本发明涉及制备复合物的方法，该复合物中的生理活性多肽通过含两个或更多个醛作为官能团的非肽基聚合物连接体共价结合至免疫球蛋白恒定区。更具体地，本发明涉及有效制备生理活性多肽复合物的方法，其特征在于通过在制备时调整还原剂的使用来改进低产率和多肽试剂变形的问题。
背景技术：
：总体而言，生理活性多肽由于它们的低稳定性而容易变性，并且在血液中容易经历蛋白水解降解和随后的肾或肝脏清除。因此，含生理活性多肽作为药物成分的蛋白质药物需要频繁地对患者给药，以维持适当的血清水平和效价。然而，此类蛋白质药物的频繁给药(其大多数是以注射的形式)引起患者疼痛而且治疗成本高。为了解决这些问题，已经投入许多努力来改进蛋白质药物的血清稳定性，和使血液中的药物长期维持在高水平以使药物的药效达到最大。作为长效制剂使用的需求，蛋白质药物必须配制成具有高稳定性并且维持足够高水平的效价而不引发患者的免疫应答。传统的稳定蛋白质和防止酶降解及肾脏清除的方法是用具有高溶解度的聚合物(例如，聚乙二醇(在下文中称为“peg”)对蛋白质药物的表面进行化学修饰。通过结合至目标蛋白的特定区域或各种区域，peg使得蛋白质的溶解度更高，从而稳定蛋白质并防止水解而不引起严重的副作用(sada等人，j.发酵生物工程(j.fermentationbioengineering)71:137-139)。例如，wo2006/076471公开了通过将b-型钠尿肽(bnp)与pegs结合而使其长效的方法，该pegs结合至钠尿肽受体a(npr-a)以引发cgmp的合成，从而降低动脉血压。其因而用于充血性心力衰竭的治疗。美国专利号6,924,264描述了一种通过使其赖氨酸残基peg化来改进艾塞那肽(exendin-4)在体内的持续时间的方法。然而，在此方法中，尽管其有能力通过增加peg的分子量来增加肽药物的循环时间，但peg化仍有问题，例如，大大降低了肽药物的效价和降低了产率，这是因为随着peg的分子量增加，肽的反应性下降。wo02/46227公开了这样的融合蛋白，其中glp-1和艾塞那肽(exendin-4)或其类似物与人血清白蛋白或通过遗传重组制备的免疫球蛋白片段(fc)结合。美国专利号6,756,480涉及这样的融合蛋白，其中甲状旁腺激素(pth)或其类似物连接至fc。虽然这些方法可被评估为peg化问题——例如低产率和非特异性——的解决方案，但是已经显示其增加目标肽的体内半衰期的效果不显著，与预期相反，而且在某些情况下，融合蛋白具有低效价。虽然多种肽基连接体被利用以使增加血清半衰期的效果达到最大，但它们有可能引起免疫应答。此外，具有二硫键的肽(例如，bnp)在实际应用中有困难，因为其很容易引起错误折叠。此外，不可能通过遗传重组产生具有非天然氨基酸残基的肽基连接体。胰岛素是由人胰腺β-细胞分泌的肽，主要是调节体内血糖水平。当胰岛素分泌不正常或分泌的胰岛素无法在体内适当地发挥作用时，血糖水平不能被控制并且升高，导致糖尿病。后一种情况称为2型糖尿病。然而，在胰岛素不能从胰腺分泌并且引起血糖水平升高的情况下，导致1型糖尿病。2型糖尿病患者用口服降血糖剂治疗，其中一些患者用胰岛素治疗。同时，对于1型糖尿病患者基本上需要注射胰岛素。通常，通过在每餐之前或之后每天注射三次来施用胰岛素进行胰岛素疗法。然而，每天三次连续胰岛素给药对于患者是痛苦的而且不方便。已经做出很多尝试来解决这些问题。旨在提高蛋白质药物在生物膜中的通透性的一种策略是通过口或鼻吸入来递送药物。然而，与注射相比，通过口或鼻吸入给药的递送效率明显地低，并且难以将肽药物维持在体内活性所需的水平。作为可供选择的策略，可以将过量药物皮下注射并以延迟的方式吸收至体内，以维持恒定的血液水平，即使每天注射一次。一些药物(例如，兰德仕(lantus))、赛诺菲安万特(sanofi-aventis))已被批准用于商业用途并且目前已对患者给药。另外，已经针对用脂肪酸修饰胰岛素进行了研究以使胰岛素结合物的结合更强并通过在注射位置或血液中与白蛋白组合来延长持续时间。一些药物(例如，诺和平(levemir)、诺和诺德(novonordisk))已被批准用于商业用途。然而，这些药物在注射位置引起疼痛并且必须每天注射一次，这对患者仍是巨大的负担。为了克服现有技术中遇到的问题，本发明者已制备了含生理活性多肽和免疫球蛋白恒定区(其通过使用非肽基聚合物作为连接体连接)的复合物，作为同时增加生理活性多肽(如，胰岛素)的血浆半衰期和体内持续时间的策略。然而，还需要以高产率和高纯度制备复合物的方法，因为该复合物的成分非常昂贵。出于此考虑，本发明者已经开发了以降低的成本、高产率和高纯度制备生理活性多肽复合物的方法，该方法在复合物生产的反应期间，在反应溶液中使用最佳浓度的合适种类的还原剂，从而完成本发明。技术实现要素：技术问题本发明的目的是提供制备复合物的有效方法，其中生理活性多肽通过含两个或更多个醛作为官能团的非肽基聚合物连接体共价结合至免疫球蛋白恒定区，其特征在于在反应期间，通过在反应溶液中使用最佳浓度的合适种类的还原剂来改进低产率和多肽试剂变形的问题。问题解决方案一方面，为了实现上述目的，本发明提供制备生理活性多肽-非肽基聚合物-免疫球蛋白恒定区的复合物的方法，其包括(1)在浓度为1-20mm的还原剂的存在下，使具有两个或更多个醛作为官能团的非肽基聚合物与生理活性多肽或免疫球蛋白恒定区的其中之一反应；和(2)使(1)的反应混合物与生理活性多肽或免疫球蛋白恒定区中的另一个在浓度为1-100mm的还原剂的存在下反应。该反应混合物可包括非肽基聚合物与生理活性多肽的结合物或非肽基聚合物与免疫球蛋白恒定区的结合物，和/或保持未反应的反应物。因此，本发明的方法可进一步包括：在步骤(1)之后，从反应混合物中分离生理活性多肽-非肽基聚合物的结合物或免疫球蛋白-非肽基聚合物的结合物。本文所用的术语“非肽基聚合物”是指由至少两个重复单元组成的生物相容性聚合物，该重复单元通过除肽键外的任意共价键保持在一起。用于本发明的非肽基聚合物的例子包括：聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇与丙二醇的共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯基醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、生物可降解聚合物(例如，聚乳酸(pla)和聚乳酸-羟基乙酸(plga))、脂质聚合物、壳多糖、玻尿酸及其组合，优选聚乙二醇(peg)。本领域中众所周知的其衍生物和容易使用本领域已知的方法制备的衍生物均在本发明的范围内。如上所述，非肽基聚合物可具有两个或更多个醛作为官能团。因此，上面所列出的非肽基聚合物本身可以是双-或-多功能醛形式或优选地在其两个或更多个醇基上包含具有醛基的取代基。具有醛基的取代基可以是烷基醛(例如，丙醛或丁醛)。在一个优选实施例中，非肽基聚合物可以是在其每个末端上具有丙醛取代基的peg。通过框内融合技术构建的融合蛋白质中所使用的传统肽基连接体的缺点是肽基连接体容易在体内被蛋白酶裂解，因而不能通过载体确保血清半衰期的延长，这与预期相反。然而，在本发明中，使用对蛋白酶抵抗的聚合物，因此肽的血浆半衰期可维持在与载体相似的水平。因此，只要对体内蛋白酶抵抗，任何非肽基聚合物都可用于本发明，而没有限制。非肽基聚合物的分子量范围从1至100kda，优选于1至20kda。此外，连接至生理活性多肽的非肽基聚合物可以是单个的聚合物或不同聚合物的组合。而且，用于本发明的非肽基聚合物可以在其两个或三个末端具有可与生理活性多肽和免疫球蛋白恒定区偶联的官能团。优选地，该官能团可以为醛。与peg结合(其通常被用于制备蛋白质药物的长效制剂)增加蛋白质的稳定性，而较大分子量的peg显示与蛋白质的反应性较低，因而降低产率。由于产率与生产成本和工业适用性紧密相关，所以增加产率是非常重要的。用醛作为官能团的peg可偶联至胺基，其存在于生理活性多肽或免疫球蛋白恒定区的n-末端或lys残基侧链上。在这方面，peg化的产率可根据各种因素而变化，这些因素包括peg与蛋白质的摩尔比、反应溶液的浓度、反应时间、ph、温度等。chem.biol.drugdes.2007；69；132-138描述了通过调整各种因素(包括摩尔比、反应时间、ph等)用5k醛mpeg进行胰岛素peg化，产率超过90％。us2009/0252703a1中报道了将有机溶剂添加至反应溶液增加肽peg化的产率。wo2010/089756a2公开了通过将r-methug-csf与peg在碳水化合物的存在下反应以改进peg化产率。然而，当使用含具有两个或更多个官能团的peg的非肽基聚合物作为两个不同多肽之间的连接体时，反应中需要两个或更多个步骤，从而降低总产率。具体地，与第一反应的步骤(其中生理活性多肽或免疫球蛋白恒定区与具有两个或更多个官能团的非肽基聚合物反应)相比，观察到第二反应的步骤(其中与具有两个或更多个官能团的非肽基聚合物结合的生理活性多肽或免疫球蛋白恒定区分别与免疫球蛋白恒定区或生理活性多肽反应，下文中称为“偶联反应”)以明显较低的产率进行。在本发明中，已证明第一反应中的还原剂浓度与第二偶合反应的产率有关。第一反应中的还原剂浓度越低、反应时间越短和反应温度越低时，观察到该偶联反应的产率越高。本文所使用的术语“还原剂”是指这样的化合物，其功能是还原从非肽基聚合物的醛基与多肽(生理活性多肽、免疫球蛋白恒定区)的胺基之间的反应中所形成的可逆亚胺双键，从而形成共价键，并且意图包括所有本领域中已知的还原剂。为了本发明的目的，可将还原剂添加至反应溶液中，其中非肽基聚合物与生理活性多肽或免疫球蛋白恒定区形成共价键。只要是本领域常用的，任何还原剂都可用于本发明。还原剂的例子可包括，但不限于：氰基硼氢化钠、硼烷吡啶复合物、硼氢化钠、硼烷二甲基胺复合物、硼烷三甲基胺复合物和三乙酰氧基硼氢化钠。可依据生理活性多肽或免疫球蛋白恒定区和反应溶剂的种类选择适当的还原剂。还原剂用于生理活性多肽或免疫球蛋白恒定区与非肽基聚合物的结合。反应溶液可包括用于生理活性多肽或免疫球蛋白恒定区与非肽基聚合物之间的反应的浓度在1-20mm的还原剂，和用于偶联反应的浓度在1-100mm的还原剂。更优选地，还原剂可以1-20mm的浓度用于生理活性多肽或免疫球蛋白恒定区与非肽基聚合物之间的结合反应和以1-40mm的浓度用于偶联反应。生理活性多肽或免疫球蛋白恒定区与非肽基聚合物之间的结合反应(步骤(1)的反应)可在0至25℃温度下进行1至16小时。此外，偶联反应(步骤(2)的反应)可进行1至48小时。优选地，步骤(1)的反应可在0至25℃温度下，在浓度为1至20mm的还原剂的存在下进行1至16小时，而步骤(2)的反应可在浓度为1至40mm的还原剂的存在下进行1至48小时。在一个优选的实施方式中，在各种不同的条件下使用氰基硼氢化钠作为还原剂，以增加复合物的产率，在复合物中，胰岛素、具有两个或更多个醛作为官能团的peg连接体和免疫球蛋白恒定区被连接在一起。已发现当第一反应(该反应进行以连接生理活性多肽或免疫球蛋白恒定区和非肽基聚合物)在低温下、在低浓度还原剂的存在下进行短时间时，偶联反应的产率提高(表1)。在另一个优选的实施方式中，用不同浓度的还原剂硼烷吡啶复合物进行反应，并在较低浓度的还原剂用于生理活性多肽或免疫球蛋白恒定区和非肽基聚合物之间的第一反应之后，检测到第二反应(偶联反应)的产率较高。与使用硼烷吡啶复合物的情况相比，使用氰基硼氢化钠作为还原剂的情况显示出更高的产率(表2)。而且，已经确认第二反应(偶联反应)的产率随着还原剂浓度的升高而增加。在一个优选的实施方式中，以不同浓度的还原剂氰基硼氢化钠进行偶联反应，在高浓度还原剂的存在下得到提高的偶联反应产率。然而，很高浓度的还原剂引起免疫球蛋白恒定区出现异常。为了避免此异常，偶联反应在20mm氰基硼氢化钠的存在下进行13小时，观察到其产率维持在高水平，而且免疫球蛋白恒定区的异常因此而最小化(表3和表4)。本文所使用的术语“生理活性多肽”是指一般概念上在体内具有某种生理功能的多肽。其共有多肽基结构并显示出各种不同的生物学活性。当由于涉及某种功能的材料缺少或过量而使身体出现生物异常时，生理活性多肽可调节基因表达或生理功能，从而改正该异常。典型的例子是蛋白质药物。应用于本发明的生理活性多肽实例包括人生长激素、生长激素释放激素、生长激素释放肽、干扰素、干扰素受体、集落刺激因子、类胰高血糖素肽(glp-1，等)、胃泌酸调节素、g蛋白质-偶联受体、白细胞介素、白细胞介素受体、酶、白细胞介素-结合蛋白、细胞因子-结合蛋白、巨噬细胞活化因子、巨噬细胞肽、b-细胞因子、t-细胞因子、蛋白质a、变态反应抑制剂、细胞坏死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、肿瘤坏死因子、肿瘤抑制剂、转化生长因子、α-1抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳清蛋白、载脂蛋白-e、促红细胞生成素、糖基化促红细胞生成素、血管生成素、血红素、凝血酶、凝血酶受体活化肽、血栓调节素、血液因子vii、viia、viii、ix和xiii、纤溶酶原激活剂、纤维蛋白-结合肽、尿激酶、链球菌激酶、水蛭素、蛋白质c、c-反应蛋白、肾素抑制剂、胶原酶抑制剂、超氧化岐化酶、瘦蛋白、血小板-衍生生长因子、上皮细胞生长因子、表皮细胞生长因子、血管抑制素、血管收缩素、骨生长因子、骨刺激蛋白、降血钙素、胰岛素、心钠素、软骨诱导因子、依降钙素、结缔组织活化因子、组织因子途径抑制剂、卵泡刺激激素、黄体生成素、黄体生成素释放激素、神经生长因子、甲状旁腺激素、松弛肽、分泌素、生长调节素(somatomedin)、类胰岛素生长因子、肾上腺皮质激素、胰高血糖素、胆囊收缩素、胰腺多肽、胃泌素释放肽、促肾上腺皮质激素释放因子、甲状腺刺激激素、自毒素、乳铁蛋白、肌肉抑制素、细胞表面抗原、病毒-衍生疫苗抗原、单克隆抗体、多克隆抗体和抗体片段。本发明实施方式中所使用的胰岛素是一种分泌自胰腺的生物活性肽，当血糖水平变高时，其作用是通过引起肝脏、骨骼肌和脂肪组织摄取血液中的葡萄糖并将其存储为糖原，并抑制脂类分解(其是利用脂肪作为能量来源的新陈代谢)来控制血糖水平。生物活性肽包括胰岛素激动剂、前体、衍生物、片段和变体。优选天然胰岛素、速效胰岛素和长效胰岛素。天然胰岛素是一种胰腺分泌的激素，并且通过促进细胞对葡萄糖的摄取和抑制脂类分解，在血糖水平的控制中起关键作用。具有调节血糖水平功能的胰岛素是通过一系列过程，从不具有调节血糖水平功能的胰岛素原前体产生。氨基酸序列如下：-α链:gly-ile-val-glu-gln-cys-cys-thr-ser-ile-cys-ser-leu-tyr-gln-leu-glu-asn-tyr-cys-asn(seqidno:1)-β链:phe-val-asn-gln-his-leu-cys-gly-ser-his-leu-val-glu-ala-leu-tyr-leu-val-cys-gly-glu-arg-gly-phe-phe-tyr-thr-pro-lys-thr(seqidno:2)本文所使用的术语“胰岛素激动剂”是指可结合体内胰岛素受体并表现出与胰岛素相同的生物活性而与胰岛素的结构无关的物质。本文所使用的术语“胰岛素衍生物”是指这样的肽，其功能是控制体内血糖水平，并且其氨基酸序列与天然胰岛素共有至少80％同源性。在一些氨基酸残基中可以有化学取代(例如，α-甲基化、α-羟基化)、缺失(例如，脱氨基作用)或修饰(例如，n-甲基化、糖基化、脂肪酸)。本文所使用的术语“胰岛素片段”是指具有控制体内血糖水平功能的肽，其通过从胰岛素的氨基或羧基末端添加至少一个氨基酸或删除至少一个氨基酸而制成。添加的氨基酸可以是非天然存在的氨基酸(例如，d-氨基酸)。本文所使用的术语“胰岛素变体”是指这样的肽：其氨基酸序列与天然胰岛素的氨基酸序列差异一个或多个氨基酸残基，但具有控制体内血糖水平的功能。此外，分别用于制备胰岛素激动剂、片段和变体的方法可单独地使用或组合使用。例如，用于本发明的胰岛素肽可包括这样的肽：其氨基酸序列与天然胰岛素的氨基酸序列差异一个或多个氨基酸残基，在n-末端残基具有脱氨基作用，但其具有控制体内血糖水平的功能。本文所使用的术语“免疫球蛋白恒定区”是指缺少轻链和重链的可变区、重链恒定区1(ch1)和轻链恒定区(cl)的免疫球蛋白片段，即，由重链恒定区2和3(ch2和ch3)(或包括重链恒定区(ch4))构成的fc区。任选地，免疫球蛋白fc区可进一步包括铰链区。而且，本发明的免疫球蛋白恒定区可以是只排除免疫球蛋白的重链和轻链的可变区而包括一部分或全部重链恒定区1(ch1)和/或轻链恒定区(cl)的延长免疫球蛋白fc区，只要其显示出与天然免疫球蛋白恒定区实质上相同或更好的效果。进一步，本发明的免疫球蛋白恒定区可缺少对应于ch2和/或ch3的氨基酸序列的主要部分。因此，本发明的免疫球蛋白恒定区可包括(1)ch1结构域、ch2结构域、ch3结构域和ch4结构域，(2)ch1结构域和ch2结构域，(3)ch1结构域和ch3结构域，(4)ch2结构域和ch3结构域，(5)一个或多个恒定结构域和免疫球蛋白铰链区(或部分铰链区)的组合，或(6)重链的每个恒定结构域和轻链的恒定区的二聚体。包含fc区的免疫球蛋白恒定区是可在体内代谢的生物可降解多肽，所以其可安全地用作为药物载体。此外，由于分子量相对较低，免疫球蛋白fc区在复合物的生产、纯化和产率方面均比完整的免疫球蛋白分子更有利。进一步，由于其缺少fab(其因为在抗体与抗体之间的氨基酸序列的差异而表现出高的非同质性)，所以免疫球蛋白fc单独可提供具有显著增强同质性的复合物，并且降低了诱发血液抗原性的可能性。免疫球蛋白恒定区可来源于人或动物，例如，奶牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠、天竺鼠等，且优选地为人类来源。此外，免疫球蛋白恒定区可选自衍生于igg、iga、igd、ige、igm的fc片段、或其组合或其杂化物。优选地，恒定区衍生自igg或igm(它们是血液中最丰富的)，并且最优选衍生自igg(已知其改善配体-结合蛋白质的血清半衰期)。本文所使用的术语“组合”意指相同来源的编码单链免疫球蛋白恒定区(优选fc区)的多肽连接至不同来源的单链多肽以形成二聚体或多聚体。即，二聚体或多聚体可通过选自iggfc、igafc、igmfc、igdfc和igefc片段的两种或更多种片段的组合而制成。本文所使用的术语“杂化物”意指编码不同来源的两种或更多种免疫球蛋白fc片段的序列存在于免疫球蛋白恒定区(优选地，fc区)的单链中。本发明中，多种杂化物形式是可能的。例如，杂化物结构域可由选自iggfc、igmfc、igafc、igefc和igdfc的ch1、ch2、ch3和ch4的一种至四种结构域组成，并可包括铰链区。igg被分成igg1、igg2、igg3和igg4亚类，并且本发明可包括其组合或杂化物。优选为igg2和igg4亚类，并且最优选为几乎没有效应子功能(例如，补体依赖的细胞毒性(cdc))的igg4的fc区。免疫球蛋白恒定区可具有糖基化形式，其糖基化程度可与天然形式相同，或更高或更低，或可以为去糖基化形式。通过典型的方法，例如，使用化学方法、酶法或使用微生物的基因工程法，可以实现免疫球蛋白区糖基化或去糖基化的升高或降低。其中，当去糖基化时，连接至免疫球蛋白fc区的补体(c1q)会显著减少，并且抗体-依赖的细胞毒性或补体-依赖的细胞毒性降低或移除，从而不会引起不必要的体内免疫应答。本文中，去糖基化或无糖基化免疫球蛋白fc区更符合药物载体的目的。因此，最适合作为本发明药物载体的免疫球蛋白fc区是人类igg4-衍生的无糖基化fc区。人类-衍生的fc区比非-人类衍生的fc区更优选，非-人类衍生的fc区可充当人体内的抗原并引发不需要的免疫应答，例如，针对抗原的新抗体的产生。而且，本发明的免疫球蛋白恒定区的范围不仅可以包括具有天然氨基酸序列的免疫球蛋白恒定区，而且可以包括其氨基酸序列突变体。本文所使用的术语“氨基酸序列突变体”是指氨基酸序列由于一个或多个氨基酸残基的缺失、插入、保守性或非保守性置换或其组合而不同于野生型的多肽。例如，已知对连接重要的iggfc中的位置214至238、297至299、318至322或327至331上的氨基酸残基可用作为适于修饰的位置。本发明可使用多种衍生物，例如，通过从天然fc中移除可形成二硫键的位置、移除数个n-末端氨基酸或将甲硫氨酸添加至天然fc的n-末端而制备的衍生物。此外，补体固定位置，例如，c1q固定位置，或adcc位置可从天然fc区消除以移除效应子功能。制备免疫球蛋白恒定区的氨基酸序列突变体的技术已在国际专利公开号wo97/34631和wo96/32478中公开。蛋白质或肽分子中不改变分子活性的氨基酸置换是本领域众所周知的(h.neurath,r.l.hill,theproteins,academicpress,newyork,1979)。最常见的置换发生在氨基酸残基ala/ser、val/ile、asp/glu、thr/ser、ala/gly、ala/thr、ser/asn、ala/val、ser/gly、thr/phe、ala/pro、lys/arg、asp/asn、leu/ile、leu/val、ala/glu和asp/gly之间。任选地，氨基酸可通过磷酸化、硫酸化、丙烯酸化、糖基化、甲基化、法尼基化、乙酰化和酰胺化进行修饰。上述免疫球蛋白恒定区衍生物表现出与本发明的免疫球蛋白恒定区相同的生物学活性，但其对于热、ph等具有改进的结构稳定性。这些免疫球蛋恒定区可从分离自人或动物，例如，牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠、天竺鼠等的天然型中获得，或可以是从转化动物细胞或微生物中得到的重组体或衍生物。可通过对从人类或动物样品中分离的免疫球蛋白的整个范围进行蛋白酶消化得到天然恒定区。免疫球蛋白用木瓜蛋白酶裂解为fab和fc，和用胃蛋白酶裂解为pf'c和f(ab)2，然后通过尺寸排阻色谱法从其中分离fc或pf'c。优选从微生物中获得的重组人免疫球蛋白恒定区。发明的有利效果如上所述，可以利用本发明的方法以高纯度和高产率以及低成本制备生理活性多肽-非肽基聚合物-免疫球蛋白恒定区复合物。因此，本发明的方法适用于工业。而且，其可用于开发具有改善的药物顺应性的生理活性多肽的长效制剂。具体实施方式通过以下实施例可获得对本发明更好的理解，这些实施例提供说明，但不应解释为对本发明的限制。实施例1：使用氰基硼氢化钠作为还原剂的胰岛素peg化和单-peg化胰岛素的纯化将胰岛素粉末溶于10mmhcl，并用3.4k丙(propion)-ald2peg(具有两个丙醛基的peg，idb，韩国)在β链的n-末端进行peg化。在此时，使5mg/ml胰岛素与peg以1:2的摩尔比在4℃至室温下反应2小时。反应在2-20mm氰基硼氢化钠作为还原剂的存在下，在45％异丙醇中的50mm柠檬酸钠缓冲液(ph6.0)中进行。将反应混合物装载到sp-hp(gehealthcare)柱上，然后用含柠檬酸钠(ph3.0)和45％etoh的缓冲液洗脱并使用kcl的浓度梯度纯化单-peg化胰岛素。在制备含胰岛素和免疫球蛋白fc区的复合物期间，根据还原剂氰基硼氢化钠的条件，胰岛素的peg化产率总结于下表1。实施例2：根据peg化中用作还原剂的氰基硼氢化钠的条件，单-peg化胰岛素-免疫球蛋白fc区复合物产率的变化为了检测胰岛素-peg-免疫球蛋白fc区复合物的产率，使实施例1中制备的单-peg化胰岛素与免疫球蛋白fc以摩尔比1:1在25℃下反应13小时，总蛋白质浓度设置为20mg/ml。该偶联反应在20mm氰基硼氢化钠作为还原剂的存在下，在100mmhepes缓冲液(含22mm磷酸钾和10％乙醇，ph8.2)中进行。将反应混合物装载到source15q(gehealthcare)柱上，然后用tris-hcl(ph7.5)缓冲液洗脱并使用nacl的浓度梯度分离和纯化未反应的胰岛素、未反应的免疫球蛋白fc区、胰岛素-peg-免疫球蛋白fc区复合物和与两个或更多个单-peg化胰岛素(胰岛素-peg)部分偶联的免疫球蛋白fc区。通过色谱法纯化后，在280nm的uv吸光度下测定胰岛素-peg-免疫球蛋白fc区复合物的产率。表1中，根据胰岛素peg化中用作还原剂的氰基硼氢化钠的条件，总结了与免疫球蛋白fc区偶联反应的产率。【表1】实施例3：使用硼烷吡啶复合物作为还原剂的胰岛素peg化和单-peg化胰岛素的纯化将胰岛素粉末溶于10mmhcl，并用3.4k丙-ald2peg(具有两个丙醛基的peg，idb，韩国)。在此时，使5mg/ml胰岛素与peg以摩尔比1:2在4℃下反应2小时。该反应在3至20mm硼烷吡啶复合物作为还原剂的存在下，在45％异丙醇中的50mm柠檬酸钠缓冲液(ph6.0)中进行。将反应混合物装载到sp-hp(gehealthcare)柱上，然后用含柠檬酸钠(ph3.0)和45％etoh的缓冲液洗脱并使用kcl的浓度梯度纯化单-peg化胰岛素。在制备含胰岛素和免疫球蛋白fc区的复合物期间，根据还原剂硼烷吡啶复合物的条件，胰岛素的peg化产率总结于下表2。实施例4：根据peg化中作为还原剂使用的硼烷吡啶复合物的条件，单-peg化胰岛素-疫球蛋白fc区复合物产率的变化为了检测胰岛素-peg-免疫球蛋白fc区复合物的产率，使实施例3中制备的单-peg化胰岛素与免疫球蛋白fc以1:1的摩尔比在25℃下反应13小时，总蛋白质浓度设置为20mg/ml。该偶联反应在20mm氰基硼氢化钠作为还原剂的存在下，在100mmhepes缓冲液(含22mm磷酸钾和10％乙醇，ph8.2)中进行。将反应混合物装载到source15q(gehealthcare)柱上，然后用tris-hcl(ph7.5)缓冲液洗脱并使用nacl的浓度梯度分离和纯化未反应的胰岛素、未反应的免疫球蛋白fc区、胰岛素-peg-免疫球蛋白fc区复合物和与两个或更多个单-peg化胰岛素(胰岛素-peg)部分偶联的免疫球蛋白fc区。通过色谱法纯化后，在280nm的uv吸光度下测定胰岛素-peg-免疫球蛋白fc区复合物的产率。表2中，根据胰岛素peg化中用作为还原剂的硼烷吡啶复合物的条件，总结了与免疫球蛋白fc区偶联反应的产率。【表2】实施例5：根据氰基硼氢化钠的浓度和反应时间，偶联反应的产率和免疫球蛋白fc异常的形成根据偶联反应中还原剂的浓度和反应时间，为了检测免疫球蛋白fc异常的形成，使单-peg化胰岛素与免疫球蛋白fc以摩尔比1:1在25℃下反应13至43小时，总蛋白质浓度设置为20mg/ml。该偶联反应在5至40mm氰基硼氢化钠的存在下，在100mmhepes缓冲液(含22mm磷酸钾和10％乙醇，ph8.2)中进行。将反应混合物装载到source15q(gehealthcare)柱上，然后用tris-hcl(ph7.5)缓冲液洗脱并使用nacl的浓度梯度分离和纯化未反应的胰岛素、未反应的免疫球蛋白fc区、胰岛素-peg-免疫球蛋白fc区复合物和与两个或更多个单-peg化胰岛素(胰岛素-peg)部分结合的免疫球蛋白fc区。通过色谱法纯化后，在280nm的uv吸光度下测定胰岛素-peg-免疫球蛋白fc区复合物的产率。表3中，根据偶联反应中用作还原剂的氰基硼氢化钠的浓度和反应时间，总结了用来制备含胰岛素和免疫球蛋白fc区复合物的偶联反应的产率。【表3】反应时间5mmscb20mmscb40mmscb13小时35.2％37.5％37.5％18小时36.1％37.7％37.7％37小时36.7％37.3％37.5％43小时36.8％37.2％36.8％通过propacsax-10(di一种x)柱上的lc以tris-hcl(ph8.0)缓冲液洗脱并使用nacl的浓度梯度，根据偶联反应中还原剂的浓度，监测免疫球蛋白fc异常的形成。表4中，根据用来制备含胰岛素和免疫球蛋白fc区复合物的偶联反应中氰基硼氢化钠的浓度和反应时间，给出了免疫球蛋白fc异常的产率。【表4】反应时间5mmscb20mmscb40mmscb13小时4.6％7.0％7.8％18小时6.2％9.0％9.8％37小时11.7％14.5％15.3％43小时12.7％15.5％16.8％实施例6：使用氰基硼氢化钠作为还原剂的免疫球蛋白区fc的peg化和单-peg化免疫球蛋白fc的纯化用5k丙-ald2peg(具有三个丙醛基的peg，nof，日本)将免疫球蛋白fc的n-末端进行peg化。在此时，使10mg/ml免疫球蛋白fc与peg以摩尔比1:2在4℃至室温下反应4.5小时。该反应在20mm氰基硼氢化钠作为还原剂的存在下，在100mm磷酸钾缓冲液(ph6.0)中进行。将反应混合物装载到source15q(gehealthcare)柱上，然后用tris-hcl(ph7.5)缓冲液洗脱并使用nacl的浓度梯度以纯化单-peg化胰岛素。实施例7：使用氰基硼氢化钠作为还原剂的单-peg化免疫球蛋白fc区-胰岛素复合物的制备为了制备胰岛素-peg-免疫球蛋白fc区复合物，使实施例6中制备的单-peg化免疫球蛋白fc与胰岛素以摩尔比1:4在4℃下反应13小时，总蛋白质浓度设置为20mg/ml。该偶联反应在20mm氰基硼氢化钠作为还原剂的存在下，在100mm磷酸钾缓冲液(ph6.0)中进行。将反应混合物装载到source15q(gehealthcare)柱上用于初次纯化。并且用source15iso(gehealthcare)柱另外进行二次纯化，以获得胰岛素-peg-免疫球蛋fc区复合物。序列表<110>韩美科学株式会社<120>制备生理活性多肽复合物的改进方法<130>opa13018<150>kr10-2012-0024136<151>2012-03-08<160>2<170>kopatentin1.71<210>1<211>21<212>prt<213>智人（homosapiens）<400>1glyilevalgluglncyscysthrserilecysserleutyrglnleu151015gluasntyrcysasn20<210>2<211>30<212>prt<213>智人<400>2phevalasnglnhisleucysglyserhisleuvalglualaleutyr151015leuvalcysglygluargglyphephetyrthrprolysthr202530当前第1页12