本发明涉及一种用于提高抗氧化功能的不饱和脂肪酸组合物及其应用，进而，涉及保健食品、食品营养、药物领域。
背景技术：
流行病学调查已证实ad(老年痴呆)的低发生率与摄入高含量的膳食ω-3pufas，主要是二十碳五烯酸(epa)和二十二碳六烯酸(dha)(sydenham等人，2012)相关。ω-3长链多不饱和脂肪酸(ω-3pufas)作为神经元膜的组成部分，是必不可少的营养物质，对人体器官及其功能起主要作用。他们参与炎症和免疫学过程和激素调节。此外，他们参与大脑的发育和功能。
大量研究已证实氧化应激与长期慢性炎症能够造成神经元的损伤和功能异常，是抑郁或ad发病的诱因。
几个证据显示ad中炎症细胞因子的存在增加，例如ad患者血清中tnf-α水平升高和白细胞介素-6mrna在appsw转基因小鼠tg2576海马和皮质中的存在以及在大脑皮质中围绕老年斑的活化的小神经胶质细胞的增加。
活化的小神经胶质细胞不仅可以产生促炎细胞因子，而且可以产生自由基一氧化氮和超氧阴离子。这些基团与tnf-α分泌物一起诱导与ad相似的神经变性事件。研究表明，sh-sy5y细胞中aβ25-35的毒性与ros和no释放和氧化损伤的增强有关，其上调了氧化还原敏感的转录因子如nf-κb，这是ad中氧化和炎症反应的重要因素。
在以前的研究中，报道了神经炎症可以降低神经营养因子如ngf和bdnf的水平。事实上，已报道在ad患者中增加和减少的神经营养因子浓度和受体功能。神经营养系统参与与神经元生长，存活和可塑性相关的许多生理过程。还报道了ad中胆碱能神经元神经发生的功能障碍。
ω-3pufas涉及脑中细胞膜磷脂构成的结构和功能，并被认为在认知过程中起重要作用。其次，已经发现ω-3pufas具有抗氧化和抗炎作用。特别是在老化的大脑中，这种特性可能有助于神经元的保护并防止细胞死亡。
目前，包含不饱和脂肪酸的鱼油或亚麻籽油已广泛运用于保健食品中。然而在临床和实验中，不同的不饱和脂肪酸的效果并不一致：有显示良好抗炎、抗氧化、神经保护，也有无效报道。这些不同的效果可能与其所用不同来源不饱脂肪酸有关，或与其来源不同所含dha和epa比例不同导致结果的差异。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种用于提高抗氧化功能的不饱和脂肪酸组合物，包含epa和dha，其特征在于：epa:dha的摩尔比为2:1。
本发明的目的还在于提供一种用于提高抗氧化功能的保健食品，其特征在于：含有权利要求1所述的不饱和脂肪酸组合物，所述不饱和脂肪酸组合物中，epa:dha的摩尔比为2:1。
本发明还提供所述的不饱和脂肪酸组合物在提高抗氧化功能的药品中的应用。
本发明提供所述的不饱和脂肪酸组合物在提高抗氧化功能的食品中的应用。
本发明人通过系统比较研究了不同比例dha和epa比例组合的抗氧化、抗炎和神经保护效果，从中确定了最为有效的比例组合。并可通过人工调和达到最优比例配方，从而提供产品功能效果。
附图说明
图1示出制备用于提高抗氧化功能的不饱和脂肪酸组合物的流程图。
图2a示出不同浓度的epa、dha对aβ诱导的细胞活力降低的影响。
图2b示出epa、dha及其不同比例对aβ诱导的细胞活力降低的影响。
图2c示出epa、dha及其不同比例对aβ诱导的细胞损伤的保护作用。
图3a示出epa、dha及其不同比例对aβ诱导的ros水平变化的影响。
图3b示出epa、dha及其不同比例对aβ诱导的no水平变化的影响。
图3c示出epa、dha及其不同比例对aβ诱导的gsh水平变化的影响。
图4a示出epa、dha及其不同比例对aβ诱导的tnf-αmrna表达增加的影响。
图4b示出epa、dha及其不同比例对aβ诱导的tnf-α水平增加的影响。
图5a示出epa、dha及其不同比例对aβ诱导的ngfmrna表达的影响。
图5b示出epa、dha及其不同比例对aβ诱导的bdnfmrna表达的影响。
图5c示出epa、dha及其不同比例对aβ诱导的ngf水平的影响。
图5d示出epa、dha及其不同比例对aβ诱导的bdnf水平的影响。
图6a示出epa、dha及其不同比例对aβ诱导的bax：bcl-2比例的影响。
图6b示出epa、dha及其不同比例对aβ诱导的caspase-3蛋白表达的影响。
具体实施方式
下面将结合本发明具体实施例，对本发明的技术方案进行验证，所验证的实施例仅为本发明的部分实施例。基于本发明中的实施例，本领域研究人员在没有做出任何创造性劳动前提下所获得的其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的用于提高抗氧化功能的不饱和脂肪酸组合物中，epa:dha的摩尔比为2:1。
其中组合物中的epa、dha为市售纯品，组合物的制备流程如图1所示：首先分别测试不同浓度的epa和dha对aβ诱导的sh-sy5y细胞的ad细胞模型的细胞活力的影响，从而确定起保护作用epa和dha的剂量浓度，然后再以不同比例epa和dha组合处理细胞，检测sh-sy5y细胞的细胞活力，抗氧化指标：ros、no、gha，抗炎指标：tnf-α，抗凋亡指标bc1、bax、caspase-3，从而确定epa：dha的摩尔比为2:1时抗氧化效果最优，只需将epa和dha人工调配至所需比例，采用一般方法混合均匀即得到所述组合物。
可以理解，本发明不饱和脂肪酸组合物，可以作为保健食品单独食用，也可以加入到其它食品中混合食用或在制备抗氧化药物中应用。
本发明的用于提高抗氧化功能的保健食品，含有本发明的第一方面所述的不饱和脂肪酸组合物，所述不饱和脂肪酸组合物中，epa:dha的摩尔比为2:1。
所述保健食品可以是普通食品的形态，也可以使用片剂，胶囊，丸剂、冻干形式，或者任何合适的给予形式。
本发明范围内的保健食品可包括一种或多种下面的添加剂：防腐剂、增溶剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、调味剂、除臭剂、缓冲溶液、包衣剂、抗氧化剂、悬浮剂、助剂、赋形剂和稀释剂。
本发明还提供所述的不饱和脂肪酸组合物在提高抗氧化功能的药品中的应用。
所述含有epa和dha的不饱和脂肪酸组合物可被用在药物组合物中以使药物中富含epa和dha。
所述的药物组合物方便的形式可以为用于口服给药的片剂，丸剂，胶囊剂，糖浆剂，粉剂或颗粒剂；用于非肠道给药的灭菌非肠道或皮下溶液，悬浮液或用于直肠给药的栓剂，所有这些都是本领域公知的。
具体的剂量水平和剂量频率对任何特定的患者来说可以是变化的，其将取决于多种因素，包括所使用的特定化合物的活性、此化合物活性的代谢稳定性和持续时间、年龄、体重、一般健康状况、性别、日常饮食、给药的方式和时间、排泄的速率、药物的组合、特定病症的严重程度以及单个进行的治疗。本发明的药剂和/或药物组合物可以根据每天1～10次方案给药，如每天一次或两次。对于口服和肠胃外给药患者，药剂的日剂量水平可为单一剂量或分开的剂量。
本发明提供所述的不饱和脂肪酸组合物在提高抗氧化功能的食品中的应用。
本发明的组合物可被用在食品工业中以使食品(例如谷物食品，乳制品，豆油，豆浆)中富含epa和dha。
所述的谷物食品可以具有不同的形状或外观形式。例如，可以将其制成棍形、蛋糕或蛋白杏仁饼干，或者其也可以是麦片状、片状或棒状。其可单独食用或与乳制品如奶、酸奶或酪农干酪等一起食用。
应当理解的是，还可以在食品中加入香精，例如蜂蜜、水果、巧克力、焦糖、坚果、杏仁、酸奶香精或其组合。
目前市场上销售的不饱和脂肪酸产品大部分来自深海鱼油，也有来自植物、各种藻类的提取，其成分各异，尤其在dha和epa比例上存在明显差异。例如市场上常见的来自金昌鱼或大马哈鱼中鱼油dha：epa接近1:2；而来自海藻中的不饱和脂肪酸则含有更高dha比例，这导致其保健效果存在较大差别。而目前为止，尚无对不饱和脂肪酸中dha和epa比例组合在抗氧化、抗炎，神经保护方面的研究，对两者比例变化与效果之间不清楚，因此也无最优比例配方和产品。
本发明人通过系统比较研究了不同比例dha和epa比例组合的抗氧化、抗炎和神经保护效果，从中确定了最为有效的比例组合。并可通过人工调和达到最优比例配方，从而提供产品功能效果。
aβ是由淀粉样前体蛋白(app)经β-和γ-分泌酶在病理条件下的蛋白水解产物。aβ25-35是一种对应于25-35个氨基酸的全长aβ的合成肽，具有相同的β-折叠结构，并保持全长aβ1-42的完全毒性。该肽显示形成稳定的原纤维的快速聚集性质，并且在溶解时立即具有神经毒性。本发明使用aβ25-35-损伤分化的sh-sy5y细胞作为ad模型，比较不同epa/dha比例对sh-sy5y细胞中aβ25-35诱导的神经毒性的潜在神经保护作用。
目前，没有任何实验分别对epa，dha或一定比例的组合进行研究并在同一试验中的比较不同ω-3pufas。本发明研究单独的epa和dha及其不同比例的组合对aβ25-35诱导的ad细胞模型的作用。测量细胞活力，以比较epa，dha或其各种比例的组合在对aβ25-35诱导的ad细胞模型的神经毒性的影响，以及它们的潜在协同作用。此外，测量氧化应激，促炎细胞因子和神经营养因子的水平，以分析epa，dha或其组合可能有益于ad的细胞和分子机制。以及不同比例的epa/dha调节凋亡相关基因表达的能力。
在本发明中，“fas”是指不同浓度的epa，dha或其不同比例组合。
实施例
将人类神经母细胞瘤细胞系sh-sy5y细胞用全反式视黄酸(ra)处理7-8天完全分化为人神经元样细胞。在分化的最后一天，细胞开始用于实验。在aβ25-35诱导的分化的sh-sy5y细胞的ad细胞模型中测试epa和dha在6、12、25、50、100μm对细胞活力的影响。其中出现轻微但显著的衰减aβ25-35诱导的细胞活力降低的点选择为epa和dha的最佳剂量和培养持续时间。随后进行以下七组研究：(i)对照(培养基)，(ii)aβ25-35(加aβ25-35的培养基)，(iii)aβ+epa(用epa预处理，然后用aβ25-35处理)，(iv)aβ+dha(用dha预处理，然后用aβ25-35处理)和(v-vii)aβ+epa+dha(分别用2:1,1:1和1:2的epa+dha(共25μm)处理，然后用aβ25-35处理)。在添加aβ25-35之前，将细胞用epa，dha，它们的组合或对照溶剂预处理12小时。加入aβ25-35(终浓度为20μm)后，细胞再孵育24小时。然后，研究sh-sy5y细胞中的细胞活力，氧化应激，炎性细胞因子tnf-α，神经营养因子和细胞凋亡。
本实施例中，作为试剂，使用如下：>99％纯度的二十碳五烯酸(epa；20：5，n-3)和二十二碳六烯酸(dha；22：6，n-3)的钠盐来自sigma-aldrich公司。将fas溶解在培养基中，在氮气流下分为等分试样，并在-80℃保存直至使用。
在本实施例中，sh-sy5y来自atcc(crl-2266，lot.61983120)。将细胞在含有10％胎牛血清(fbs，
使用测量细胞增殖速率和细胞活力的3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴化物(mtt)来测量细胞活力。将细胞接种在96孔板中，向每个孔中加入90μl细胞悬浮液。在实验处理后，根据制造商的说明书用mtt(atcc)检测细胞活力。使用酶标仪(biotek，usa)在570nm测量光密度。对照组的吸光度被认为是细胞活力的100％。
如通过mtt法检测的，aβ25-35在20μm24小时显著降低分化的sh-sy5y细胞的细胞活力(p<0.01，图2a)。然而，用不同浓度的epa或dha(6-100μm)预处理显著地减弱了aβ25-35以剂量依赖性方式引起的细胞活力的降低，并且在epa中的6,12(p>0.05)，25(p<0.05)，50μm(p<0.01)和100μm(p<0.05)，或在dha中的6(p<0.05)，12-50(p<0.01)和100μm(p<0.05)(图2a)。与epa相比，dha的效果似乎比epa在相同剂量下的效果更强。在这些结果的基础上，在随后sh-sy5y细胞进行氧化应激，炎症和凋亡的测定中，我们选择25μm作为不同比例处理中epa和dha组合的总剂量。
由于mtt测定对细胞数量敏感，其受细胞增殖和细胞活力的影响，所以必须使用另一种检测方法确认结果。使用cytotox-96测定试剂盒(promega，加拿大)来评估培养基中细胞质乳酸脱氢酶(ldh)的总释放，这是细胞完整性损伤的结果。该测定基于从2-p-(碘苯基)-3-(对硝基苯基)-5-苯基四唑氯化物(int，四唑盐类)到甲臜产物的偶联酶转化，酶反应通过ldh从细胞中释放和在测定底物混合物中的心肌黄酶来催化。通过酶标仪在490nm处读取吸光度。将每组的平均吸光度归一化为对照值的百分比。
为了测试不同epa/dha比例在神经保护中具有不同程度影响的假设，在下面测试中采用如下不同的fas组合：epa/dha为2:1，epa/dha为1:1或epa/dha为1:2。
图2b的结果显示，与aβ25-35组相比，在所有比例测试中，不同的epa/dha比例显著(p<0.05)提高细胞活力。保护sh-sy5y细胞免受aβ25-35诱导的神经毒性的fas效力为：epa<2：1epa/dha<dha≤1：1epa/dha<1：2epa/dha。
通过ldh释放测定(其是细胞死亡的指标)进一步证实了不同比例epa/dha对aβ25-35诱导的sh-sy5y细胞损伤的保护作用(图2c)。结合上述测定结果，我们可以肯定地得出结论，epa，dha及其组合都可以在不同程度上有效保护分化的sh-sy5y细胞免受aβ25-35诱导的细胞损伤，最佳的提高细胞活力的epa：dha的比例为1：2epa/dha。
在本实施例中，测定氧化应激和抗氧化反应，如，在96孔板中接种sh-sy5y细胞，向每个孔中加入200μl细胞悬浮液。在实验处理后，用荧光细胞内ros试剂盒(sigmaaldrich)量化细胞内ros的水平。使用荧光酶标仪(readersynergyht，biotekinstruments，美国)，以lex＝650/lem＝675nm检测荧光强度。根据制造商的说明书，通过griess试剂系统(promega，加拿大)测定细胞内一氧化氮(no)产生量。使用酶标仪在540nm处测量吸光度。
将sh-sy5y细胞接种在96孔板中，并向每个孔中加入2ml细胞悬浮液。在实验处理后，根据制造商的说明书，用谷胱甘肽测定试剂盒(sigmaaldrich)测量gsh浓度。荧光强度用荧光计读数器测定，激发波长为390nm，发射波长为478nm。
图3a说明aβ25-35比对照组显著增加ros荧光(p<0.01)。当与aβ25-35组比较时，单独使用epa和所有测试比例下epa和dha的组合的ros荧光显著降低(p<0.05)。然而，在dha组中ros荧光没有发现显著差异。保护sh-sy5y细胞免受aβ25-35诱导增加的ros荧光的fas效力为：dha<1：2epa/dha<epa<1：1epa/dha≤2:1epa/dha。
如图3b所示，当单独用aβ25-35处理细胞时，观察到硝酸盐水平显著增加约40.29％(p<0.05)。然而，与aβ25-35组相比，单独使用epa处理的硝酸盐水平轻微但不显著降低(p<0.05)。与aβ25-35组比较，单独使用dha和所有epa/dha处理组处理，均无硝酸盐水平显著差异。
如图3c所示，aβ25-35损伤细胞的gsh含量显著(p<0.05)降低，与aβ25-35组相比，所有比例测试的epa/dha显著(p<0.05)增加gsh含量。保护sh-sy5y细胞免受aβ25-35诱导的抗氧化gsh降低的fas效力为：1:2epa/dha≤dha<1:1epa/dha<epa≤2:1epa/dha。
将分化的sh-sy5y细胞接种在六孔板中，并向每个孔中加入2ml细胞悬浮液，实验结束后，收获细胞。采用rna提取方法使用goscripttmreversetranscriptase(a)(promega，加拿大)从rna合成互补dna(cdna)。2μgrna用于第一链cdna合成。引物的核苷酸序列来自ncbi的nucleotide数据库和primerpremier6.0。在ncbi-核苷酸-blast中的特异性验证之后，引物的合成由invitrogen公司进行。使用quantitectsybrgreenmastermix(qiagen)制备pcr反应，并使用实时pcr检测系统(bio-rad，美国)cfx96tm实时系统进行pcr反应。pcr过程如下：95℃初始孵育5分钟以激活hot-star-taqdna聚合酶，然后94℃15秒(变性)，59℃30秒(退火)，和72℃30秒(延伸)。经过38个循环后，产生了一个熔解曲线，用于测定引物的特异性和同一性。基因表达水平用管家基因β-肌动蛋白的rna表达(相对定量)与△△ct校正标准化。
将sh-sy5y细胞接种在6孔板中，并向每个孔中加入2ml细胞悬浮液。经实验处理后，收集细胞并以10.000g离心10分钟，并用ripa缓冲液(ripa，thermoscientific)裂解。通过超声波辅助裂解，裂解物在4℃以10000g离心10分钟。收集上清液，煮沸后加入含有20-40μg蛋白质的等分试样，并在10％sds-page凝胶上以100v在电泳缓冲液中分离60分钟。运行凝胶后，将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(pvdf)膜上。然后将印迹在tris缓冲液-吐温20(tbst)中洗涤5分钟，然后在20℃下封闭(tbst和5％无脂奶粉)1小时。封闭后，用tbst洗涤印迹5分钟，与一抗一起孵育，包括用于肌动蛋白，ngf，bdnf，trka，trkb，tnf-α，bcl-2，bax和caspase-3(abcam)的兔源多克隆抗体，4℃过夜，然后在20℃下加入二抗，过氧化物酶(hrp)结合的抗兔igg1小时。将印迹在tbs中洗涤三次。使用claritytmwesternecl底物试剂盒(bio-rad，加拿大)在具有imagelabtm软件(bio-rad，加拿大)的chemidoctmmp系统上检测免疫反应性条带。通过将其归一化为在同一膜上重新探测的β-肌动蛋白，然后以对照组的百分比计算，定量所有靶蛋白。
与对照组相比，早在4h孵育后，通过给予aβ25-35，tnf-αmrna表达显著增加(p<0.05，图4a)，但是在与aβ25-35孵育12小时之前无法发现蛋白质表达的增加(p<0.01)。然而，与aβ25-35组相比，单独和联合使用的epa和dha恢复了对aβ25-35处理反应的tnf-αmrna表达的显著降低。(图4a)此外，1：1epa/dha的效果比单独的epa或dha的效果明显更有效，这些证据表明1:1epa/dha可以对抗炎剂发挥潜在的协同作用。
与tnf-α基因相似，aβ25-35处理4小时出现明显的ngf基因表达变化。与对照组比较，aβ25-35损伤细胞ngfmrna表达明显下调(p<0.01，图5a)。同时，aβ25-35损伤细胞bdnf基因mrna表达在4小时也下调(p<0.01，图5b)。与对照相比，aβ25-35-损伤细胞中，在12小时孵育时发现ngf的蛋白表达显著降低(p<0.01，图5c)，而bdnf蛋白表达显著增加(p<0.01，图5d)。用epa，dha及其各种比例预处理可以不同程度地减弱aβ25-35诱导的ngfmrna和蛋白质表达(图5a，c)，bdnfmrna表达(图5b)和bdnf蛋白表达变化(图5d)。
与前面的基因不同，trka和trkb在给予aβ25-3524小时后受到影响。aβ25-35明显降低trka蛋白表达(p<0.01)。epa，dha及其各种比例处理不能显著改变aβ25-35对受体的作用，除了2：1epa/dha显著增加了这种变化(图5a)。在单独给予aβ25-35的细胞中，也发现trkb蛋白质不太明显的增加(p<0.05)。2：1和1：2epa/dha预处理可部分显著逆转aβ25-35诱导的trkb表达变化(均p<0.05，图5b)，与aβ组相比，用epa和/或dha处理的其他组无明显变化。
在aβ25-35的不同孵育时间(4、8、12和24小时)下测试基因bax，bcl-2和caspase-3蛋白表达。bcl-2在以aβ25-35孵育24h时，蛋白表达被aβ25-35强烈降低，通过用epa，dha及其各种比例的预处理不同程度显著增加(p<0.01)。关于bax，在4～24小时孵育后未发现明显的变化。细胞中bax：bcl-2的比例在单独给予aβ25-35显著增加(p<0.01)。然而，epa，dha及其各种比例处理可以不同地显著减弱这种作用，并将bax：bcl-2比例降低到不同程度的控制水平(除了epap<0.05，所有p<0.01，图6a)
对于半胱天冬酶-3，aβ25-35显著增加其蛋白表达(p<0.01)，而epa，dha及其各种比例处理可以不同程度地减弱aβ25-35的作用(除了1：1epa/dhap<0.05，所有p<0.01，图6b)。
总而言之，1:2epa/dha显示对细胞活力降低最有效；2:1epa/dha是在测试组中发挥抗氧化作用的最有效的比例。对于抗炎效果，1:1epa/dha是所有测试比例中的最佳比例；当涉及抗凋亡作用时，纯dha比epa和任何其他比例的组合更有效。基于这些结果，得出的结论为，epa，dha及其各种比例通过不同地抑制炎症和氧应激，不同地调节sh-sy5y细胞中aβ25-35诱导的神经毒性，调节神经营养因子水平，从而减弱神经元凋亡。