叶菌(sulfolobusacidocaldarius)、集胞藻属(syechocystissp.)、霍乱弧菌(vibriocholerae)、伯氏舒螺旋菌(borreliaburgdorferi)、齿密螺旋菌(treponemadenticola)、小密螺旋菌(treponemaminutum)、噬齿密螺旋菌(treponemaphagedenis)、屈曲密螺旋菌(treponemarefringens)、文氏密螺旋菌(treponemavincentii)、钯密螺旋体(treponemapalladium)、钩端螺旋体种(leptospiraspecies)，以及诸如已知的病原体犬钩端螺旋体(leptospiracanicola)、感冒伤寒型钩端螺旋体(leptospiragrippotyposa)、哈佐钩端螺旋体(leptospirahardjo)、博氏哈佐牛钩端螺旋体(leptospiraborgpeterseniihardjo-bovis)、博氏哈佐普拉伊特诺钩端螺旋体(leptospiraborgpeterseniihardjo-prajitno)、问号钩端螺旋体(leptospirainterrogans)、黄疸出血钩端螺旋体(leptospiraicterohaemorrhagiae)、波莫纳钩端螺旋体(leptospirapomona)和布拉迪斯拉发钩端螺旋体(leptospirabratislava)中的一种或多种。本发明所述的疫苗组合物的制备方法为：将含有有效免疫量的抗原溶液与佐剂组合物溶液混合，搅拌均匀即可获得疫苗组合物。用语“疫苗”是指包含上述所定义的抗原的组合物。将疫苗施用给受试者可产生大致上针对一种或多种特定疾病的免疫应答。治疗有效的疫苗量可根据所使用的具体抗原及受试者的状况而不同，且可由本领域技术人员决定。用于商业用途的疫苗佐剂制剂的要求之一是建立佐剂溶液的稳定性以供长期贮存。本文中提供了容易制造且可保持稳定至少18个月的佐剂组合物，并且含有该佐剂组合物的疫苗组合物的也可保持稳定至少18个月。在一个实施方案中，该疫苗组合物可保持稳定约18个月。在另一个实施方案中，该配疫苗组合物可保持稳定约18至约24个月。在另一个实施方案中，该疫苗组合物可保持稳定约24个月。加速测试程序亦指出本文所述的疫苗组合物是稳定的。由本发明所述佐剂组合物配制的疫苗组合物可安全且有效地施用于多种受试者。本领域中预期佐剂的组合将显示出较单独组分更强的反应原性。然而，当与任何一种或二种组分的组合物相比较时，本文所述的佐剂组合物显示出降低的反应原性，同时仍保持佐剂的效果。还令人惊讶地发现，当与其它佐剂组合物相比较时，本文所述佐剂组合物的安全性还得到改善。由本发明所述佐剂组合物配制的疫苗组合物可用于在受试者内产生所需的免疫应答，其在多种物种中均有效。任何需要施用疫苗组合物的动物均为合适的受试者。其包括哺乳动物及非哺乳动物，包括灵长类、家畜、伴侣动物、实验室试验动物、圈养野生动物、鸟类(包括卵)、爬行动物及鱼。具体地，受试者包括但不限于：猴子、人、猪、牛、绵羊、山羊、马、小鼠、大鼠、荷兰猪、仓鼠、兔子、猫、犬、鸡、火鸡、鸭、其它禽类、青蛙和蜥蜴。本发明第四方面提供了一种如本发明第三方面所述疫苗组合物在制备预防和/或治疗性药物中的应用。本发明的有益效果为：本发明所述佐剂组合物中所包含的丙烯酸系聚合物-ε-聚赖氨酸纳米颗粒是由简单的静电作用制备而成，不具有对机体有害的蛋白质之间的交联，因此具有很高的安全性和有效性，适合作为佐剂使用，同时克服了聚丙烯酸作为佐剂使用存在的问题。另外，由本发明所述佐剂组合物和抗原形成的疫苗组合物具有很好的稳定性以供长期贮存，且可安全有效地施用于很多种受试者中。具体实施方式为使本发明更加容易理解，将参考下列实施例进一步详细描述本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。实施例实施例1：含聚丙烯酸-ε-聚赖氨酸纳米颗粒的佐剂组合物的制备将聚丙烯酸(市售的卡波姆934p)和聚赖氨酸溶解在0.85％的nacl溶液中，并调节其调ph均为7.2，获得聚丙烯酸溶液和聚赖氨酸溶液。在搅拌条件下将聚丙烯酸溶液和聚赖氨酸溶液相混合，获得含表面带负电荷的聚丙烯酸-ε-聚赖氨酸纳米颗粒的佐剂组合物。使用dls(动态光散射)测量所形成的纳米颗粒的粒径，显示所形成的纳米颗粒的粒径为200-1500nm。佐剂组合物的配制见表1。表1：佐剂组合物的配制表组别卡波姆934p聚赖氨酸氯化钠免疫增强剂水1(佐剂1)0.5g0.5g0.85g—加至100ml2(佐剂2)0.5g0.25g0.85g—加至100ml3(佐剂3)0.5g0.05g0.85g—加至100ml4(佐剂4)0.5g0.25g0.85gquila0.01g加至100ml5(佐剂5)0.3g0.3g0.85g—加至100ml6(佐剂6)0.3g0.15g0.85g—加至100ml对比佐剂0.5g—0.85g—加至100ml实施例2：本发明的佐剂组合物对猪圆环病毒产生中和抗体的促进作用2.1疫苗组合物的制备在50g实施例1制备的佐剂组合物中，加入pcv2orf2蛋白20微克/头份，用ph＝7.4的磷酸盐缓冲定容，获得疫苗组合物。将获得的疫苗组合物放置4℃下观察其稳定性，结果见表2。表2：疫苗组合物的配制和稳定性从表2可知，利用本发明所述的佐剂组合物制备的疫苗组合物具有很高的稳定性，4℃下可保持稳定至少18个月。2.2中和抗体效价实验将30头30日龄左右的pcv2阴性健康仔猪，随机分为6组，每组5头。将上述5种疫苗组合物分别注射第1-5组的仔猪，1ml/头；第6组注射等量的生理盐水作为空白对照组。免疫后4周测定仔猪中和抗体效价，测定结果见表3。中和抗体的检测法如下：不同稀释度血清与pcv2病毒混合，37℃水浴作用1h，取出后加入已长满细胞单层的pk-15细胞，每孔100μl，每个血清稀释度接种4孔，同时设定只接种病毒pcv2的阳性对照孔、正常细胞阴性对照孔和阴性血清对照孔。pcv2病毒终浓度为1000tcid50/ml。24h后用300mmol/l的d-氨基葡萄糖处理，然后再培养48h，进行间接免疫荧光试验。以减少70％或更多荧光血清的最高稀释度的倒数为中和抗体效价。表3：各试验组仔猪的中和抗体效价组别abcd对比疫苗对照中和抗体效价1:2521:2631:2861:2161:75阴性从表3可知，本发明的佐剂组合物对抗体的促进作用优于仅用卡波姆934p的对比佐剂，中和抗体效价提高了3-4倍。3.3仔猪攻毒保护试验将30头35日龄左右的pcv2阴性健康仔猪，随机分为6组，每组5头。将2.1制备的疫苗组合物分别注射第1-5组仔猪，1ml/头；第6组注射等量的生理盐水作为对照组。免疫后35d，各试验组和对照组仔猪均用pcv2sh株(含106.0tcid50/ml)滴鼻1ml/头、肌肉注射2ml/头，攻毒后第4日及第7日分别在每头攻毒猪的两侧腋下及两侧臀部共4个点，对所有猪接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白(klh/icfa，0.5mg/ml)，每个点接种1ml(4ml/头)，同时腹腔接种巯基乙酸培养基，10ml/头；攻毒后第11日及第19日再次腹腔接种巯基乙酸培养基，10ml/头。攻毒后连续观察25日，于攻毒后第25日称重后扑杀，剖检。根据体温、相对日增重和病毒抗原检测结果进行判定，体温变化情况见表4。表4：pcv2攻毒后各组仔猪的体温超过40.5℃的天数从表4可知，疫苗组合物a、疫苗组合物b、疫苗组合物c和疫苗组合物d免疫组的仔猪几乎没有出现体温升高现象，而对比疫苗组有2头猪呈现一次体温升高现象，体温升高一天后很快恢复正常，无其它临床症状；对照组仔猪攻毒后所有仔猪体温升高至40.5℃以上，持续3-5天，食欲减退、精神沉郁、被毛粗乱、消瘦和生长速度减缓。攻毒后各组猪仔发病及保护情况如表5和表6所示。从表5可知，疫苗组合物a、b、c、d免疫仔猪攻毒后未出现明显临床症状，未观察到特异性病理变化，抗原pcr检测均为阴性，保护效果达5/5。对比疫苗免疫仔猪攻毒后，均有1头猪发病，保护效果达4/5。而对照组仔猪全部发病，临床症状，病理变化明显，病原pcr检测均为阳性。从表6可知，至攻毒观察结束，疫苗组合物a、b、c、d和对比疫苗免疫仔猪平均日增重无显著差异，与对照组相比，各疫苗组仔猪平均日增重均极显著高于对照组。表5：pcv攻毒后各组仔猪发病判定结果pcv攻毒后符合以下3项中的任何2项，即可判为发病。a.临床症状：仔猪体温升高(≥40℃)，应至少持续3日，出现明显食欲减退、精神沉郁、被毛粗乱、消瘦和生长速度减缓。b.病理变化：腹股沟和气管淋巴结水肿、肺脏轻度水肿，肾脏发黄或有点状坏死。组织学病变为淋巴结有明显淋巴细胞侵入，或有多核巨细胞。c.病毒检测：用pcr检测淋巴结组织，检测到pcv2。表6免疫仔猪pcv攻毒后保护情况实施例3：本发明所述佐剂组合物对猪肺炎支原体的保护试验3.1疫苗组合物的制备在50g实施例1制备的佐剂组合物中，加入猪肺炎灭活前2×108/头份支原体抗原50g，获得疫苗组合物。将获得的疫苗组合物放置4℃下观察其稳定性，结果见表7。表7：疫苗组合物的配制和稳定性3.2试验用疫苗免疫仔猪选14-21日龄仔猪30头，随机分成6组，5头/组。将3.1制备的疫苗组合物i、ii、iii、iv和对比疫苗分别注射第1-5组仔猪，每头仔猪分别颈部肌肉注射相应的灭活疫苗1ml；第6组注射等量的生理盐水作为对照组。3.3仔猪免疫后攻毒猪肺炎支原体攻毒：在首次免疫70d后，采用猪肺炎支原体进行攻毒试验，各免疫组和对照组仔猪用cvcc354株(购自中国兽医药品监察所)气管注射5ml/头(100mid)，攻毒后观察30天，剖杀试验仔猪。根据猪支原体肺炎肺病变指数记分标准，对试验仔猪的肺病变进行记分，并对各免疫组与对照组进行肺病变指数差异分析，结果如表8所示。表8：猪肺炎支原体攻毒后各试验组仔猪的肺损伤得分情况组别仔猪头数平均肺病变指数疫苗组合物i53.61±0.52bd疫苗组合物ii53.10±0.33bd疫苗组合物iii53.12±0.31bd疫苗组合物iv53.06±0.51bd对比疫苗56.30±0.53bb对照组515.90±0.63aa注:差异性统计分析中，组间比较，字母相同者表示差异不显著，大写字母不同者表示差异极显著(p＜0.01)，小写字母不同表示差异显著(p＜0.05)。从表8可知，各免疫组预防猪肺炎支原体引起的肺病变均有明显的效果，说明本发明的佐剂组合物联用有明显的协同作用。本领域技术人员的认知，猪肺炎支原体免疫需要细胞免疫和体液免疫共同作用才能达到理想效果，试验结果表明本发明的佐剂组合物能促进体液免疫和细胞免疫双重作用。实施例4：伪狂犬疫苗组合物的配制和中和抗体效价检测4.1疫苗组合物的配制在ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中加入用杆状病毒表达的猪伪狂犬gb和gd抗原的混合物(gb和gd等摩尔比)200微克/头份作为抗原相。将50g抗原相与实施例1制备的50g佐剂组合物混合，获得疫苗组合物。表9：疫苗组合物的配制和稳定性组别佐剂4℃稳定性疫苗组合物a佐剂118个月稳定疫苗组合物b佐剂318个月稳定疫苗组合物c佐剂418个月稳定疫苗组合物d佐剂618个月稳定对比疫苗对比佐剂2月后出现分层，上层澄清2.2中和抗体效价实验将21日龄prv抗体阴性仔猪30头随机分成6组，5头/组。将4.1制备的疫苗组合物a、b、c、d和对比疫苗分别注射第1-5组仔猪，2ml/头；第6组注射等量的生理盐水作为对照组。免疫后，每周参照gb/t18641-2002血清中和试验方法测定各组猪仔的中和抗体效价，结果见表10。表10：免疫后仔猪在不同时间的抗体效价情况上述试验结果表明，本发明的佐剂组合物，不仅能更早产生抗体，而且抗体的维持时间更长。应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。当前第1页12