LRKK2的野生型及突变型的降解剂的制作方法
相关申请
本申请请求2018年10月16日提出申请的美国临时申请第62/746,283号及2019年8月8日提出申请的美国临时申请第62/884,410号的根据u.s.c.§119(e)的优先权效益，该申请全部内容并入本文作为参考。
背景技术：
帕金森氏症(pd)为一种多巴胺生产神经元的渐行性丧失引起的动作障碍。此为世界上第二常见的神经退化疾病，且影响超过一百万的美国人。每年有超过60000位新确诊的患者(gandhi等人,j.neurosci.res.87:1283-1295(2009),
就有关pd的基因而言，于家族性和偶发性的pd病例中经常发现具有错义突变(missensemutation)的富含亮氨酸的重复激酶2(leucine-richrepeatkinase2，lrrk2)，g2019s(healy等人,lancetneurol.7:583-590(2008),
技术实现要素：
本发明的第一实施例为一种双官能化合物(本文中亦指“降解剂”或“protac”)，具有下式(i)所示的结构：
其中，所述靶向配体代表与富含亮氨酸的重复激酶2(lrrk2)结合的氨基嘧啶或吲唑，所述降解决定子(degron)代表与e3泛素连接酶(ubiquitinligase)结合的配体，所述连接子代表与所述降解决定子及靶向配体共价连接的部分，或其药学上可接受的盐或立体异构体。
本发明的第二实施例为一种药物组合物，含有治疗有效量的式(i)的化合物，或其药学上可接受的盐或立体异构体，以及药学上可接受的载体。
本发明的进一步实施例为一种由异常的(例如，失调的或功能障碍的)lrrk2活性介导的疾病或病症的治疗方法，包括向有此需要的个体投予治疗有效量的式(i)的双官能化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体。于一些具体实施例中，本发明的化合物用于治疗神经退化疾病，例如，帕金森氏症及脑癌(例如，胶质细胞瘤及多形性胶质母细胞瘤)。
本发明的进一步实施例为一种制备所述双官能化合物的方法。
不欲受限于任何操作的特定理论，所述式(i)的双官能化合物据信可通过细胞的泛素/蛋白酶体(proteasome)系统降解与疾病的发生和/或进程有关的lrrk2，其功能是例行识别和清除受损的蛋白质。所述降解官能部分募集e3泛素连接酶以标记lrrk2(其通过靶向配体功能所结合)以通过所述蛋白酶体进行泛素化和降解，此为一个可将泛素化的蛋白质降解为小的肽片段的大型内源性复合物。于lrrk2分子的破坏后，释放所述降解剂且其继续保持活性。因此，通过运用和利用人体自身的天然蛋白质处理系统，于已经证明或可能证明为难以治疗的疾病或病症的治疗中，式(i)的双官能化合物可能代表相较于lrrk2的传统小分子抑制剂的潜在改进。
相较于现有的lrrk2抑制剂，lrrk2降解剂可能提供多种额外的优点。举例而言，考虑数据表明降解剂以催化方式作用(即，单个降解剂分子可诱导多种靶向蛋白的降解)，降解剂的有效细胞内浓度可能显着低于常规激酶拮抗剂。此外，因降解剂会造成蛋白酶体完全清除蛋白质，降解剂的药效动力学效应取决于蛋白质再合成速率，类似于共价抑制剂所观察的。又。激酶的降解解决激酶固有的“支架”功能所赋予的tki(酪氨酸激酶抑制剂)的抗性。更进一步，考虑到即使是较低亲和力的弹头(warhead)也可以实现有效的降解，lrrk2选择性降解子的原发突变抗性不太可能出现。因此，式(i)的双官能化合物可能具有代表相对于现有lrrk2靶向小分子抑制剂的重大进步并克服一些其最重要的限制的潜力。
附图说明
图1为示出lrrk2(c-末端)和lrrk2(n-末端)的细胞内降解作用以及于时程实验中使用0nm至1000nm的本发明化合物1对s935和rab10磷酸化抑制作用的蛋白质印迹。
图2为示出lrrk2(c-末端)和lrrk2(n-末端)的细胞内降解作用以及于时程实验中使用0nm至1000nm的本发明化合物2对s935和rab10磷酸化抑制作用的蛋白质印迹。
图3a为示出lrrk2(c-末端)和lrrk2(n-末端)的细胞内降解作用以及于时程实验中使用0nm至1000nm的本发明化合物3对s935和rab10磷酸化抑制作用的蛋白质印迹。
图3b为示出lrrk2(c-末端)和lrrk2(n-末端)的降解作用以及于时程实验中于rc1441c纯合子细胞(homozygouscell)中使用0nm至1000nm的本发明化合物3对s935和rab10磷酸化抑制作用的蛋白质印迹。
图4为示出lrrk2(c-末端)和lrrk2(n-末端)的降解作用以及于时程实验中使用0nm至1000nm的本发明化合物4对s935和rab10磷酸化抑制作用的蛋白质印迹。
图5为示出lrrk2(c-末端)和lrrk2(n-末端)的降解作用以及于时程实验中使用0nm至1000nm的本发明化合物5对s935和rab10磷酸化抑制作用的蛋白质印迹。
图6为示出lrrk2(c-末端)和lrrk2(n-末端)的降解作用以及于时程实验中使用0nm至1000nm的本发明化合物6对s935和rab10磷酸化抑制作用的蛋白质印迹。
图7为示出lrrk2(c-末端)和lrrk2(n-末端)的降解作用以及于时程实验中使用0nm至1000nm的本发明化合物7对s935和rab10磷酸化抑制作用的蛋白质印迹。
图8为显示来那度胺(lenalidomide)、泊马利度胺(pomalidomide)和基于本发明化合物的mli-2于不同浓度下的细胞内crbn结合的图。
图9a为示出于时程实验中使用0nm至1000nm的mli-2类似物5-(1-甲基环丙基)氧基-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-4-基]-1h-吲唑的lrrk2总降解作用及s935磷酸化抑制作用的蛋白质印迹。
图9b为显示于时程实验中使用0nm至1000nm的mli-2类似物5-(1-甲基环丙基)氧基-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-4-基]-1h-吲唑的lrrk2的抑制作用的图。
图9c为显示于时程实验中使用0nm至1000nm的mli-2类似物5-(1-甲基环丙基)氧基-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-4-基]-1h-吲唑的ps935的抑制作用的图。
图10a为示出于时程实验中使用0nm至1000nm的本发明化合物8的lrrk2总降解作用及s935磷酸化抑制作用的蛋白质印迹。
图10b为显示于时程实验中使用0nm至1000nm的本发明化合物8的lrrk2的抑制作用的图。
图10c为显示于时程实验中使用0nm至1000nm的本发明化合物8的s935磷酸化抑制作用的图。
图11a为示出于时程实验中使用0nm至1000nm的本发明化合物9的lrrk2总降解作用及s935磷酸化抑制作用的蛋白质印迹。
图11b为显示于时程实验中使用0nm至1000nm的本发明化合物9的lrrk2的抑制作用的图。
图11c为显示于时程实验中使用0nm至1000nm的本发明化合物9的s935磷酸化抑制作用的图。
图12a为示出于时程实验中使用0nm至1000nm的本发明化合物10的lrrk2总降解作用及s935磷酸化抑制作用的蛋白质印迹。
图12b为显示于时程实验中使用0nm至1000nm的本发明化合物10的lrrk2的抑制作用的图。
图12c为显示于时程实验中使用0nm至1000nm的本发明化合物10的s935磷酸化抑制作用的图。
图13a为示出于时程实验中使用0nm至1000nm的本发明化合物11的lrrk2总降解作用及s935磷酸化抑制作用的蛋白质印迹。
图13b为显示于时程实验中使用0nm至1000nm的本发明化合物11的lrrk2的抑制作用的图。
图13c为显示于时程实验中使用0nm至1000nm的本发明化合物11的s935磷酸化抑制作用的图。
图14a为示出于时程实验中使用0nm至1000nm的本发明化合物12的lrrk2总降解作用及s935磷酸化抑制作用的蛋白质印迹。
图14b为显示于时程实验中使用0nm至1000nm的本发明化合物12的lrrk2的抑制作用的图。
图14c为显示于时程实验中使用0nm至1000nm的本发明化合物12的s935磷酸化抑制作用的图。
图15a为示出于时程实验中使用0nm至1000nm的本发明化合物13的lrrk2总降解作用及s935磷酸化抑制作用的蛋白质印迹。
图15b为显示于时程实验中使用0nm至1000nm的本发明化合物13的lrrk2的抑制作用的图。
图15c为显示于时程实验中使用0nm至1000nm的本发明化合物13的s935磷酸化抑制作用的图。
图16a为示出于时程实验中使用0nm至1000nm的本发明化合物14的lrrk2总降解作用及s935磷酸化抑制作用的蛋白质印迹。
图16b为显示于时程实验中使用0nm至1000nm的本发明化合物14的lrrk2的抑制作用的图。
图16c为显示于时程实验中使用0nm至1000nm的本发明化合物14的s935磷酸化抑制作用的图。
图16d为显示于时程实验中使用0nm至1000nm的本发明化合物14的rab(e8261)磷酸化抑制作用的图。
图17a为示出于时程实验中使用0nm至1000nm的本发明化合物15的lrrk2总降解作用及s935磷酸化抑制作用的蛋白质印迹。
图17b为显示于时程实验中使用0nm至1000nm的本发明化合物15的lrrk2的抑制作用的图。
图17c为显示于时程实验中使用0nm至1000nm的本发明化合物15的s935磷酸化抑制作用的图。
图17d为显示于时程实验中使用0nm至1000nm的本发明化合物15的rab(e8261)磷酸化抑制作用的图。
图18a为示出使用已知的mli-2类似物5-(1-甲基环丙基)氧基-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-4-基]-1h-吲唑、本发明化合物8、本发明化合物16(阴性对照组)及阴性对照组dmso48小时之后，lrrk2总降解作用及s935和rab(e8261)磷酸化的抑制作用的一组蛋白质印迹。
图18b为显示使用mli-2类似物5-(1-甲基环丙基)氧基-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-4-基]-1h-吲唑、本发明化合物8、阴性对照组16及阴性对照组dmso48小时之后的lrrk2(udd3)降解作用的图。
图18c为显示使用mli-2类似物5-(1-甲基环丙基)氧基-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-4-基]-1h-吲唑、本发明化合物8、阴性对照组16及阴性对照组dmso48小时之后的s935磷酸化抑制作用的图。
图18d为显示使用mli-2类似物5-(1-甲基环丙基)氧基-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-4-基]-1h-吲唑、本发明化合物8、阴性对照组16及阴性对照组dmso48小时之后的rab磷酸化抑制作用的图。
具体实施方式
详细说明
除非另行界定，否则本文使用的所有技术与科学术语具有熟习本文主题所属技艺者通常理解的相同含义。如于说明书与随附申请专利范围所使用，除非有相反的说明，否则以下术语具有所指示的含义，以促进对本发明的理解。
如说明书与随附申请专利范围中所使用，除非上下文另行明确指出，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该”包括复数对象。因此，例如，提及“组合物”则包括两种或两种以上这些组合物的混合物，提及“抑制剂”则包括两种以上这些抑制剂的混合物等。
除非另例说明，否则“约”术语意指经术语“约”修饰的10％以内(例如，于5％，2％或1％以内)的特定值。
过渡术语“包含”，与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，是包括性或开放性，且不排除其他未引用的要素或方法步骤。对照的下，过渡片语“由……组成排除申请专利范围中未指定的任何元素、步骤或成分。过渡性片语“实质上由……组成”将申请专利范围限制于指定的材料或步骤“以及实质上不影响要求保护的发明的基本与新颖特征者”。
关于本发明化合物，于本文中使用下述术语进行进一步叙述的范围内，适用以下定义。
本文所用的术语“烷基”是指饱和的直链或支链单价烃基团。于一具体实施例中，所述烷基基团为c1至c18基团。于其它具体实施例中，所述烷基团为c0至c6、c0至c5、c0至c3、c1至c12、c1至c8、c1至c6、c1至c5、c1至c4或c1至c3基团(其中，c0烷基是指键结)。烷基团的实例包括甲基、乙基、1-丙基、2-丙基、i-丙基、1-丁基、2-甲基-1-丙基、2-丁基、2-甲基-2-丙基、1-戊基、n-戊基、2-戊基、3-戊基、2-甲基-2-丁基、3-甲基-2-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-1-丁基、1-已基、2-已基、3-已基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、3-甲基-3-戊基、2-甲基-3-戊基、2,3-二甲基-2-丁基、3,3-二甲基-2-丁基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一基与十二基。于一些具体实施例中，烷基基团为c1至c3烷基基团。于一些具体实施例中，烷基为c1至c2烷基基团。
本文所用的术语“亚烷基”是指将分子的其余部分连接至基团的直链或支链二价烃链，仅由碳和氢组成，不含不饱和且具有1至12个碳原子，例如，亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚n-丁基等。所述亚烷基链可通过单键连接于分子其余部分并通过单键连接于基团。于一些具体实施例中，所述亚烷基含有1至8个碳原子(c1至c8亚烷基)。于其它具体实施例中，所述亚烷基含有1至5个碳原子(c1至c5亚烷基)。于其它具体实施例中，所述亚烷基含有1至4个碳原子(c1至c4亚烷基)。于其它具体实施例中，所述亚烷基含有1至3个碳原子(c1至c3亚烷基)。于其它具体实施例中，所述亚烷基含有一至两个碳原子(c1至c2亚烷基)。于其它具体实施例中，所述亚烷基含有一个碳原子(c1亚烷基)。
本文所用的术语“卤烷基”是指经一或多个(例如，1、2、3或4)卤素基团取代的如本文所定义的烷基基团。
本文所用的术语“烯基”是指具有至少一个碳-碳双键的直链或支链单价烃基。烯基包含具有“顺式”与“反式”取向，或替代地，“e”与“z”取向的基团。于一实例中，所述烯基基团为c2至c18基团。于其它具体实施例中，所述烯基为c2至c12、c2至c10、c2至c8、c2至c6或c2至c3基团。实例包括乙烯基(ethenyl)或乙烯基(vinyl)、丙-1-烯基、丙-2-烯基、2-甲基丙-1-烯基、丁-1-烯基、丁-2-烯基、丁-3-烯基、丁-1,3-二烯基、2-甲基丁-1,3-二烯、己-1-烯基、己-2-烯基、己-3-烯基、己-4-烯基及己-1,3-二烯基。
本文所用的术语“炔基"是指具有至少一个碳-碳三键的直链或支链单价烃基。于一实例中，所述炔基基团为c2至c18基团。于其它实例中，所述炔基基团为c2至c12、c2至c10、c2至c8、c2至c6或c2至c3。实例包括乙炔基、丙-1-炔基、丙-2-炔基、丁-1-炔基、丁-2-炔基及丁-3-炔基。
本文所用的术语“烷氧基”是指其连接有氧基的如上述定义的烷基基团。代表性烷氧基基团包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、叔丁氧基等等。“醚”是由氧共价连接的两个烃，因此，烷基的取代基使此烷基为醚或类似烷氧基，例如可由-o-烷基、-o-烯基及-o-炔基的一者所表示。
本文所用的术语“卤素”(或“卤基”或“卤化物”)是指氟、氯、溴或碘。
本文所用的术语“环状基团”是广义上指单独或作为较大分子的一部分所使用的任何基团，其含有饱和、部分饱和或芳族环系统，例如，碳环(环烷基、环烯基)、杂环(杂环烷基、杂环烯基)、芳基和杂芳基基团。环状基团可具有一或多个(例如，稠合)环系统。因此，举例而言，环状基团可含有一或多个碳环、杂环、芳基或杂芳基基团。
本文所用的术语“碳环的”(亦称为“碳环基”)是指单独使用或为较大分子的一部分所使用的基团，其含有具3至20个碳原子的饱和、部分不饱和或芳香环，其为单独或较大分子的一部分(例如，碳环基团)。术语碳环基包含单环、双环、三环、稠合环、桥接环和螺环系统及其组合。于一具体实施例中，碳环基包含3至15个碳原子(c3至c15)。于一具体实施例中，碳环基包含3至12个碳原子(c3至c12)。于另一具体实施例中，碳环基包含c3至c8、c3至c10或c5至c10。于另一具体实施例中，为单环的碳环基包含c3至c8、c3至c6或c5至c6。于一些具体实施例中，为双环的碳环基包含c7至c12。于另一具体实施例中，为螺环的碳环基包含c5-c12。单环碳环的代表性实例包括环丙基、环丁基、环戊基、1-环戊-1-烯基、1-环戊-2-烯基、1-环戊-3-烯基、环已基、全氘代环已基、1-环己-1-烯基、1-环己-2-烯基、1-环己-3-烯基、环已二烯基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基、环十一基、苯基与环十二基；具有7至12个环原子的双环碳环基包括[4,3]、[4,4]、[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]环的，例如双环[2.2.1]庚烷、双环[2.2.2]辛烷、萘、与双环[3.2.2]壬烷。螺碳环基的表示性实例包括螺[2.2]戊烷、螺[2.3]已烷、螺[2.4]庚烷、螺[2.5]辛烷与螺[4.5]癸烷。术语碳环基包含如本文定义的芳香环系统。术语碳环基亦包括环烷基环(例如，饱和或部分不饱和的单、双或螺碳环)。术语碳环基亦包括与一或多个(例如，1、2或3)不同的环状基团(例如，芳基或杂环)稠合的碳环，其中，连接的基团或点于所述碳环上。
因此，术语碳环亦包括碳环基烷基基团，其于本文中所用是指式--rc-碳环基的基团，其中，rc为亚烷基链。术语碳环亦包括碳环基烷氧基基团，其于本文中所用是指通过式--o--rc-碳环基(其中，rc为亚烷基链)的氧原子键结的基团，其中，rc为亚烷基链。
本文所用的术语“杂环基”是指单独或作为较大分子的一部分所使用的“碳环基”，其含有饱和、部分不饱和或芳香环系统，其中，一或多个(例如，1、2、3或4)碳原子经杂原子所取代(例如，o、n、n(o)、s、s(o)、或s(o)2)。术语杂环基包含单环、双环、三环、稠环、桥环、和螺环系统及其组合。于一些具体实施例中，杂环基是指3至15元杂环基环系统。于一些具体实施例中，杂环基是指3至12元杂环基环系统。于一些具体实施例中，杂环基是指饱和环系统，例如3至12元饱和杂环基环系统。于一些具体实施例中，杂环基是指杂芳基环系统，例如5至14元杂芳基环系统。术语杂环基亦包含c3-c8杂环烷基，其为饱和或部分不饱和的单环、双环或者螺环系统，其含有3至8个碳和一或多个(1、2、3或4)杂原子。
于一些具体实施例中，杂环基团包含3至12个环原子及包含单环、双环、三环及螺环的环系统，其中，所述环原子为碳，且1至5个环原子为例如氮、硫或氧的杂原子。于一些具体实施例中，杂环基包含具有一或多个选自氮、硫或氧的杂原子的3-至7-元的单环。于一些具体实施例中，杂环基包含具有一或多个选自氮、硫或氧的杂原子的4-至6-元单环。于一些具体实施例中，杂环基包含3元单环。于一些具体实施例中，杂环基包含4元单环。于一些具体实施例中，杂环基包5至6元单环。于一些具体实施例中，所述杂环基包含0至3个双键。于任何上述具体实施例中，杂环基包含1、2、3或4个杂原子。任何氮或硫杂原子可任选经氧化(例如，no、so、so2)，且任何氮杂原子可任选经季铵化(例如，[nr4]+cl-、[nr4]+oh-)。杂环基的代表性实例包括环氧乙烷基、氮丙啶基(aziridinyl)、噻喃基(thiiranyl)、氮杂环丁烷基(azetidinyl)、氧杂环丁烷基(oxetanyl)、硫杂环丁烷基(thietanyl)、1,2-二硫杂环丁烷基、1,3-二硫杂环丁烷基、吡咯啶基(pyrrolidinyl)、二氢-1h-吡咯基、二氢呋喃基、四氢吡喃基、二氢噻吩基、四氢噻吩基、咪唑啶基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、1,1-二氧代硫代吗啉基、二氢吡喃基、四氢吡喃基、六氢硫代吡喃基、六氢嘧啶基、氧杂嗪基(oxazinanyl)、噻嗪基(thiazinanyl)、氧硫杂环己基(thioxanyl)、高哌嗪基、高哌啶基、氮杂环庚烷基(azepanyl)、氧杂环庚烷基(oxepanyl)、硫杂环庚烷基(thiepanyl)、氧氮杂环庚三烯基(oxazepinyl)、氧氮杂环庚烷基(oxazepanyl)、二氮杂环庚烷基、1,4-二氮杂环庚烷基、二氮杂卓基、硫氮杂环庚三烯基(thiazepinyl)、硫氮杂环庚烷基、四氢硫代吡喃基、恶唑烷基、噻唑烷基(thiazolidinyl)、异噻唑烷基、1,1-二氧代噻唑烷酮基、恶唑烷酮基、咪唑啉酮基、4,5,6,7-四氢[2h]吲唑基、四氢苯并咪唑基、4,5,6,7-四氢苯并[d]咪唑基、1,6-二氢咪唑[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶基、噻嗪基、恶嗪基、噻二嗪基、恶二嗪基、二噻嗪基、二恶嗪基、恶噻嗪基、噻三嗪基、氧杂三嗪基、二噻二嗪基、咪唑啉基、二氢嘧啶基、四氢嘧啶基、1-吡咯啉基、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、吲哚啉基、噻喃基、2h-吡喃基、4h-吡喃基、二恶烷基、1,3-二恶戊基、吡唑啉基、吡唑烷基、二噻吩基、二硫杂环戊烷、嘧啶二酰基、嘧啶二酮基、嘧啶-2,4-二硫基、哌嗪酮基、哌嗪二酮基、吡唑烷基亚氨基、咪唑啉基、3-氮杂双环[3.1.0]己基、3,6-二氮杂双环[3.1.1]庚基、6-氮杂双环[3.1.1]庚基、3-氮杂双环[3.1.1]庚基、3-氮杂双环[4.1.0]庚基、氮杂双环[2.2.2]己基、2-氮杂双环[3.2.1]辛基、8-氮杂双环[3.2.1]辛基、2-氮杂双环[2.2.2]辛基、8-氮杂双环[2.2.2]辛基、7-氧杂双环[2.2.1]庚烷、氮杂螺[3.5]壬基、氮杂螺[2.5]辛基、氮杂螺[4.5]癸基、1-氮杂螺[4.5]癸-2-酮基、氮杂螺[5.5]十一烷基、四氢吲哚基、八氢吲哚基、四氢异吲哚基、四氢吲唑基、1,1-二氧六氢硫代吡喃基。含有硫或氧原子及1至3个氮原子的5元杂环基的实例为噻唑基，包括噻唑-2-基和噻唑-2-基n-氧化物；噻二唑基，包括1,3,4-噻二唑-5-基和1,2,4-噻二唑-5-基、恶唑基(例如恶唑-2-基)和恶二唑基(例如1,3,4-恶二唑-5-基)和1,2,4-恶二唑-5基。含有2至4个氮原子的5元环杂基实例包括咪唑基，例如咪唑-2-基；三唑基，例如1,3,4-三唑-5-基；1,2,3-三唑-5-基、1,2,4-三唑-5-基和四唑基，例如1h-四唑-5-基。苯并稠合5元杂环基的表示性实例为苯并恶唑-2-基、苯并噻唑-2-基和苯并咪唑-2-基。含有1至3个氮原子和任选的硫或氧原子的6元杂环基的实例例如吡啶基、吡啶-2-基、吡啶-3-基和吡啶-4-基；嘧啶基，例如嘧啶-2-基和嘧啶-4-基；三嗪基，例如1,3,4-三嗪-2-基和1,3,5-三嗪-4-基；哒嗪基(pyridazinyl)，尤其是哒嗪-3-基和吡嗪基。吡啶n-氧化物和哒嗪n-氧化物以及吡啶基、嘧啶-2-基、嘧啶-4-基、哒嗪基和1,3,4-三嗪-2-基为杂环基的其它实例。于一些具体实施例中，杂环基团包括与一或多个(例如1、2或3)不同环状基团(例如碳环或杂环)稠合的杂环，其中，连接的基团或点在杂环上，且于一些具体实施例中，其中，连接的点为杂环中所含的杂原子。
因此，术语杂环涵盖的n-杂环基于本文所用是指含有至少一个氮的杂环基，且其与分子其余部分所连接的点为通过杂环基中的氮原子。n-杂环基的代表性实例包括1-吗啉基、1-哌啶基、1-哌嗪基、1-吡咯啶基、1-吡咯烷基、吡唑烷基、咪唑啉基和咪唑烷基。如本文所用的术语杂环亦涵盖c-杂环基团，是指含有至少一个杂原子的杂环基团，其与分子其余部分所连接的点为通过杂环基中的碳原子。c-杂环基的代表性实例包括2-吗啉基、2-或3-或4-哌啶基、2-哌嗪基和2-或3-吡咯啶基。术语杂环亦涵盖杂环基烷基，其如上文所揭示是指式--rc-杂环基团，其中，rc为亚烷基链。术语杂环亦涵盖杂环基烷氧基，其如本文所用是指经由式--o--rc-杂环基的氧原子结合的基团，其中，rc为亚烷基链。
如本文所用，单独或作为较大分子的一部分所使用的术语“芳基”(例如，“芳烷基”，其中，所述烷基基团上的末端碳原子为连接的点，例如，苄基基团)，其中，氧原子为连接的点的“芳烷氧基”或“芳氧基烷基”，其中，连接的点于芳基上)是指包含单环、双环或三环的碳环系统，其包含稠合环，其中，所述系统中的至少一个环为芳香族。于一些具体实施例中，所述芳烷氧基为苯氧基。术语“芳基”可与术语“芳基环”互换使用。于一具体实施例中，芳基包括具有6至18个碳原子的基团。于另一具体实施例中，芳基包括具有6至10个碳原子的基团。芳基的实例包括苯基、萘基、蒽基、联苯基、菲基、萘基、1,2,3,4-四氢萘基、1h-茚基、2,3-二氢-1h-茚基等，其可为经取代或单独地经一或多个本文所述的取代基取代。特定的芳基为苯基。于一些具体实施例中，芳基包含稠合至一或多个(例如，1、2或3)不同环状基团(例如，碳环或杂环)的芳基环，其中，连接的基团或点在所述芳基环上。
因此，术语芳基涵盖芳烷基基团(例如，苄基)，其如上文所揭示，是指具式--rc-芳基的基团，其中，rc为亚烷基链，例如亚甲基或亚乙基。于一些具体实施例中，所述芳烷基为任选经取代的苄基基团。术语芳基亦涵盖如本文所用的芳烷氧基，是指通过式--o—rc--芳基的氧原子结合的基团，其中，rc为亚烷基链，例如亚甲基或亚乙基。
本文所用的术语“杂芳基”单独或作为较大分子的一部分所使用(例如，“杂芳基烷基”(亦为“杂芳烷基”)或“杂芳基烷氧基“(亦为“杂芳烷氧基”)，是指具有5至14个环原子的单环、双环或三环系统，其中，至少一个环为芳族且含有至少一个杂原子。于一具体实施例中，杂芳基包含4至6元单环芳族基团，其中，一或多个环原子为独立地任选经取代的氮、硫或氧。于另一具体实施例中，杂芳基包括5至6元单环芳族基团，其中，一或多个环原子为氮、硫或氧。代表性的杂芳基实例包括噻吩基、呋喃基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、异噻唑基、恶唑基、异恶唑基、三唑基、噻二唑基、恶二唑基、四唑基、噻三唑基、氧杂三唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三嗪基、四嗪基、四唑并[1,5-b]哒嗪基、嘌呤基、苯并恶唑基、苯并呋喃基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并三唑基、苯并咪唑基、吲哚基、1,3-噻唑-2-基、1,3,4-三唑-5-基、1,3-恶唑-2-基、1,3,4-恶二唑-5-基、1,2,4-恶二唑-5-基、1,3,4-噻二唑-5-基、1h-四唑-5-基、1,2,3-三唑-5-基和吡啶-2-基n-氧化物。术语"杂芳基"亦包含其中杂芳基稠合于一或多个环状(例如，碳环基或杂环基)环的基团，其中，连接的基团或点在杂芳基环上。非限制性实例包括吲哚基、异吲哚基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、二苯并呋喃基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹恶啉基、4h-喹嗪基、咔唑基、吖啶基、啡嗪基、啡噻嗪基、啡恶嗪基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基与吡啶并[2,3-b]-1,4-恶嗪-3(4h)-酮。杂芳基基团可为单环、双环或三环。于一些具体实施例中，杂芳基基团包含稠合至一或多个(例如，1、2或3)不同环状基团(例如碳环或杂环)的杂芳基环，其中，连接的基团或点在杂芳基环上，且于一些具体实施例中，其中，连接的点为杂环中所含的杂原子。
因此，术语杂芳基涵盖如本文所用的n-杂芳基，其是指含有至少一个氮的如上文定义的杂芳基，其中，杂芳基与分子其余部分连接的点为通过杂芳基中的氮原子。术语杂芳基亦涵盖如本文所用的c-杂芳基，其是指如上文定义的杂芳基，其中，杂芳基与分子其余部分连接的点为通过杂芳基中的碳原子。术语杂芳基亦涵盖如上文揭示的杂芳基烷基，其是指式--rc-杂芳基的基团，其中，rc为如上文定义的亚烷基链。术语杂芳基亦涵盖如本文所用的杂芳烷氧基(或杂芳基烷氧基)基团，其是指通过式--o--rc-杂芳基的氧原子键结的基团，其中，rc为如上文定义的亚烷基团。
本文所述的任何基团可为经取代或未经取代。本文所用的术语“经取代”广义上是指所有允许的取代基，隐含的条件为这种取代基是根据经取代的原子与取代基所允许价数，且所述取代产生稳定的化合物，即不会自然进行例如重排、环化、删除等转化的化合物。代表性取代基包括卤素、羟基基团及含有任何碳原子数，例如，1至个14碳原子的任何其它有机基团，且其可包含一或多个(例如，1、2、3、或4)杂原子，例如以直链、支链或环状结构形式聚集的氧、硫和氮。
取代基的代表性实例可因此包括烷基、经取代的烷基、烷氧基、经取代的烷氧基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、环状基、经取代的环状基、碳环基、经取代的碳环基、杂环基、经取代的杂环基、芳基(例如，苄基和苯基)、经取代的芳基(例如，经取代的苄基或苯基)、杂芳基、经取代的杂芳基、芳烷基、经取代的芳烷基、卤基、羟基、芳氧基、经取代的芳氧基、烷硫基、经取代烷硫基、芳硫基、经取代的芳硫基、氰基、羰基、经取代的羰基、羧基、经取代的羧基、氨基、经取代的氨基、酰氨基、经取代的酰氨基、磺酰基、经取代的磺酰基、氨基酸和肽基。
与所述靶向配体和lrrk2之间的相互作用有关的术语“结合”是指分子间相互作用，其足以实现lrrk2的募集以接近e3连接酶并随后降解lrrk2。键结亦可为实质上选择性的，因靶向配体与细胞中存在的其它蛋白质实体的结合在功能上是无关紧要的。
与所述降解决定子与e3泛素连接酶之间的相互作用有关的术语“结合”一般是指分子间相互作用，其可能具有或可能不具有等于或超过靶向配体和靶蛋白之间的亲和力水平的亲和力水平，但无论如何，其中，亲和力足以实现连接酶募集至目标降解和选择性降解靶蛋白的数量。
广义上，本发明的双官能化合物具有以式(i)表示的结构：
其中，所述靶向配体代表与富含亮氨酸的重复激酶2(lrrk2)结合的氨基嘧啶或吲唑，所述降解决定子(degron)代表与e3泛素连接酶(ubiquitinligase)结合的配体，所述连接子代表与所述降解决定子及靶向配体共价连接的部分，或其药学上可接受的盐或立体异构体。
于一些具体实施例中，所述靶向配体为氨基嘧啶，且具有下式中任一者表示的结构：
其它可用作本发明的双官能化合物中的靶向配体的氨基嘧啶类似物描述于美国第8,802,647号专利中。
因此，于一些具体实施例中，本发明的化合物具有式(i-1a)或(i-1b)表示的结构：
或
或其药学上可接受的盐或立体异构体。
于一些具体实施例中，所述靶向为吲唑，且其具有式tl2-a表示的结构：
其它可用作本发明的双官能化合物中的靶向配体的吲唑描述于美国第2016/0009689a1号专利申请案中。
因此，于一些具体实施例中，本发明的化合物具有式i-2a表示的结构：
或其药学上可接受的盐或立体异构体。
于一些具体实施例中，所述靶向配体具有式tl2-b表示的结构：
其中：
x表示n、cr5或cr6；其中，r5表示
或表示h，其中，星号(*)表示连接至所述杂环的点，且弯曲的线条表示连接至
r6表示h、卤基(例如，f或cl)或cf3；
r1表示
或表示h；
r2表示
r3表示h、卤基(例如，f或cl)、cf3，或其中，r3表示cr6，r2表示nh且与其所结合的原子一起形成经r6取代的吡咯基团；
r4表示h、
于一些具体实施例中，其中，x表示n且r4为h，所述靶向配体具有式tl2-b1表示的结构：
其中：
r2表示
r3表示h、卤基(例如，f或cl)或cf3。
于一些具体实施例中，其中，x表示n且r2为nh，r3表示cr6，并与其所结合的原子一起形成经r6取代的吡咯基团，所述靶向配体具有式tl2-b2表示的结构：
于一些具体实施例中，其中，x表示cr5，其中，r5为h，r2表示nh，r3表示cr6，并与其所结合的原子一起形成经r6取代的吡咯基团，所述靶向配体具有式tl2-b3表示的结构：
于一些具体实施例中，其中，r1为不存在(其亦意指r1表示h)，x表示cr5，且r2表示nh，r3表示cr6，并与其所结合的原子一起形成经r6取代的吡咯基团，所述靶向配体具有式tl2-b4表示的结构：
于一些具体实施例中，其中，x表示cr6，其中，r6表示h、卤基或cf3，r1为不存在(其亦意指r1表示h)，r2表示nh，r3表示cr5，并与其所结合的原子一起形成经r6取代的吡咯基团，所述靶向配体具有式tl2-b5表示的结构：
因此，于一些具体实施例中，本发明的化合物以所述靶向配体tl2-b(包括tl2-b1至tl2-b5以及
连接子
所述连接子(“l”)提供所述lrrk2靶向配体至所述降解决定子的共价连接。连接子的结构可能非关键的，只要其实质上不干扰靶向配体或降解决定子的活性即可。
于一些具体实施例中，所述连接子可为亚烷基链或二价亚烷基链，至少其中一个可经–o–、–s–、–n(r')–、–c≡c–、–c(o)–、–c(o)o–、–oc(o)–、–oc(o)o–、–c(nor')–、–c(o)n(r')–、–c(o)n(r')c(o)–、–c(o)n(r')c(o)n(r')–、–n(r')c(o)–、–n(r')c(o)n(r')–、–n(r')c(o)o–、–oc(o)n(r')–、–c(nr')–、–n(r')c(nr')–、–c(nr')n(r')–、–n(r')c(nr')n(r')–、–ob(me)o–、–s(o)2–、–os(o)–、–s(o)o–、–s(o)–、–os(o)2–、–s(o)2o–、–n(r')s(o)2–、–s(o)2n(r')–、–n(r')s(o)–、–s(o)n(r')–、–n(r')s(o)2n(r')–、–n(r')s(o)n(r')–、c3至c12亚碳环(carbocyclene)、3-至12-元亚杂环(heterocyclene)、5-至12-元亚杂芳基(heteroarylene)及其任何组合中的至少一个中断和/或终止(于末端处的一者或两者)，其中，r'为h或c1至c6烷基，其中，所述中断和终止基团的一者或两者可为相同或不同。
于一些具体实施例中，所述连接子可为聚乙二醇链，至少其中一个可经–s–、–n(r')–、–c≡c–、–c(o)–、–c(o)o–、–oc(o)–、–oc(o)o–、–c(nor')–、–c(o)n(r')–、–c(o)n(r')c(o)–、–c(o)n(r')c(o)n(r')–、–n(r')c(o)–、–n(r')c(o)n(r')–、–n(r')c(o)o–、–oc(o)n(r')–、–c(nr')–、–n(r')c(nr')–、–c(nr')n(r')–、–n(r')c(nr')n(r')–、–ob(me)o–、–s(o)2–、–os(o)–、–s(o)o–、–s(o)–、–os(o)2–、–s(o)2o–、–n(r')s(o)2–、–s(o)2n(r')–、–n(r')s(o)–、–s(o)n(r')–、–n(r')s(o)2n(r')–、–n(r')s(o)n(r')–、c3至c12亚碳环、3-至12-元亚杂环、5-至12-元亚杂芳基及其任何组合中的至少一个中断和/或终止(于末端处的一者或两者)，其中，r'为h或c1至c6烷基，其中，所述中断和终止基团的一者或两者可为相同或不同。
于特定具体实施例中，所述连接子可为具有1至10个亚烷基单元且以
于其它具体实施例中，所述连接子可为具有2至8个peg单元且以
“亚碳环”是指任选经取代的二价碳环基团。
“亚杂环”是指可任选经取代的二价杂环基团。
“亚杂芳基”是指可任选经取代的二价杂芳基基团。
适用于本发明的连接子的代表性实例包括亚烷基链，例如：
以各种官能基团(如上所述)终止的亚烷基链，其实例如下：
以各种官能基团(如上所述)中断的亚烷基链，其实例如下：
以亚杂环基团中断或终止的亚烷基链，例如，
以氨基、亚杂环基及/或芳基基团中断的亚烷基链，其实例包括：
以亚杂环基及芳基基团和杂原子中断的亚烷基链，其实例包括：
以及
以例如n、o或b的杂原子中断的亚烷基链，例如，
于一些具体实施例中，所述连接子为聚乙二醇链，其实例包括：
于一些具体实施例中，所述式(i)的双官能化合物包括以下结构的任一者表示的连接子：
因此，于一些具体实施例中，本发明的所述双官能化合物以任何下列结构表示：
或其药学上可接受的盐或立体异构体。
于一些具体实施例中，本发明的所述双官能化合物以任何下列结构表示：
或其药学上可接受的盐或立体异构体。
降解决定子
所述降解决定子(“d”)为结合e3泛素连接酶的官能部分或配体。
于一些具体实施例中，所述式(i)的双官能化合物包括结合小脑蛋白(cereblon)的降解决定子。结合小脑蛋白的降解决定子且可适用为本发明的降解决定子的代表性实例揭示于美国第2018/0015085号专利公开案(例如，其中的通式ia和ia’所包含的吲哚啉酮，例如异吲哚啉酮和异吲哚啉-1,3-二酮，以及其中的通式ib和ib’所包含的桥接环烷基化合物)。
于一些具体实施例中，所述式(i)的双官能化合物包括结合小脑蛋白的降解决定子，并以下列结构的任一者表示：
于一些具体实施例中，所述降解决定子结合希佩尔-林道(vonhippel-lindau，vhl)肿瘤抑制因子。结合vhl的降解决定子的代表性实例如下：
，其中，y’为键结、n、o或c；
结合vhl且可适用为本发明的降解决定子的其它降解决定子揭示于美国第2017/0121321a1号专利公开案。
于一些具体实施例中，所述降解决定子结合蛋白质凋亡(apoptosisprotein)抑制因子(iap)，并以下列结构的任一者表示：
结合iaps且可适用为本发明的降解决定子的其它降解决定子揭示于国际第wo2008128171号专利申请、国际第wo2008/016893号专利申请、国际第wo2014/060768号专利申请、国际第wo2014/060767号专利申请及国际第wo15092420号专利申请。iaps于本领域中已知为泛素-e3连接酶的作用。
于一些具体实施例中，所述式(i)的双官能化合物包括结合鼠双微体(murinedoubleminute2，mdm2)的降解决定子，并以下列结构的任一者表示：
结合mdm2且可适用作本发明的降解决定子的其它降解决定子揭示于美国第9,993,472b2号专利。mdm2于本领域中已知为泛素-e3连接酶的作用。
因此，于一些具体实施例中，本发明的所述双官能化合物通过任何结构tl1a-l10a至tl2a-l10k表示，其中，每个结构都可以具有本文所述的任何结构作为降解决定子，包括d1-a至d1-q、d2-a至d2-e、d3-a至d3-d和d4-a至d4-b，或其药学上可接受的盐或立体异构体。
于一些具体实施例中，本发明的所述双官能化合物通过任何下列结构表示：
以及其药学上可接受的盐或立体异构体。
式(i)的双官能化合物可为游离酸或游离碱的形式，或药学上可接受的盐。于本文中所用，术语“药学上可接受”于盐的内容中是指所述化合物的盐，其不消除所述化合物的生物学活性或性质且为相对无毒的，亦即，可将呈盐形式的化合物投予患者，而不会引起不良生物效应(例如，晕眩或胃部不适)或以有害方式与含该化合物的组合物的任何其他成分相互作用。术语“药学上可接受的盐”是指经由本发明化合物与适当酸或碱反应所得到的产物。本发明化合物药学上可接受的盐的实例，包括衍生自例如，li、na、k、ca、mg、fe、cu、al、zn和mn的适当无机碱。药学上可接受的无毒酸加成盐的实例为与无机酸形成氨基的盐类，例如，盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、异烟碱酸盐(isonicotinate)、乙酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐(gentisinate)、延胡索酸盐(fumarate)、葡萄糖酸盐、葡萄糖醛酸盐、葡萄糖二酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、麸氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、4-甲基苯磺酸盐或对甲苯磺酸盐等。本发明的特定化合物可与各种例如赖氨酸、精氨酸、胍(guanidine)、二乙醇氨(diethanolamine)或二甲双胍(metformin)的有机碱形成药学上可接受的盐。
于一些具体实施例中，式(i)的双官能化合物为同位素衍生物，其具有至少一个所需同位素取代的原子，其量高于该同位素的天然含量，亦即，经富集。于一些具体实施例中，所述化合物包括氘或多个氘原子。由于更大的代谢稳定性，以例如氘(即2h)的较重同位素的取代可提供特定的治疗优势，例如，增加的体内半衰期或减少的剂量需求，因此，于一些状况下可能为有利的。
式(i)的双官能化合物可具有至少一个掌性中心，并因此可呈立体异构体形式，如本文中所用，其涵盖个别化合物的所有异构体，仅其原子的空间取向不同。术语立体异构体包含镜像异构体(包括化合物的(r-)或(s-)组态的镜像异构体)、化合物的镜像异构体混合物(镜像异构体的物理混合物与消旋物或消旋混合物)、化合物的几何(顺式/反式或e/z、r/s)异构体及具有多于一个掌性中心的化合物的异构体，其彼此间互不为镜像(非镜像异构体)。化合物的掌性中心可于体内进行差向异构化。因此，针对这些化合物，投予(r-)形式的化合物被认为相当于投予(s-)形式的化合物。因此，本发明的化合物可以个别异构体且实质上不含其它异构体的形式或以各种异构体混合物，例如立体异构体的消旋混合物，的形式制备及使用。
此外，式(i)的双官能化合物涵盖使用所述化合物的n-氧化物、结晶形式(同质异形体，polymorph)、具有相同活性类型的化合物的活性代谢物、互变异构体及与药学上可接受溶剂(例如，水、乙醇等)的未溶剂化以及溶剂化的形式。本文中所呈现共轭体的溶剂化形式亦被视为本文所揭示。
合成方法
于另一实施例中，本发明涉及一种用于制造式(i)双官能化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体的方法。一般而言，本发明化合物或其药学上可接受盐或立体异构体可利用已知适用于制备化学相关化合物的任何方法进行制备。结合各种工作实例中描述及说明可用于制备本发明化合物的非限制性方法的合成方案，将更理解本发明化合物。
药物组合物
本发明的另一实施例涉及一种药物组合物，其包含治疗有效量的式(i)的双官能化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体，及药学上可接受的载剂。术语“药学上可接受的载剂”，如本领域中已知，是指适合将本发明化合物投予哺乳动物的药学上可接受的材料、组合物或媒介物。适合的载剂可包括，例如，作用将化合物从一个器官或身体的一部分携带或运送至另一器官或身体另一部分的功能的液体(水性与非水性均然及其组合)、固体、胶囊化物料、气体、及其组合(例如，半固体)及气体。载剂为“可接受”的意义上而言是就其对制剂的其它成分具生理惰性且可相容，并对个体或病患无害。取决于制剂的类型，组合物可包含一或多个药学上可接受的赋形剂。
大体上，式(i)的双官能化合物可根据常规药学操作，例如常规混合、溶解、制粒、糖衣制造、研调、乳化、胶囊化、包囊与压缩制程(参见，例如，remington:thescienceandpracticeofpharmacy(20thed.),ed.a.r.gennaro,lippincottwilliams&wilkins,2000andencyclopediaofpharmaceuticaltechnology,eds.j.swarbrickandj.c.boylan,1988-1999,marceldekker，纽约)调配成特定类型的组合物。制剂的类型取决于投予方式，其可包括经肠(enteral)(例如，口腔、口颊、舌下及直肠)、非经肠(parenteral)(例如，皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌内(i.m.)及胸骨内注射或输注技术、眼内、动脉内、髓内、脊髓腔、心室内、经皮、皮内、阴道内、腹膜内、粘膜、鼻腔粘膜、气管内滴注、支气管滴注、与吸入)及局部(例如，经皮)。一般而言，最适当的投予途径将取决于各种包括，例如，制剂性质(例如，其于胃肠道环境中的稳定性)及/或个体状况(例如，个体是否能忍受口服投予)的因素。举例而言，非经肠(例如，静脉内)投予亦可为有利的，因为例如于单次剂量治疗及/或急性症状的情形下，所述化合物可相对快速地投予。
于一些具体实施例中，所述双官能化合物调配为口服或静脉内投予(例如，全身性静脉内注射)。
因此，式(i)的双官能化合物可调配为固体组合物(例如，粉剂、锭剂、可分散性颗粒、胶囊、胶囊药剂(cachet)和栓剂)、液体组合物(例如，化合物溶解的溶液、化合物固体颗粒的分散悬浮液、乳液及含有脂质体、微胞或纳米粒子、糖浆和酏剂的溶液)；半固体组合物(例如，凝胶、悬浮液和乳液)；与气体(例如，用于气溶胶组合物的推进剂)。式(i)的双官能化合物亦可调配成供快速、中等或延续释放。
用于口服投予的固体剂型包括胶囊、锭剂、丸剂、粉剂和粒剂。于所述固体剂型中，活性化合物与例如柠檬酸钠或磷酸二钙的载剂及额外的载剂或赋形剂，例如a)填料或增充剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸，b)粘合剂，例如，举例而言，甲基纤维素、微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、褐藻酸、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶，c)保湿剂，例如甘油，d)崩散剂，例如交联聚合物(如，交联聚乙烯吡咯烷酮(交联聚维酮)、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、琼脂、碳酸钙、马铃薯或树薯淀粉、褐藻酸、特定硅酸盐和碳酸钠)，e)溶液阻碍剂，例如石蜡，f)吸收加速剂，例如四级铵化合物，g)润湿剂，例如，举例而言，十六烷醇与单硬脂酸甘油酯，h)吸收剂，例如高岭土与膨土，以及i)润滑剂，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇类、硫酸月桂酯钠以及其混合物进行混合。于胶囊、锭剂与丸剂的情形下，剂型亦包含缓冲剂。同样类型的固体组合物亦可使用此类赋形剂，如乳糖或乳糖(milksugar)以及高分子量聚乙二醇类等作为软与硬充填明胶胶囊中的填充剂。锭剂、糖衣锭、胶囊、丸剂和粒剂的固体剂型可使用例如肠溶性包衣与其他包衣类的包衣与壳进行制备。彼等可进一步包含失透剂。
于一些具体实施例中，式(i)的双官能化合物可调配于硬或软的明胶胶囊中。可使用的代表性赋形剂包括预糊化淀粉、硬脂酸镁、甘露糖醇、硬脂酰延胡索酸钠、无水乳糖、微晶纤维素和交联羧甲基纤维素钠。明胶壳可包含明胶、二氧化钛、氧化铁和着色剂。
于一些具体实施例中，式(i)的双官能化合物可调配为片剂，其可以包含赋形剂，例如，乳糖单水合物、微晶纤维素、羟乙酸淀粉钠，、石酸镁和疏水性胶体二氧化硅。
彼等可配制为肠胃外和口服投予形式的溶液，特别是在水溶性的范围内。肠胃外投予也可能是有利的，因为所述化合物可以相对快速地投予，例如，在单剂量治疗和/或急性病况的状况中。
注射用制剂可包括无菌水性溶液或油性悬浮液。彼等可根据标准技术使用适当的分散剂或润湿剂与悬浮剂进行调配。无菌注射用制剂亦可为于无毒性非经肠可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射用溶液、悬浮液或乳液，例如，于1,3-丁二醇中的溶液。于可接受的媒剂与溶剂中，可使用水、林格氏(ringer's)液(u.s.p.)与等渗透氯化钠溶液。此外，无菌、非挥发性油通常用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可使用包括合成的甘油一酯或甘油二酯的任何温和的非挥发性油。此外，于注射用制剂的制备中使用例如油酸的脂肪酸。注射用制剂可经灭菌，例如，通过细菌保留过滤器进行过滤，或通过掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂，可于使用前溶解或分散于无菌水或其它无菌的注射媒介物中。化合物的效应可通过放慢其吸收而延长，其可通过使用低水溶解度的液体悬浮液或结晶或无定形材料达成。通过将化合物悬浮于油性媒介物中，亦可达成非经肠投予制剂的延长化合物吸收。
于特定具体实施例中，式(i)的双官能化合物可为局部投予，而非全身性的方式，举例而言，通常通过长效制剂或缓释制剂将缀合物直接注射到器官中。于特定具体实施例中，长效制剂是通过植入(例如，皮下或肌内)或经由肌内注射投予。注射用积存型制剂(depotform)是通过于生物可降解聚合物(例如，聚乳酸-聚甘醇酸、聚原酸酯与聚酸酐)中形成化合物的微胶囊基质制成。化合物的释放速率可经由改变化合物对聚合物的比例及所使用特定聚合物的性质进行控制。积存型注射用制剂亦可经由将化合物包囊于与身体组织兼容的脂质体或微乳液中进行制备。再者，于其它具体实施例中，式(i)的双官能化合物于标靶药物释放系统中进行递送，例如，于被覆器官特异性抗体的脂质体中。于所述具体实施例中，脂质体是靶向器官并被器官选择性吸收。
用于口服投予的液体剂型包括溶液、悬浮液、乳液、微乳液、糖浆和酏剂。除了所述化合物以外，液体剂型还可含有本领域中通常使用的水性或非水性载剂(取决于化合物的溶解度)，例如，举例而言，水或其它溶剂、助溶剂和乳化剂，例如，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰氨、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和去水山梨醇的脂肪酸酯及其混合物。口服组合物亦可包含赋形剂例如润湿剂、悬浮剂、着色剂、甜味剂、调味剂和芳香剂。
式(i)的双官能化合物可调配为口颊或舌下投予，其实例包括锭剂、口含锭剂和凝胶。
所述式(i)的双官能化合物可调配成通过吸入投予。适用于通过吸入投予的各种形式包括气溶胶、雾或粉剂。药物组合物可从使用适当推进剂(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他适当气体)的加压包装或喷雾器，以气溶胶喷雾呈现的形式递送。于一些具体实施例中，加压气雾剂的剂量单位可以通过提供阀门以确定计量剂量。于一些具体实施例中，例如用于吸入器或吹入器的包含明胶的胶囊与药筒，可配制例如用于吸入器或吹入器的包括明胶的胶囊和药筒，其中，含有化合物和合适的粉末基质(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
式i的双官能化合物可调配为局部投予，如本文中所用，是指是指通过将该制剂应用于表皮进行皮内投予。这些组合物的类型通常以软膏、糊剂、乳剂、洗涤剂、凝胶、溶液和喷雾剂的形式。
用于调配局部施用组合物的载剂的代表性实例包括溶剂(例如，醇、多元醇、水)、乳剂、洗涤剂、软膏、油、硬膏剂、脂质体、粉剂、乳液、微乳液和缓冲溶液(例如，低渗透压或缓冲盐液)。乳剂，举例而言，可使用饱和或不饱和脂肪酸，例如硬脂酸、棕榈酸、油酸、棕榈油酸、鲸蜡醇或油醇进行调配。乳剂亦可含非离子性界面活性剂，例如聚氧乙烯40硬脂酸酯。
于一些具体实施例中，所述局部制剂亦可包含赋形剂，其实例为穿透增强剂。这些制剂能将药理学上活性的式i的双官能化合物运输穿过角质层进入表皮或真皮，较佳地具有很少或无全身性吸收。渗透促进剂的代表性实例包括甘油三酸酯(例如大豆油)、芦荟组合物(例如芦荟凝胶)、乙醇、异丙醇、辛基苯基聚乙二醇、油酸、聚乙二醇400、丙二醇、n-癸基甲基亚砜、脂肪酸酯(例如肉豆蔻酸异丙酯、月桂酸甲酯、甘油单油酸酯和丙二醇单油酸酯)和n-甲基吡咯烷酮。
尚可包含于局部以及其他类型制剂中(于其兼容范围内)的其他赋形剂的表示性实例包括防腐剂、抗氧化剂、保湿霜、软化剂、缓冲剂、助溶剂、皮肤保护剂和界面活性剂。适当防腐剂包括醇、四级铵、有机酸、对羟苯甲酸酯类和酚。适当抗氧化剂包括抗坏血酸与其酯、亚硫酸氢钠、二丁基羟基甲苯、丁基羟基甲氧苯、生育酚及如edta与柠檬酸等的螯合剂。适当保湿霜包括甘油、山梨糖醇、聚乙二醇类、尿素和丙二醇。适当缓冲剂包括柠檬酸、盐酸和乳酸缓冲液。适当助溶剂包括氯化第四铵类、环糊精、苯甲酸苄酯、卵磷脂和聚山梨醇酯类。适当皮肤保护剂包括维生素e油、尿囊素(allantoin)、二甲硅油、甘油、凡士林和氧化锌。
经皮制剂一般为使用经皮递送装置和经皮递送贴片，其中，将式(i)的双官能化合物调配于亲脂性乳液或缓冲水溶液中，溶解及/或分散于聚合物或胶粘剂中。贴片可建构成用于连续、脉动或按需求递送的药物制剂。式(i)的双官能化合物的经皮递送可利用离子电渗贴片完成。经皮贴片可提供经调控的化合物递送，其中，经由使用速率控制膜或将化合物捕捉于聚合物基质或凝胶内以减缓吸收速率。可使用吸收促进剂以增加吸收，其实例包括可帮助穿过皮肤的可吸收的药学上可接受的溶剂。
眼科制剂包括眼药水。
用于直肠投予的制剂包括灌肠剂、直肠凝胶剂、直肠泡沫剂、直肠气溶胶剂和保留灌肠剂，其可含习知的栓剂基底，例如可可脂或其他甘油酯类，以及合成聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮、peg等。直肠或阴道投予的组合物亦可调配成栓剂，其可经由将化合物与合适的无刺激性载剂与赋形剂，例如可可脂、脂肪酸甘油酯、聚乙二醇、栓剂蜡及其混合物混合进行制备，彼等于环境温度下均为固体，惟于体温下为液体，因此于直肠或阴道腔中融化并释放化合物。
剂量
于本文中所用，术语“治疗有效量”是指式(i)的双官能化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体于患有疾病或病症的特定患者中有效产生所需的治疗反应的量。术语“治疗有效量”包括式(i)的双官能化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体的量，其于投予时可诱导待治疗的疾病或病症的正向改变(例如，抑制和/或降低lrrk2gtp结合的活性和/或lrrk2蛋白激酶的活性和小胶质细胞(microglial)的活化，并抑制突变体lrrk2诱导的神经元变性)，或足以抑制或阻止疾病或病症的发展或进展，或缓解正在治疗的疾病或病症的一种或多种症状至某种程度，或者单纯杀死或抑制患病细胞的生长，或减少患病细胞(例如，基底神经节(basalganglia)和黑质(substantianigra)神经细胞)中lrrk2的量。
所述式(i)的双官能化合物的每日总剂量及其用法可以根据标准的医学实践，例如，由主治医师使用合理的医学判断来决定。对于任何特定个体的具体治疗有效剂量将取决于多种因素，包括所治疗的疾病或病症及其严重性(例如，其当前状态)；所用特定化合物的活性；使用的具体组成；个体的年龄、体重、整体健康状况、性别和饮食；投予时间、投予途径和所用特定化合物的排泄速率；治疗的持续时间；与所使用的特定化合物组合或同时使用的药物；以及医学领域众所周知的因素(请参阅，例如，goodmanandgilman's,“thepharmacologicalbasisoftherapeutics”，第10版，a.gilman,j.hardmanandl.limbird,eds.,mcgraw-hillpress,155-173,2001)等等。
所述式(i)的双官能化合物可于很宽的剂量范围内有效。于一些具体实施例中，每日总剂量(例如，对于成年人类)可为约0.001至约1600mg、0.01至约1000mg、0.01至约500mg、约0.01至约100mg，约0.5至约100mg、每天约1至约100至400mg、每天约1至约50mg、每天约5至约40mg的范围，于其它具体实施例中，每天约10至约30mg。取决于化合物每天投予的次数，可以配制单个剂量以包含所需的剂量。举例来说，可以约1至约200mg的化合物(例如，1、2、2.5、3、4、5、10、15、20、25、50、100、150和200mg)配制胶囊。于一些具体实施例中，式(i)的双官能化合物可以每天约0.01mg至约200mg/kg体重的剂量投予。每天0.1至100的剂量，例如，每天1至30mg/kg以每天一或更多剂量可能是有效的。举例来说，口服投予的合适剂量可以在每天1至30mg/kg体重的范围内，静脉内投予的合适剂量可以在每天1至10mg/kg体重的范围内。
于一些具体实施例中，所述式(i)的双官能化合物的每日剂量为约37.5mg至约50mg。为促进投予，可将化合物以12.5mg、25mg和50mg的剂量配制于胶囊中。
使用方法
于一些实施例中，所述式(i)的双官能化合物可有效治疗由异常(例如，失调或功能障碍)lrrk2活性介导的疾病或病症。所述疾病或病症可由功能障碍的蛋白质活性(例如，相对于非病理状态的升高蛋白质水平)为特征或介导。“疾病”通常被认为是个体的健康状态，其中，个体不能维持体内稳态，并且如果疾病没有得到改善，则个体的健康继续恶化。相较于此，个体的“疾病”是一种健康状态，其中，个体能够维持体内稳态，但是其中，个体的健康状态要比没有所述疾病的情况差。如果不进行治疗，疾病不一定会导致动物健康状况的进一步下降。
所述式(i)的双官能化合物可用于治疗神经退化疾病和病症。如本文中所用，术语“神经退化疾病和病症”是指以神经细胞的进行性变性或死亡或两者均有为特征的病症，包括运动(共济失调)或精神功能(痴呆)的问题。所述疾病和失调的代表性实例包括阿尔茨海默氏病(ad)和与ad相关的痴呆、帕金森氏症(pd)和与pd有关的痴呆、朊毒体病(priondiseases)、运动神经元疾病(mnd)、亨廷顿病(hd)、脊髓小脑共济失调(sca)、脊髓性肌萎缩症(sma)、原发进行性失语症(ppa)、肌萎缩性侧索硬化症(als)、脑外伤(tbi)、多发性硬化症(ms)和痴呆症(例如，血管性痴呆(vad)、路易体痴呆(lbd)、语义性痴呆和额颞叶性痴呆(ftd)。
所述疾病和失调的其它代表性实例包括脑癌。脑癌的代表性实例包括血管母细胞瘤(capillaryhemangioblastomas)、脑膜瘤(meningiomas)、脑转移瘤(cerebralmetastases)、神经胶质瘤(gliomas)、神经母细胞瘤(neuroblastomas)、髓母细胞瘤(medulloblastomas)和室管膜瘤(ependymomas)。
可以本发明的方式治疗的神经胶质瘤的代表性实例包括复发性高度神经胶质瘤，包括胶质细胞瘤、间变性星形细胞瘤(anaplasticastrocytoma)和间变性少突胶质细胞瘤(anaplasticoligodendroglioma)以及例如dipg的高度儿科神经胶质瘤。
可以用本发明的方式治疗的胶质母细胞瘤的代表性实例包括ii级(低级星形细胞瘤)、iii级(间变性星形细胞瘤)和iv级(胶质母细胞瘤)和多形胶质母细胞瘤(gbm)。
因此，本发明的方法包括将治疗有效量的式(i)的双官能化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体投予有此需要的个体。如本文中所用，术语“个体”(或“患者”)包括倾向于或患有所指的疾病或病症的动物界的所有成员。于一些具体实施例中，所述个体为哺乳动物，例如，人类或非人类哺乳动物。所述方法亦适用于伴生动物，例如，狗和猫，以及牲畜，例如牛、马、绵羊、山羊、猪以及其他驯养和野生动物。“患有或疑似患有”特定疾病或病症的个体可能具有足够数量的危险因素，或者表现出足够数量的症状或体征或组合，以使医疗专业人员可以诊断或怀疑所述各体患有疾病或失调。因此，患有或疑似患有特定疾病或病症的个体不一定是两个不同的群组。
所述式(i)的双官能化合物可以单一疗法或通过联合疗法的形式投予个体，例如患有神经退化疾病或病症或者脑癌(例如，神经胶质瘤和多形性胶质母细胞瘤)的患者，作为前线治疗或对前线治疗无反应的患者的后续治疗。对于没有接受过抗神经退化或抗癌治疗方案的患者，无论是单独治疗还是与其他治疗结合使用，治疗均可以“前线/一线”治疗；或“二线”，作为已接受过先前抗神经退行性或抗癌治疗方案的患者的治疗，无论是单独治疗还是与其他治疗结合使用；或作为“第三线”、“第四线”等治疗，单独或与其他治疗组合使用。也可以对以前接受过部分治疗但对特定治疗不耐受的治疗的患者进行治疗。
本发明的方法可能需要将式(i)的双官能化合物或包含所述化合物的药物组合物以单剂量或多剂量(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20或更多剂量)。例如，投予频率可以从每天一次到大约每八周一次。于一些具体实施例中，投予频率范围为每天一次约1、2、3、4、5或6周，且于其它具体实施例中需要28天的周期，其包括每天投予3周(21天)。于其它具体实施例中，式(i)的双官能化合物可以在两天半的时间内每天两次(bid)投予(总共5次剂量)，或者在两天的过程中每天投予一次(qd)为期两天(共2剂)。于其它具体实施例中，式(i)的双官能化合物可以在五天的过程中每天一次(qd)投予。
本发明的双官能化合物可以作为单一疗法或通过联合疗法投予于患者，例如患有神经退化疾病或病症或者脑癌(例如神，经胶质瘤和多形性胶质母细胞瘤)的患者。双官能化合物可以与其它活性剂同时投予。已知用于治疗神经退行性疾病和病症的活性剂的代表性实例包括多巴胺能治疗(例如，卡比多巴-左旋多巴(carbidopa-levodopa)、普拉克索(mirapex)、罗匹尼罗(requip)和罗替戈汀(neupro，以贴剂形式提供))。用于pd和运动障碍的阿扑吗啡(apomorphine)和单胺氧化酶b(mao-b)抑制剂(例如，司来吉兰(selegiline，eldepryl，zelapar)、雷沙吉兰(azilect)和沙非酰胺(xadago))，用于认知障碍的胆碱酯酶抑制剂(例如，苄索平(cogentin)或三己苯吡啶)，用于痴呆的行为和心理症状的抗精神病药，以及目的在于减缓疾病发展的药物，例如，用于als、脑性共济失调和亨廷顿病的利鲁唑(riluzole)，用于阿尔茨海默症非甾体类抗炎药以及对帕金森氏症具有神经保护作用的咖啡因a2a受体拮抗剂和cere-120(腺相关病毒血清型2-神经营养因子，adeno-associatedvirusserotype2-neurturin)。已知可治疗脑癌的活性剂的代表性实例包括替莫唑胺(temodar)、贝伐单抗(avastin)、洛莫司汀(ccnu，ceenu)、卡莫斯汀片(bcnu，gliadel)和toca5(tocagen)。术语“同时”不限于精确地同时投予抗神经退化或抗癌治疗剂。相对地，这意味着将彼等作为相同治疗过程的一部分投予至个体，例如，依序且于时间间隔内，以使得彼等可以一起作用(例如，协同作用)以提供相较于另外投予所带来的益处更大的效益。
药物试剂盒
本发明的组合物可以组装成试剂盒或药物系统。根据本发明的此实施例的试剂盒或药物系统包括载体或包装，例如，盒、纸盒、管或等等，其中，具有紧密封闭的一个或多个容器，例如，小瓶、管、安瓿或瓶，其含有本发明的式(i)的双官能化合物或药物组合物。本发明的试剂盒或药物系统还可包括使用所述化合物和组合物的印刷说明书。
实施例
实施例1：2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-((2-(2-(3-(4-(3-甲氧基-4-((4-(甲氨基))-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰基)哌嗪-1-基)-3-氧代丙氧基)乙氧基)乙基)氨基二氢吲哚-1,3-二酮(2)的合成：
根据choi等人，acsmed.chem.lett.3(8):658-662(2012)以及scott等人，j.med.chem.60(7):2983-2992(2017)中描述的程序，使用适当的嘧啶，苯胺和叔丁氧羰基-(boc)保护的哌嗪制备中间产物int-1、int-2和int-3。
将4-(3-甲氧基-4-((4-(甲基氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(int-3)(12mg，0.024mmol)溶解于dcm(10ml)中。加入三氟乙酸tfa(1ml)，并搅拌混合物30分钟。于减压下移除溶剂。将所得的残余物溶解于dmf(2ml)中，之后加入3-(2-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)乙氧基)(乙氧基)丙酸(10mg，0.024mmol)和(1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1h-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化六氟磷酸盐(hatu)(18毫克，0.048mmol)，接着加入n,n-二异丙基乙胺(diea)(20μl，0.115mmol)，搅拌混合物30分钟，通过反相hplc纯化粗产物，使用1％至70％的梯度，于水中的mecn，得到呈黄色固体之所欲产物(12mg，收率63％)。
1hnmr(500mhz,dmso)δ11.10(br,1h),8.72(br,1h),8.29(s,1h),8.21(d,j＝9hz,1h),7.79(br,1h),7.57(m,1h),7.13(m,2h),7.03(m,2h),6.59(br,1h),5.05(dd,j＝5hz,6hz,1h),4.0–3.41(m,22h),2.94(d,5hz,3h),2.87(m,1h),2.62–2.55(m,3h),2.04(m,1h)。
ms(esi)m/z：826.74(m+h)+。
实施例2：2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-((15-(4-(3-甲氧基-4-((4-(甲基氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基]氨基)苯甲酰基)哌嗪-1-基)-15-氧代3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基二氢吲哚-1,3-二酮(1)的合成：
以与实施例1中的化合物2类似的方式制备化合物1。分离出呈黄色固体的所欲产物(18mg，收率86％)。
ms(esi)m/z：914.39(m+h)+。
实施例3：2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-((9-(4-(3-甲氧基-4-((4-(甲基氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基]氨基)苯甲酰基)哌嗪-1-基)-9-氧酮基)氧基)异吲哚啉-1,3-二酮(3)的合成：
以与实施例1中的化合物2类似的方式制备化合物3。分离出呈褐色固体的所欲产物(10mg，收率53％)。
ms(esi)m/z：823.52(m+h)+。
实施例4：2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-((2-(2-(2-(2-(4-(3-甲氧基-4-((4-(甲基氨基))-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基吲哚啉-1,3-二酮(5)的合成：
4-(3-氧代-1-苯基-2,7,10,13-四氧杂-4-氮杂十五烷-15-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(int-5)
在0℃下，将dmp(1.94g，4.58mmol)加入至于dcm(50ml)中的苄基(2-(2-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸酯(int-4)(1g，3.05mmol)的溶液中。于室温(rt)下搅拌混合物1小时。使用饱和硫代硫酸钠水溶液和饱和nahco3水溶液淬灭反应，并使用dcm进行萃取。以水、盐水洗涤合并的有机萃取物，经mgso4干燥，并于真空下进行浓缩，得到澄清的油。向于dcm(50ml)溶液中的油状产物加入哌嗪-1-甲酸叔丁酯(852mg，4.58mmol)以及et3n(2.13ml，15.25mmol)，并搅拌混合物30分钟。加入三乙酰氧基硼氢化钠(stab)(1.97g，9.30mmol)，并将混合物搅拌过夜。使用饱和nahco3水溶液淬灭反应，并使用dcm进行萃取。以水、盐水洗涤合并的有机萃取物，经mgso4干燥，并于真空下进行浓缩，得到澄清的油，无需进一步纯化即可使用(1.41g，收率93％)。
ms(esi)m/z：496.38(m+h)+。
4-(2-(2-(2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(int-6)
于meoh(30ml)中的4-(3-氧代-1-苯基-2,7,10,13-四氧杂-4-氮杂十五烷-15-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(int-5)(1.41g，2.84mmol)溶液加入pd/c10％(301mg，0.28mmol)，并于h2气氛下搅拌混合物3小时。通过硅藻土过滤反应物，并在减压下浓缩滤液，得到呈浅棕色油状的所欲产物(965mg，收率94％)。
ms(esi)m/z：362.57(m+h)+。
4-(2-(2-(2-(2-((2-(2,6-二氧杂哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基-氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(int-7)
于100℃加热4-(2-(2-(2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(int-6)(300mg，0.83mmol)、2-(21,6-二氧代哌啶-3-基)-4-氟异吲哚-1,3-二酮(275mg，1.0mmol)和et3n(350μl，2.5mmol)于二甲基乙酰胺(dma)(2ml)中的溶液4个小时。通过反相hplc使用在水中的1％至70％的梯度的mecn纯化混合物，得到呈黄色固体的所欲产物(137mg，收率27％)。
ms(esi)m/z：618.31(m+h)+。
2-(2,6-二氧杂哌啶-3-基)-4-((2-(2-(2-(2-(2-(哌嗪-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基)异吲哚啉-1,3-二酮(int-8)
加入tfa(1ml)至于dcm(10ml)中的4-(2-(2-(2-(2-((2-(2,6-二氧杂哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基-氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(int-7)(137mg,0.222mmol)溶液中，并搅拌混合物1小时。于减压下移除溶剂，得到呈黄色泡沫的所欲产物的tfa盐，无需进一步纯化即可使用(115mg，收率100％)。
ms(esi)m/z：518.75(m+h)+。
根据choi等人，acsmed.chem.lett.3(8):658-662(2012)中描述的程序，使用适当的嘧啶、苯胺和boc-保护的哌嗪制备中间产物int-1和int-10。
向于dmf(2ml)中的3-甲氧基-4-((4-(甲基氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酸(int-10)(10mg，0.029mmol)溶液加入2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-((2-(2-(2-(2-(2-哌嗪-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基)异吲哚啉-1,3-二酮(int-8)(15mg，0.029mmol)和hatu(22mg，0.058mmol)，接着为diea(25μl，0.145mmol)。搅拌混合物30分钟。通过反相hplc纯化粗产物，使用于h2o中1％至70％mecn的溶液梯度进行纯化，得到呈黄色固体的所欲产物(7mg，收率37％)。
ms(esi)m/z：842.61(m+h)+。
实施例5：4-((2-(2-(2-(2-(4-(4-((5-氯-4-(甲基氨基)嘧啶-2-基)氨基]-3-甲氧基苯甲酰基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(4)的合成。
以与实施例4中的化合物5类似的方式制备化合物4。分离出呈褐色固体的所欲产物(9mg，收率56％)。
ms(esi)m/z：809.61(m+h)+。
实施例6：4-((14-(4-(4-((5-氯-4-(甲基氨基)嘧啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酰基)哌嗪-1-基)-3,6,9,12-四氧杂环丁烷基)氨基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(6)的合成。
以与实施例4中的化合物5类似的方式制备化合物6。分离出呈褐色固体的所欲产物(6mg，收率21％)。
ms(esi)m/z：881.36(m+h)+。
实施例7：2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-((14-(4-(3-甲氧基-4-((4-(甲基氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基]氨基)苯甲酰基)哌嗪-1-基)-3,6,9,12-四氧杂环丁酸酯)氨基)异吲哚啉-1,3-二酮(7)的合成。
以与实施例4中的化合物5类似的方式制备化合物7。分离出呈褐色固体的所欲产物(8mg，收率30％)。
1hnmr(500mhz,dmso)δ11.10(br,1h),9.96(br,1h),8.57(br,1h),8.30(d,j＝9hz,1h),8.28(s,1h),7.64(s,1h),7.58(m,1h),7.14–7.09(m,3h),7.05(d,j＝5hz,2h),6.58(br,1h),5.05(dd,j＝5hz,6hz,1h),3.91(s,3h),3.72–3.32(m,27h),2.94(d,5hz,3h),2.62–2.55(m,3h),2.09–1.99(m,1h)。
ms(esi)m/z：914.45(m+h)+。
实施例8：2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-((2-(2-(3-(4-(6-(5-(1-甲基环丙氧基)-1h-吲唑-3-基)嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-3-氧丙氧基)乙氧基)乙基)氨基)二氢吲哚-1,3-二酮(8)的合成。
5-(1-甲基环丙氧基)-3-(6-(哌嗪-1-基)嘧啶-4-基)-1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1h-吲唑(int-11)
中间产物11为根据scott等人，j.med.chem.60(7):2983-2992(2017)中描述的程序进行制备。
ms(esi)m/z481.42(m+h)+。
于5-(1-甲基环丙氧基)-3-(6-(哌嗪-1-基)嘧啶-4-基)-1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1h-吲唑(int-11)(20mg，0.042mmol)和3-(2-(2-((2-(2-,2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基丙酸(20mg，0.046mmol)的溶液中加入hatu(32mg，0.084mmol)，接着为diea(40μl，0.21mmol)。搅拌混合物30分钟。使用h2o淬灭反应，并使用etoac进行萃取。使用盐水洗涤合并的有机萃取物，经mgso4干燥，并于减压下进行浓缩，得到褐色残余物。加入tfa(1ml)至褐色产物于dcm(10ml)中的溶液中，并搅拌所得混合物1小时。于减压下移除溶剂。将残余物再溶解于thf(10ml)中，之后加入饱和nahco3水溶液(2ml)，并在室温搅拌混合物1小时。使用h2o淬灭反应，并使用etoac萃取。使用盐水洗涤合并的有机萃取物，经mgso4干燥，并于减压下进行浓缩，得到褐色残余物。通过反相hplc纯化粗产物，使用于h2o中1％至80％mecn的溶液梯度进行纯化，得到呈黄色油状的所欲产物(6mg，收率19％)。
1hnmr(500mhz,dmso)δ13.81(br,1h),11.09(s,1h),8.71(s,1h),7.60(d,j＝8hz,1h),7.56(t,j＝10hz,1h),7.39(s,1h),7.19(m,1h),7.12(d,j＝8hz,1h),7.04(d,j＝6hz,1h),6.59(s,1h),5.04(dd,j＝5hz,6hz,1h),3.84(m,4h),3.89-3.42(m,15h),2.92-2.84(m,1h),2.65-2.58(m,3h),2.07(s,1h),2.03(m,1h),1.55(s,3h),0.98(m,2h),0.79(m,2h)。
ms(esi)m/z：766.37(m+h)+。
实施例9：2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-((15-(4-(6-(5-(1-甲基环丙氧基)-1h-吲唑-3-基)嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基)异吲哚啉-1,3-二酮(9)的合成。
以与实施例8中的化合物8类似的方式制备化合物9。
ms(esi)m/z：854.62(m+h)+。
实施例10：2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-((15-(4-(6-(5-(1-甲基环丙氧基)-1h-吲唑-3-基)嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基)异吲哚啉-1,3-二酮(10)的合成。
以与实施例8中的化合物8类似的方式制备化合物10。分离出呈黄色油状的所欲产物(4mg，收率13％)。
1hnmr(500mhz,dmso)δ11.09(s,1h),8.72(s,1h),7.65(d,j＝8hz,1h),7.57(t,j＝10hz,1h),7.36(s,1h),7.24(m,1h),7.14(d,j＝8hz,1h),7.01(d,j＝6hz,1h),6.58(s,1h),5.04(dd,j＝5hz,6hz,1h),3.84(m,4h),3.89-3.42(m,15h),2.85(m,1h),2.67(m,2h),1.55(s,3h),0.99(m,2h),0.81(m,2h)。ms(esi)m/z：722.48(m+h)+。
实施例11：3-(7-((2-(3-(4-(6-(5-(1-甲基环丙氧基)-1h-吲唑-3-基)嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-3-氧代丙氧基)乙基)氨基)-1-氧代异吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮(11)的合成。
以与实施例8中的化合物8类似的方式制备化合物11。分离出呈褐色固体的所欲产物(3mg，收率10％)。
ms(esi)m/z：708.61(m+h)+。
实施例12：3-(7-((2-(2-(3-(4-(6-(5-(5-(1-甲基环丙氧基)-1h-吲唑-3-基)嘧啶-4-基)哌嗪-1-基]-3-氧代丙氧基)乙氧基)乙基)氨基)-1-氧代异吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮(12)的合成。
以与实施例8中的化合物8类似的方式制备化合物12。分离出呈褐色油体的所欲产物(1mg，收率3％)。
1hnmr(500mhz,dmso)δ11.09(s,1h),8.72(s,1h),7.65(d,j＝8hz,1h),7.57(t,j＝10hz,1h),7.36(s,1h),7.24(m,1h),7.14(d,j＝8hz,1h),7.01(d,j＝6hz,1h),6.58(s,1h),5.04(dd,j＝5hz,6hz,1h),3.84(m,4h),3.89-3.42(m,15h),2.85(m,1h),2.67(m,2h),1.55(s,3h),0.99(m,2h),0.81(m,2h)。
ms(esi)m/z：752.78(m+h)+。
实施例13：3-(7-((15-(4-(6-(5-(1-甲基环丙氧基)-1h-吲唑-3-基)嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基)-1-氧代异吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮(13)的合成。
以与实施例8中的化合物8类似的方式制备化合物13。分离出呈褐色油体的所欲产物(2mg，收率6％)。
ms(esi)m/z：840.14(m+h)+。
实施例14：(2r，4s)-1-((r)-2-(叔丁基)-16-(4-(6-(5-(1-甲基环丙氧基)-1h-吲唑-3-基)嘧啶-4-yl)哌嗪-1-基)-4,16-二氧杂-7,10,13-三氧杂-3-氮杂十六烷酰基)-4-羟基-n-((r)-1-(4-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-羧酰胺(14)的合成。
以与实施例8中的化合物8类似的方式制备化合物14。分离出呈褐色油体的所欲产物(14mg，收率31％)。
ms(esi)m/z：1010.65(m+h)+。
实施例15：(2s,4r)-1-((s)-2-(叔丁基)-19-(4-(6-(5-(1-甲基环丙氧基)-1h-吲唑-3-基)嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-4,19-二氧杂-7,10,13,16-四氧杂-3-氮杂十二烷酰基)-4-羟基-n-((s)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基吡咯烷-2-羧酰胺(15)的合成。
以与实施例8中的化合物8类似的方式制备化合物15。分离出呈褐色油体的所欲产物(11mg，收率24％)。
ms(esi)m/z：1054.76(m+h)+。
实施例16：4-((2-(2-(3-(4-(6-(5-(1-甲基环丙氧基)-1h-吲唑-3-基)嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-3-氧代丙氧基)乙氧基)乙基)氨基)-2-(2-氧哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(16)的合成。
以与实施例8中的化合物8类似的方式制备化合物16。分离出呈黄色油体的所欲产物(5mg，收率16％)。
ms(esi)m/z：752.28(m+h)+。
实施例17：使用本发明化合物1的lrrk2细胞内降解作用。
此实验中的材料及方法如下所述：
所用细胞株：小鼠胚胎成纤维细胞(mouseembryonicfibroblast，mef)wt，于mefs中lrrk2纯合子敲入[r1441c；vps35n(d620n)；g2019s]
lrrk2降解物的测试浓度：0nm、10nm、30nm、100nm、300nm、1000nm。本发明化合物3所测试的额外浓度：2um、5um和10um。
完全生长培养基：dmem，补充有：10％的胎牛血清；1％的青霉素/链霉素；1％的l-谷氨酰胺；1％的mem非必需氨基酸溶液；1％的丙酮酸钠。
商业和内部纯化的抗体：
来自antibodies,inc.的小鼠抗lrrk2/震颤素(dardarin)抗体(cat#75-253)。
于邓迪大学(universityofdundee)纯化总lrrk2(udd3)和ps935-lrrk2(udd2)的兔单克隆抗体(如dzamko等人，plosone7(6)：e39132(2012)中所述)。
内参(loadingcontrol)：抗α-微管蛋白(cellsignalingtechnology#5174)；抗gapdh(santacruzbiotechnologycat#sc-32233)
(p)rab10抗体：兔抗rab10(磷酸t73)抗体[mjf-r21](ab230261)；小鼠mjff-总rab10单克隆抗体是由nanotools(www.nanotools.de)产生；兔总rab10来自cellsignalingtechnology(rab10(d36c4)
处理：将wtmef、r1441c、vps35n和g2019s突变体的细胞以相等的密度接种于6孔板中，最终体积为3ml完整生长培养基/孔。降解物在dmso中重组且以1:1000的比例使用于细胞中，即3μl/3ml。当细胞>60％汇合时开始处理，从48小时的时间点开始，接着为24小时的时间点，6小时的时间点，最后为1小时的时间点。
细胞裂解：吸出培养基，将板置于冰上，并使用杜氏磷酸盐缓冲液(dulbecco'sphosphate-bufferedsaline，dpbs)洗涤细胞。每孔添加含有50mm的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(tris-hcl)，ph值7.5、1％(v/v)的曲拉通x-100(tritonx-100)、1mm的乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-n,n,n',n'-四乙酸(egta)、1mm的正钒酸钠、50mm的naf、0.1％(v/v)的2-巯基乙醇、10mm的2-甘油磷酸酯、5mm的焦磷酸钠、0.1μg/ml的微囊藻毒素-lr(enzolifesciences)、270mm的蔗糖和完全不含edta的蛋白酶抑制剂混合物(sigma–aldrichcat#11836170001)的五十微升的冰冷裂解缓冲液。将裂解液于4℃下以20,817g(14,000rpm)离心15分钟，并将上清液使用bradford分析法(piercetmcoomassie(bradford)蛋白质分析试剂盒，thermoscientifictmcat#23200)进行蛋白质浓度的测定，并进行蛋白质印迹(westernblot)分析。
蛋白质印迹分析：将细胞裂解液与4xsds-page样品缓冲液[50mm的tris-hcl，ph值6.8、2％(w/v)的sds、10％(v/v)的甘油、0.02％(w/v)的溴酚蓝和1％(v/v)的2-巯基乙醇]混合，以达到1μg/μl的最终总蛋白浓度，并于95℃加热5分钟。将20微克℃样品与3μl℃bio-rad蛋白标记物(precisionplusproteintmallblueprestainedproteinstandards#1610373kda)装载至nupagetm的4至12％的bis-tris梯度凝胶(lifetechnologies)上，凝胶使用nupagetmmopssds运行缓冲液(lifetechnologies，cat#np0001-02)在110v下重复运行2小时30分钟。电泳后，将分离的蛋白质在90v下转移到硝酸纤维素膜(gehealthcare，amershamprotran0.45μm的nc)上90分钟。使用ponceaus染色剂简单地染色转移的膜，并分成3条，如早期fan等人，biochem.j.475:23-44(2018)中所描述。简而言之，将上条从膜的顶部切至75kda，中条的切割范围在75kda至30kda之间，而底部的条从30kda-切至膜底部。在室温下，使用溶解于(tbs-t)[20mm的tris-hcl，ph值7.5、150mm的nacl和0.1％(v/v)的
使用invitrogentm的adaptatm检测方法进行ic50实验。
图1中的结果显示本发明化合物1抑制s935和rab10的磷酸化，但未降解lrrk2。
实施例18：使用本发明化合物12的lrrk2的细胞内降解作用。
实验方案如实施例17。
图12中的结果显示本发明化合物2抑制s935以及rab10的磷酸化，但未降解lrrk2。
实施例19：使用本发明化合物3的lrrk2的细胞内降解作用。
实验方案如实施例17。
图3a中的结果显示本发明化合物3抑制s935以及rab10的磷酸化，但未降解lrrk2。于图3b中观察到通过本发明化合物的lrrk2(c-末端)的降解作用。
表1：本发明化合物1至3的ic50
ic50(nm)
本发明化合物1至3的ic50值纪录在上表中。
实施例20：使用本发明化合物4的lrrk2的细胞内降解作用。
实验方案如实施例17。
图4中的结果显示本发明化合物4抑制rab10的磷酸化以及降解lrrk2(c-末端)。未观察到本发明化合物对lrrk2(n-末端)的降解作用和对s935磷酸化的降解作用。
实施例21：使用本发明化合物5的lrrk2的细胞内降解作用。
实验方案如实施例17。
图5中的结果显示本发明化合物5抑制s935以及rab10的磷酸化，但未降解lrrk2。
实施例22：使用本发明化合物6的lrrk2的细胞内降解作用。
实验方案如实施例17。
图6中的结果显示本发明化合物6抑制rab10的磷酸化以及降解lrrk2(c-末端)。未观察到本发明化合物对lrrk2(n-末端)的降解作用和对s935磷酸化的降解作用。
实施例23：使用本发明化合物7的lrrk2的细胞内降解作用。
实验方案如实施例17。
图7中的结果显示本发明化合物7抑制rab10和s935的磷酸化以及降解lrrk2(c-末端)。未观察到本发明化合物7对lrrk2(n-末端)的降解作用。
实施例24：使用本发明化合物和阳性对照来那度胺和泊马利度胺进行细胞内crbn结合实验。
使用d300e数字分配器(hp)将atto565-来那度胺置换试验中的化合物分配到384孔微孔板(corning，4514)中，并标准化为1％的dmso为10nm的atto565-来那度胺、100nm的ddb1δb-crbn、50mm，ph值为7.5的三羟甲基氨基甲烷(tris)、200mm的nacl、0.1％的
图8中的所有本发明化合物都能够以类似于泊马利度胺和来那度胺的亲和力渗透细胞并结合crbn。
实施例25：使用吲唑的lrrk2的细胞内降解作用。
实验方案如实施例17。
图9a至9c中的结果显示所述吲唑，其为称为mli-2的化合物的类似物(请参阅美国第2016/0009689a1号专利公开案)抑制s935的磷酸化，但未增加lrrk2的水平。所述mli-2类似物例示于下列结构中。
实施例26：使用本发明化合物8的lrrk2的细胞内降解作用。
实验方案如实施例17。
图10a至图10c中的结果显示本发明化合物8抑制s935以及mli-2类似物的磷酸化，且亦降低lrrk2的总水平。
实施例27：使用本发明化合物9的lrrk2的细胞内降解作用。
实验方案如实施例17。
图11a至图11c中的结果显示本发明化合物9抑制s935以及mli-2类似物的磷酸化，且亦降低lrrk2的总水平。
实施例28：使用本发明化合物10的lrrk2的细胞内降解作用。
实验方案如实施例17。
图12a至图12c中的结果显示本发明化合物10抑制s935以及mli-2类似物的磷酸化。相较于化合物9，使用化合物10观察到较少的lrrk2降解作用。
实施例29：使用本发明化合物11的lrrk2的细胞内降解作用。
实验方案如实施例17。
图13a至图13c中的结果显示本发明化合物11抑制s935的磷酸化。亦观察到lrrk2的一些降解作用。
实施例30：使用本发明化合物11的lrrk2及lrrk2ps935的细胞内降解作用。
实验方案如实施例17。
图13a至图13c中的结果显示本发明化合物11抑制s935的磷酸化。亦观察到lrrk2的一些降解作用。
实施例31：使用本发明化合物12的lrrk2的细胞内降解作用。
实验方案如实施例17。
图14a至图14c中的结果显示本发明化合物12抑制s935的磷酸化。亦观察到lrrk2的微量降解作用。
实施例32：使用本发明化合物13的lrrk2的细胞内降解作用。
实验方案如实施例17。
图15a至图15d中的结果显示本发明化合物13抑制s935的磷酸化。亦观察到lrrk2的一些降解作用。
表2：本发明化合物8至11的ic50
ic50(nm)
本发明化合物8至13的ic50值纪录在上表中。结果显示，本发明化合物成功抑制wtlrrk2和s935的磷酸化。
表3：本发明化合物8至11的logp值
本发明化合物8至13的logp值列于上表中。
实施例33：使用本发明化合物14的lrrk2、lrrk2ps935和磷酸-rab(e826)的细胞内降解作用。
实验方案如实施例17。
图16a至图16d中的结果显示本发明化合物14抑制s935及rab(e826)的磷酸化。亦没有观察到lrrk2的降解作用。
实施例34：使用本发明化合物15进行lrrk2的细胞内降解作用。
图17a至图17d中的结果显示本发明化合物15抑制s935及rab(e826)的磷酸化。亦没有观察到lrrk2的降解作用。
实施例35：使用本发明化合物16作为阴性对照的lrrk2、lrrk2ps935和磷酸-rab(e826)的细胞内降解作用。
实验方案如实施例17。
图18a至图18d中的结果显示阴性对照16有效抑制ps935和prab10，但不降低lrrk2的水平，而阳性对照8显示相似的对ps935和prab10的抑制，且亦降解lrrk2。
所有专利公开案与非专利公开案均指示本领域人员的技术水平。所有这些公告案均以相同程度并入本文以作为参考，犹如每个单独公开案为具体且单独指示为通过引用并入一样。
虽然本文中已参考特定具体实例叙述本发明，惟应能理解的是，这些具体实例仅为说明本发明的原理与应用。因此，应了解的是，于不偏离由随附权利要求书所界定的精神与范围下，可对例示的具体实例进行许多修饰且可设计其它配置。
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