载体的制作方法

专利名称：载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种正链合成元件、该元件的应用及其在载体中的掺入。
详细地说，本发明涉及能够将一种所需核酸序列(在下文中缩写为“NOI”)——甚至一种以上NOIs——递送至目标部位的一种新型逆转录病毒载体。
此外，本发明还特别涉及一种可有效用于基因治疗的新型逆转录病毒载体。
基因治疗包括例如，在诸如靶细胞等一种或多种目标部位中进行一种或多种核酸序列的任何添加、取代、缺失、补充、操作等。如果目标部位为靶细胞，则这些细胞可以是组织或器官的一部分。有关基因治疗的一般知识可由《分子生物学》(Ed Robert Meyers，Pub VCH，如第556-558页)中获得。
作为更多实例，基因治疗还可提供一种方法，通过该方法中的任何一种或多种可使用一种诸如基因等核酸序列来取代或补充一种缺陷基因；可消除一种致病的诸如基因等核酸序列或其表达产物；可添加或引入一种诸如基因等核酸序列或其表达产物用于，例如，创建更有利的表型；可添加或引入一种诸如基因等核酸序列或其表达产物用于，例如，特定目的(即从非转化细胞中进行转化细胞等的挑选)；可从分子水平对细胞进行操作以处理、治疗或预防疾病——如癌症(Schmidt-Wolf and Schmidt-Wolf，1994，Annals of Hematology 69；273-279)或诸如免疫病症、心血管病症、神经性病症、炎性病症或传染性病症等其它疾病；可对抗原进行操作和/或引入以诱导某种免疫应答，如基因接种。
近几年已计划将逆转录病毒用于基因治疗。事实上，逆转录病毒为RNA病毒，其生活周期与裂解病毒不同。由此，逆转录病毒是一种通过DNA中间体进行复制的传染性实体。当逆转录病毒侵染细胞时，其基因组被一种逆转录酶转变成DNA形式。该DNA拷贝可作为模板用于产生新RNA基因组及传染性病毒颗粒组装所需的病毒编码蛋白。
逆转录病毒有许多种，其实例包括鼠白血病病毒(MLV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)、Fujinami肉瘤病毒(Fu-SV)、莫洛尼鼠白血病病毒(Mo-MLV)、FBR鼠骨肉瘤病毒(FBR MSV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)、Abelson鼠白血病病毒(A-MLV)、鸟骨髓细胞瘤病病毒-29(MC29)和鸟成红细胞增多病病毒(AEV)。
在Coffin et al(《逆转录病毒》1997 Cold Spring HarbourLaboratory Press EdsJM Coffin，SM Hughes，HE Varmus pp 758-763)中有逆转录病毒的详细列表。
逆转录病毒科基本上可细分为三个亚科肿瘤病毒、泡沫病毒和慢病毒。其所有的种类均为通过DNA中间体进行复制的正义RNA病毒。这种由RNA转变为DNA的过程是通过病毒pol基因的蛋白产物来进行的；即依赖于RNA的DNA聚合酶(逆转录酶)和RNase N。该过程的效率取决于病毒内包含的序列元件。这些元件通常包括两个同向重复，即R和tRNA引物结合位点(为第一链合成所需)，以及3’多聚嘌呤序列(3’PPT)(为第二链合成所需)。最近还发现了其它第二链合成元件(迄今仅在慢病毒中发现)；其中包括中央PPT(c-PPT)、中央终止序列(CTS)和U形盒(Llyinskii and Desrosiers 1998)。有关这些元件的功能以及第二链合成的近期综述可参考Coffin et al 1997。
在过去十年中，所有三个亚科的逆转录病毒均经过修饰以用作基因表达载体。这些修饰通常涉及必需病毒基因/序列的缺失以及利用外源启动子和/或特定cDNA将其取代。必需采用这种cDNA取代而不是缺失的原因有两点。首先，与野生型的相比，过大的病毒基因组不会被包装，其次，若没有必需基因，这些基因组将无法进行复制。从安全角度来看，第二点非常重要。因此，为了产生含有这些复制缺陷型基因组的逆转录病毒载体，必须提供反式的缺失基因(通常为gag、pol和env)。这一般可通过使用经设计后由非病毒表达载体表达这些基因的生产细胞来实现。这些生产细胞能够将载体基因组包装在逆转录病毒颗粒中，并且在受体细胞不含有来自，例如，辅助病毒的gag-pol和env的情况下，所得颗粒只能进行一轮的侵染。有关构建逆转录病毒表达载体的近期综述可参考Coffin et al 1997。
为了便于理解，下文给出RNA及DNA形式的逆转录病毒基因组的一般结构简图(不按比例)，其中指明了LTRs的基本部件及gag、pol与env的相对定位。病毒体RNA 逆转录酶 原病毒转录 转录本如上图所示，侵染性逆转录病毒的RNA基因组的基本分子组成为(5’)R-U5-gag，pol，env-U3-R(3’)。在缺陷型逆转录病毒载体基因组中，gag、pol和env可缺失或不具有功能。在其RNA两端的R区为重复序列。U5和U3分别表示RNA基因组5’和3’端的单一序列。
病毒体RNA是在细胞质中逆转录成双链DNA的，它涉及逆转录酶从模板分子5’端向3’端的两次跳跃。这两次跳跃导致病毒体RNA 5’及3’端序列的复制。然后病毒DNA两端的这些序列衔接融合，形成含有RU5及U3区的长末端重复(LTRs)。病毒DNA在逆转录完成后即转移到核内，在病毒整合酶的协助下，称为前整合复合物(PIC)的逆转录病毒基因组线性拷贝可随机插入到染色体DNA中，形成稳定的原病毒。宿主细胞基因组内可能整合的位点数量非常大，并且分布极为广泛。
原病毒的转录仍主要由病毒LTR的非编码序列调控。转录起始位点位于左侧LTR的U3和R交界处(如上图所示)，添加poly(A)(末端)的位点位于右侧LTR的R和U5交界处(如上图所示)。U3含有原病毒的大多数转录调控元件，其中包括对细胞甚至病毒的转录激活蛋白起反应的启动子和多增强子序列。某些逆转录病毒具有任意一种或多种以下基因，如tat、rev、tax和rex，这些基因可编码参与基因表达调控的蛋白。
原病毒DNA经转录产生全长的病毒基因组RNA分子，并通过RNA加工产生亚基因组大小的RNA分子。所有RNA产物一般都可作为产生病毒蛋白的模板。通过RNA转录本的剪接及翻译过程中的核糖体移码即可实现RNA产物的表达。
除gag、pol和env之外，复合逆转录病毒还含有编码附属蛋白或辅助蛋白的“附属”基因。附属蛋白或辅助蛋白是指除由常见复制基因或结构基因gag、pol和env编码的蛋白以外的由附属基因编码的那些蛋白。这些附属蛋白不同于参与基因表达调控的蛋白，例如由tat、rev、tax和rex编码的蛋白。附属基因的实例包括vif、vpr、vpx、vpu和nef。这些附属基因可在，例如，HIV中找到(可参考，例如，《逆转录病毒》Ed.Coffin et al Pub.CSHL 1997的第802和803页)。非必需附属蛋白可在特定类型的细胞中发挥作用，其功能至少可部分地复制由细胞蛋白提供的功能。附属基因一般位于pol和env之间，或刚好处在env下游，其中包括LTR的U3区，或是与部分env彼此相重叠。
第二代载体通常不含有这些附属基因，也不含有侧翼区和正链合成元件，但也可含有正链合成元件。
复合逆转录病毒已进化出既使用病毒编码的转录激活因子也使用细胞转录因子的调控机制。这些反式作用的病毒蛋白可作为由LTRs指导的RNA转录的激活因子。慢病毒的反式转录激活因子由病毒tat基因编码。Tat能够与一种稳定的RNA茎-环二级结构相结合，该结构被称为TAR，其功能之一似乎是使Tat定位于最佳位置以反式激活转录。
如前文所述，逆转录病毒已作为递送系统(或作为递送媒介物或递送载体加以表达)而特别用于将一种或一种以上NOIs转移到所需的一个或多个部位。这种转移可采用体外、先体外后体内、体内或其组合方式来进行。以这种方式使用的逆转录病毒一般称为逆转录病毒载体或重组逆转录病毒载体。逆转录病毒载体甚至被用来研究逆转录病毒生命周期的不同方面，其中包括受体使用、逆转录和RNA包装(综述见Miller，1992 Curr Top Microbiol Immunol 1581-24)。
在用于基因治疗的典型的重组逆转录病毒载体中，至少可将一种或多种gag、pol及env蛋白编码区的一部分从病毒中去除。这可使逆转录病毒载体成为复制缺陷型。甚至还可以用一种NOI来取代去除的部分，以产生一种能够将其基因组整合到宿主基因组中但经过修饰的该病毒基因组由于缺乏结构蛋白而不能自我繁殖的病毒。当NOI整合到宿主基因组中后即可表达——从而产生，例如，治疗和/或诊断效应。因此，将一种NOI转移到所需部位的实现一般是通过将该NOI整合到重组病毒载体中；将经过修饰的该病毒载体包装到病毒外壳中；并且对所需部位——如一种靶细胞或一种靶细胞群体——进行转导。
通过包装细胞系或辅助细胞系与重组载体的结合使用，可增殖并分离出大量的逆转录病毒载体(例如来制备适当效价的逆转录病毒载体)，用于随后的，例如，对所需部位的转导。
在某些情况下，增殖和分离需要分离出逆转录病毒的gag、pol和env基因并将其各自引入到一种宿主细胞中，以产生“包装细胞系”。包装细胞系可产生逆转录病毒DNA包装所需的蛋白，但由于缺乏psi区而不会引起壳体化。但如果把带有NOI和psi区的重组载体引入该包装细胞系，则辅助蛋白可包装psi-阳性重组载体并产生重组病毒原种。这可用来转导细胞，将NOI引入细胞的基因组。基因组中缺乏所有制备病毒蛋白所需基因的重组病毒只能转导一次，并且不能增殖。这些只能对靶细胞进行单回合转导的病毒载体被称为复制缺陷型载体。因此，NOI是在不产生具有潜在危害的逆转录病毒的情况下被引入到宿主/靶细胞的基因组中。在《逆转录病毒》(1997 Cold SpringHarbour Laboratory Press EdsJM Coffin，SM Hughes，HE Varmus pp449)中有可使用包装细胞系的一览表。
逆转录病毒包装细胞系的设计经过发展已解决了同时产生辅助病毒的特别问题，而该问题在早期的设计中经常遇到。由于同源会极大促进重组的产生，因此载体基因组与辅助细胞间同源性的降低或消除使辅助病毒产生的问题得以缓解。最近开发出了一些包装细胞，该细胞中的gag、pol和env病毒编码区由独立转染到包装细胞系中的不同表达质粒分别携带，从而具备了产生野生型病毒所需的三种重组事件。这样会减少可复制病毒产生的可能性。这种策略有时被称为三质粒转染法(Soneoka et al.1995 Nucl.Acids Res.23628-633)。
在产生载体时也可利用瞬时转染法来测定载体的产生。瞬时转染方法无需利用较长时间来产生稳定产载体细胞系，并且可在载体或逆转录病毒包装组件对细胞有毒性时采用。通常用来产生逆转录病毒载体的组件包括一种编码Gag/Pol蛋白的质粒、一种编码Env蛋白的质粒和一种含有NOI的质粒。载体的产生涉及把一种或多种这些组件瞬时转染到含有其它所需组件的细胞中。若载体编码的基因具有毒性或能够干扰宿主细胞的复制，如细胞周期抑制剂或诱导凋亡的基因，则产生稳定产载体细胞系会很困难，而瞬时转染方法可在细胞死亡之前用来产生该载体。此外，利用瞬时转染方法也获得了产载体效价水平与稳定产载体细胞系相当的细胞系(Pear et al 1993，Proc Natl AcadSci 908392-8396)。
对基因递送而言，产生高效价载体是困难之一。一些产生高效价载体用于基因递送的替代方法包括，使用(i)缺陷型病毒载体如腺病毒、腺伴随病毒(ATT)、疱疹病毒和痘病毒，以及(ii)经修饰的逆转录病毒载体。
目前我们已发现，有可能使载体的功能得到改善，尤其是产生高效价载体。
首先，本发明提供一种侧翼多聚嘌呤段(F-PPT)序列或其衍生物、变异体或同源物。
我们认定了该区域并认为，它可用于有良好效能的载体。
根据本发明的F-PPT序列实例包括序列编号1-7。
其次，本发明提供逆转录病毒正链合成因子在改变逆转录病毒载体或逆转录病毒载体颗粒的转导能力方面的应用。
该能力可包括提高转导效率。
用于在本发明中使用的正链合成因子的实例包括PPT，其中包括3’PPT、c-PPT、CTS、U形盒、F-PPT及其衍生物、变异体和同源物。
第三，本发明提供逆转录病毒正链合成因子在提高逆转录病毒载体效价的应用。
第四，本发明提供一种缺乏一种或多种附属基因的逆转录病毒载体，其特征在于含有一种正链合成因子。
优选的载体应是“基于逆转录病毒的”，其含意是该载体的颗粒来源于一种逆转录病毒。载体颗粒基因组含有来自慢病毒的组件并以此为主链。整个载体颗粒可含有与RNA基因组相容的必需载体组件，其中包括逆转录系统及整合系统。这些系统一般包括来源于逆转录病毒的gag和pol蛋白。优选的载体应能够转导一种靶细胞。这一般包括来源于逆转录病毒的env蛋白。在一项特别优选实施方案中，该载体是“基于慢病毒的”。
优选的载体应是“最小化的”，这是指来源于HIV-1辅助基因或其它逆转录病毒类似辅助基因的vpr、vif、vpu、tat、nef基因中至少有一种被去除或破坏。优选的是所有基因均缺失。优选而言，应具有rev基因或类似基因或在功能上类似的系统。有关该系统的更多细节可参考我们的WO98/17815。
第五，本发明提供一种逆转录病毒载体，该载体能够递送NOI，并且含有一种外源的正链合成因子。
我们目前已发现，正链合成因子可用来改善缺乏或具有野生型正链合成因子的载体的功能。
载体某些方面的功能被改变的事实可通过带有和不带有本发明所用正链合成因子时的功能的比较来加以测定。该测定方法将在下文实施例中说明。
我们目前已发现，有可能使载体的产量提高，例如，至少提高100倍。这很令人惊讶，因为在当前通用的载体中一般有至少一种本发明所述优选正链合成因子被去除，其中也包括所谓的附属基因，而最小化载体被认为与通常含有这些附属部件的第一代载体相比具有优势。此前对可在本发明中使用的一些正链合成因子已做过描述；但当时并没有人意识到它们可用来产生改良型载体。
当病毒颗粒进入靶细胞的细胞质时即开始进行逆转录。病毒RNA基因组是作为一种核蛋白复合物的一部分而进入细胞质的，该复合物目前仍未被充分地了解。逆转录过程借助一系列的复杂步骤可在细胞质中产生线性DNA双螺旋。该DNA与其RNA模板呈线性对应，但其末端含有病毒RNA中不存在的重复区，称为长末端重复(LTRs)。现有的逆转录模型认为，LTRs的产生需要有两次特定的模板转换，称为链转移反应或“跳跃”。
逆转录病毒的DNA合成完全依赖于两种不同的酶活性，即RT一种能够以RNA或DNA为模板的DNA聚合酶，和一种对RNADNA双螺旋中的RNA链具有特异性的称为核糖核酸酶H(RNase H)的核酸酶。尽管不能排除其它蛋白的作用，并且某些病毒蛋白(如核壳体，NC)有可能会提高逆转录的效率，但为了完成逆转录病毒DNA产生过程中涉及的系列步骤而必需的所有酶功能均可归因于RT的DNA聚合酶或RNaseH。逆转录病毒的DNA合成过程被认为是按照下列方案进行的1.负链DNA合成的启动是以部分解旋的转移RNA的3’端为引物，它能够与基因组RNA中的引物结合位点(PBS)退火。负链DNA合成持续进行，直至基因组RNA的5’端，从而产生长度不同的DNA中间体，称为负链强终止DNA(-sssDNA)。由于tRNA引物结合位点靠近病毒RNA的5’端，因此-sssDNA相对较短，约100-150个碱基。
2.然后在RNase-H的介导下降解RNA-sssDNA双螺旋中的RNA链，第一次链转移导致-sssDNA与病毒基因组RNA的3’端退火。此次转移是由称为重复(R)序列的存在于基因组RNA 5’及3’端的相同序列来介导。-sssDNA的3’端是由位于病毒基因组5’端的R序列拷贝而来，因此含有与R互补的序列。当RNA模板被去除后，-sssDNA即能够与RNA基因组3’端的R序列退火。NC似乎可促进该退火反应。
3.一旦-sssDNA被转移到病毒RNA 3’端的R区段，负链DNA合成即重新开始，同时伴有RNase H对模板链的消化。但该降解并不完全。
4.RNA基因组中含有一种短多聚嘌呤段(PPT)，它相对而言可抵抗RNase H的降解。一种来源于PPT的特定RNA片段可启动正链DNA的合成。当一部分引物tRNA被逆转录后，正链合成即停止，并产生一种称为正链强终止DNA(+sssDNA)的DNA。尽管所有逆转录病毒株均可由PPT产生一种特定的正链引物，但某些病毒还可由RNA基因组产生额外的正链引物。
5.RNase H将引物tRNA去除，暴露出+sssDNA中与正链DNA 3’端序列或其附近序列互补的序列。
6.+sssDNA和负链DNA中的互补PBS区段退火，构成第二次链转移。
7.然后各以DNA的正链和负链为模板合成其它链，从而完成正链与负链的合成。
我们所说的正链合成因子是指对正链DNA合成起作用的病毒RNA。
正链有时被称为第二链，而正链DNA的符号为+sssDNA。应该了解的是，本发明还包括亦被称为顺式作用元件的那些因子。
对正链合成起作用的RNA可以是衍生出用于正链DNA合成的引物的RNA，也可以是与其相关的RNA。优选而言，该RNA应能够抵抗RNase的降解。作为选择，正链合成因子也可以是一种顺式作用终止序列，即一种参与正链有效合成的序列。
优选的该RNA应能够衍生出一种用于第二链DNA合成的引物。就此而言，一项实施方案中的RNA是一种称为多聚嘌呤段(PPT)的区段，其名称即反应出它的碱基组成。尽管PPT的碱基组成十分保守，但其序列随病毒的不同而不同，所有这些序列均被包括在本发明中。
一些逆转录病毒——尤其是HIV和ALVs——还使用额外的内部正链引物，这些引物也可来源于病毒RNA。衍生出这些内部引物的RNA亦处于本发明的范围之内。
这些内部引物的实例包括中央PPT(c-PPT)、中央终止序列(CTS)和U形盒。
应了解的是，本发明的载体可包含一种以上的外源正链合成因子。此时的合成因子可以相同，也可以不同。
我们所说的“外源”包括带有修饰的或附加的正链合成因子的逆转录病毒。另外还包括野生型正链合成因子的替代物。正链合成因子可来源于其载体所基于的原病毒，或来源于由病毒连续传代演变或随机诱变研究而筛选出的其它任何人工设计的逆转录病毒。因此，本发明还包括这些因子的衍生物。另外，本发明还包括这些因子的变异体和同源物。
与本发明所述核苷酸序列相关的“变异体”、“同源物”或“衍生物”包括，对该序列任意取代、变异、修饰、替换、缺失或添加一种(或多种)核酸后所得的序列，条件是该所得序列具有正链合成序列的活性，优选的是具有至少与序列编号1-18之一的序列相同的活性。
就序列同源性而言，优选的是与文中所列序列的同源性至少为75％，更优选的则至少为85％，更优选的则至少为90％。更优选的为至少95％的同源性，更优选的则为至少98％的同源性。核苷酸同源性比较可如上文所述进行。优选的序列同源性比较程序为上文所述的GCGWisconsin Bestfit程序。默认的计分母值是，各相同核苷酸的匹配值为10，误配值为-9。各核苷酸的默认缺口形成补偿值为-50，默认缺口外延补偿值为-3。
本发明还包括能够与文中所示序列杂交的核苷酸序列，或其任何变异体、片段或衍生物，或以上的互补体。
文中使用的术语“杂交”包括“一条核酸链通过碱基配对与互补链结合的过程”，也包括按聚合酶链反应技术实施的扩增过程。
能够与文中所示核苷酸序列杂交的本发明所述多聚核苷酸或其互补体一般与文中所示的相应核苷酸序列具有至少70％的同源性，优选的为至少80％或90％的同源性，更优选的为至少95％或98％的同源性。
如Berger and Kimmel(1987，酶学方法中的分子克隆技术指南，第152卷，Academic Press，San Diego CA)所述，杂交条件以核酸结合复合物的解链温度(Tm)为基础，从而产生了如下文所示的特定“严格条件”。
最严格条件通常约为Tm-5℃(比探针的Tm低5℃)；高严格条件约比Tm低5℃-10℃；中等严格条件约比Tm低10℃-20℃；低严格条件约比Tm低20℃-25℃。该领域的技术人员都将了解，最严格条件的杂交可用来鉴定或检测完全相同的多聚核苷酸序列，而中等(或低)严格条件的杂交可用来鉴定或检测相似的或相关的多聚核苷酸序列。
作为优选方面，本发明包括能够在严格条件下(如65℃和0.1×SSC(1×SSC＝0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠，pH7.0))与本发明所述核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
不与本发明所述序列100％同源但处于本发明范围之内的多聚核苷酸可通过多种方法来获得。文中所述序列的其它变异体可通过，例如，DNA库探测的方法获得。此外还可获得其它病毒同源物，特别是在，例如，大鼠、小鼠、牛和灵长类动物中发现的同源物，这些同源物及其片段一般能够与文中所列序列中显示的序列选择性杂交。这些序列可通过cDNA或基因组库探测以及在中高严格条件下使用所有序列编号1-18或其部分对这些库进行探测而获得。本发明所述核苷酸序列的种间同源物及等位变异体的获得也可采用类似的方法。
变异体及品系间/种间同源物也可利用变性PCR方法来获得，该方法使用的引物经过设计可针对变异体和同源物中编码本发明所述序列内的保守氨基酸的序列。保守序列可通过，例如，不同变异体/同源物的氨基酸序列排列来加以预测。序列排列可采用该领域已知的计算机软件来实现。如GCG Wisconsin PileUp程序即被广泛使用。
简并性PGR中使用的引物含有一个或多个简并性部位，并且其采用的严格条件应低于用单一序列引物对已知序列进行克隆所使用的严格条件。
作为选择，这些多聚核苷酸还可通过特定序列，如序列编号1-18，的定点诱变来获得。
本发明的多聚核苷酸可用来产生一种引物，如PCR引物、用于交替扩增反应的引物，一种探针，如使用放射性或非放射性标记以传统方法标记上显示标记的探针。
本发明的核酸序列和探针可通过重组、合成或该领域技术人员可使用的任何方法来产生。它们还可利用常规技术来进行克隆。
一般而言，引物是通过合成方法产生的，该方法涉及一次添加一个核苷酸而逐步产生所需的核酸序列。用自动化技术来实现这一点的方法很容易由该领域获得。
较长的多聚核苷酸一般是利用重组方法产生的，例如可使用PCR(聚合酶链反应)克隆技术。
衍生的或合成的元件因子是否仍为正链合成因子可利用，例如，实施例1所述的方法来加以检测。
在一项实施方案中，该合成因子为衍生出正链引物的RNA的侧翼区。本发明还包括可使用的第二链序列。
特别优选的正链合成因子的一个实例为逆转录病毒表达载体中3’PPT侧翼的一段功能性区域。我们把该区域称为侧翼PPT(F-PPT)。该区域此前并未被认为是逆转录病毒表达中的功能性区域。
该F-PPT的实例如图2及序列编号1-7所示。
本发明的理论基础是正链合成对载体的最佳功能有重要作用，尽管不希望受该理论的任何约束，但通过对能够与第二链合成所需的任何顺式作用元件相互作用的反式作用蛋白的修饰也可增强该合成。
因此，作为第六方面，本发明提供一种逆转录病毒载体包装细胞或细胞系，或含有一种外源反式作用因子的一种逆转录病毒载体表达质粒或表达盒。
优选的该因子为pol。
我们再次提到的“外源”包括修饰的或附加的反式作用因子。另外还包括野生型反式作用因子的替代物。反式作用因子可来源于其载体所基于的原病毒，或来源于由病毒连续传代演变或随机诱变研究而筛选出的其它任何人工设计的逆转录病毒。因此，本发明还包括这些因子的衍生物。另外还包括通过，例如，诱变获得的这些因子的衍生物。
本发明的载体一般为缺陷型，因为它不能自主复制。因此，当第一代病毒载体组件转导到第一代靶细胞中时不能通过复制而扩散到其它任何靶细胞中。同样，若第二代载体组件的作用是充当NOI的载体，那么当第二代病毒载体组件转导到第二代靶细胞中时也不能通过复制而扩散到其它任何靶细胞中。产生复制缺陷型逆转录病毒载体的方法已为该领域所了解。举例来说，在此情况下，降低第二代病毒载体组件的LTR’s之间的同源性也将具有降低通过基因重组产生可自主复制的侵染性病毒的可能性的作用。
作为一种优选方式，本发明的逆转录病毒载体已被假型化。在这一点上，假型化可产生一种或多种优势。举例来说，就慢病毒载体而言，基于HIV的载体的env基因产物可限制这些载体仅侵染能够表达CD4蛋白的细胞。但如果这些载体中的env基因被来源于其它RNA病毒的env序列所取代，那么它们将具有更宽的侵染谱(Verma and Somia 1997Nature 389239-242)。作为示例，工作人员用来源于VSV的糖蛋白对基于HIV的载体进行了假型化(Verma and Somia 1997，同上)。作为选择，也可对env进行修饰以影响(如改变)其特异性。
作为另一选择，该Env蛋白可以是一种修饰的Env蛋白，如一种突变的或改造的Env蛋白。所进行的或选定的修饰可用来引入特定的功能或用来降低毒性或用于其它目的。
适当的NOI编码序列包括具有治疗和/或诊断用途的那些序列，例如，但不局限于细胞因子、趋化因子、激素、抗体、改造的免疫球蛋白样分子、单链抗体、融合蛋白、酶、免疫辅助刺激分子、免疫调节分子、反义RNA、靶蛋白的转优势阴性突变体(transdominant negativemutant of a target protein)、毒素、条件毒素、抗原、肿瘤抑制蛋白及生长因子、膜蛋白、血管活性蛋白及肽、抗病毒蛋白和核糖酶，以及其衍生物(如带有一种结合的报告基团)的编码序列。当加入这些编码序列时，通常可经操作使其与适当的启动子相连接，该启动子可以是一种驱动核糖酶表达的启动子，或是一种不同的启动子或多种启动子。
NOI编码序列可编码一种融合蛋白或是编码序列的一个片段。
本发明的逆转录病毒载体可用来将诸如前体药物活化酶等NOI递送至肿瘤部位，用来对癌症进行治疗。此时可将适当的前体药物与适当的前体药物活化酶一同用于对个体(如一名患者)的治疗。适当的前体药物可与载体一同给药。前体药物的实例包括磷酸鬼臼亚乙苷(etoposide phosphate)(与碱性磷酸酶，Senter et al 1988 Proc NatlAcad Sci 854842-4846)；5-氟胞嘧啶(与胞嘧啶脱氨酶，Mullen et al1994 Cancer Res 541503-1506)；阿霉素-N-p-羟基苯氧基乙酰胺(与青霉素-V酰胺酶，Kerr et al 1990Cancer Immunol Immunother31202-206)；对-N-二(2-氯乙基)氨基苯甲酰谷氨酸(与羧肽酶G2)；头孢菌素氮芥氨基甲酸酯(与β-内酰胺酶)；SR4233(与P450还原酶)；更昔洛韦(与HSV胸苷激酶，Borrelli et al 1988 Proc Natl Acad Sci857572-7576)；芥子前体药物与硝基还原酶(Friedlos et al 1997 JMed Chem 401270-1275)以及环磷酰胺(与P450，Chen et al 1996 CancerRes 561331-1340)。
本发明的逆转录病毒载体、正链合成因子和反式作用因子可由任何已知的或发现的逆转录病毒中获得。为了便于参考，表1给出逆转录病毒的分离；表2给出主要的逆转录病毒及其来源；表3列出主要的慢病毒。这些表均可在如上的Coffin JM et al中找到。
优选的载体可由慢病毒基因组获得。
载体可被赋予定向性，即与天然病毒相比具有不同的组织向性，以使该载体定向于特定的细胞。
第七方面，本发明提供一种逆转录病毒生产系统，用来产生本发明所述逆转录病毒载体，该系统含有编码该逆转录病毒载体的一种核酸序列。
第八方面，本发明提供一种由本发明所述生产系统产生的逆转录病毒载体。
第九方面，本发明提供一种由本发明所述逆转录病毒载体获得的逆转录病毒颗粒。
术语“逆转录病毒载体颗粒”是指包装的逆转录病毒载体，优选的应能够结合并进入靶细胞。与已讨论的载体相同，该颗粒的组件可相对于野生型逆转录病毒而加以修饰。举例来说，可对该颗粒的蛋白质外壳中的Env蛋白进行遗传修饰，以改变其定向特异性或实现其它某些所需的功能。
第十方面，本发明提供一种用本发明所述逆转录病毒载体转染或转导的细胞。
第十一方面，本发明提供本发明所述逆转录病毒载体，或逆转录病毒颗粒，或细胞在医学中的应用。
利用本发明的载体系统递送一种或多种治疗基因的方法可单独使用或与其它治疗或治疗成分一同使用。
举例来说，本发明的逆转录病毒载体可用来递送一种或多种能够有效治疗WO-A-98/05635所列病症的NOI(s)。为了便于参考，这里给出其列表的一部分癌症、炎症或炎性疾病、皮肤病、热病、心血管疾病、出血、凝固性疾病和急性期反应、恶病质、厌食症、急性感染、HIV感染、休克状态、移植物对宿主反应、自身免疫病、多次灌注损伤、脑膜炎、偏头痛和阿司匹林依赖性抗血栓形成；肿瘤生长、侵袭与扩散、血管形成、转移、恶性化、腹水和恶性肿瘤性胸腔积液；脑缺血、缺血性心脏病、骨关节炎、类风湿性关节炎、骨质疏松症、哮喘、多发性硬化症、神经退行性疾病、阿尔茨海默病、动脉粥样硬化、中风、脉管炎、节段性肠炎和溃疡性结肠炎；牙周炎、牙龈炎；银屑病、特应性皮炎、慢性溃疡、大疱性表皮松解症；角膜溃疡、视网膜病变和外科伤口愈合；鼻炎、变应性结膜炎、湿疹、过敏反应；再狭窄、充血性心力衰竭、子宫内膜异位、动脉粥样硬化或内硬化。
此外，或作为选择，本发明的逆转录病毒载体可用来递送一种或多种能够有效治疗WO-A-98/07859所列病症的NOI(s)。为了便于参考，这里给出其列表的一部分细胞因子和细胞增殖/分化活性；免疫抑制或免疫刺激活性(如用于治疗免疫缺陷，其中包括人免疫缺陷病毒感染；用于调节淋巴细胞生长；用于治疗癌症和多种自身免疫疾病，以及用来防止移植排异或诱导肿瘤免疫)；调节血细胞生成，例如，治疗髓细胞或淋巴细胞疾病；促进硬骨、软骨、肌腱、韧带和神经组织的生长，例如，用于伤口愈合、灼伤、溃疡和牙周疾病以及神经退行性疾病的治疗；抑制或激活促卵泡激素(生育力调节)；趋化性/趋化因子活性(例如，用来动员特定类型的细胞到损伤或感染部位)；止血和血栓溶解活性(例如，用来治疗血友病和中风)；抗炎活性(用来治疗，例如，感染性休克或节段性肠炎)；作为抗微生物剂；诸如代谢或行为的调节剂；作为止痛剂；治疗特定的缺陷病症；在人或兽类医学中用于，例如，银屑病的治疗。
此外，或作为选择，本发明的逆转录病毒载体可用来递送一种或多种能够有效治疗WO-A-98/09985所列病症的NOI(s)。为了便于参考，这里给出其列表的一部分巨噬细胞抑制活性和/或T细胞抑制活性以及抗炎活性；抗免疫活性，即对细胞免疫应答和/或体液免疫应答的抑制效应，其中包括与炎症无关的应答；抑制巨噬细胞和T细胞与细胞外基质成分及粘连蛋白相结合的能力以及T细胞中受增量调节的fas受体表达；抑制不必要的免疫反应和炎症，如关节炎，其中包括类风湿性关节炎，过敏性相关炎症、变态反应、哮喘、系统性红斑狼疮、胶原病和其它自身免疫疾病、动脉粥样硬化相关炎症、动脉硬化、动脉粥样硬化性心脏病、多次灌注损伤、心脏停搏、心肌梗塞、血管炎性病症、呼吸窘迫综合症或其它心肺疾病、消化性溃疡相关炎症、溃疡性结肠炎和其它胃肠道疾病、肝纤维化、肝硬化或其它肝脏疾病、甲状腺炎或其它腺性疾病、肾小球肾炎或其它肾疾病和泌尿系疾病、耳炎或其它耳-鼻-喉科疾病、皮炎或其它皮肤疾病、牙周疾病或其它牙疾病、睾丸炎或附睾-睾丸炎、不育症、睾丸创伤或其它免疫相关性睾丸疾病、胎盘功能障碍、胎盘功能不全、习惯性流产、子痫、先兆子痫和其它与免疫和/或炎症相关的妇科疾病、后葡萄膜炎、中间葡萄膜炎、前葡萄膜炎、结膜炎、脉络膜视网膜炎、葡萄膜视网膜炎、视神经炎、眼内炎症，如视网膜炎或囊样黄斑水肿、交感性眼炎、巩膜炎、色素性视网膜炎、退行性眼底疾病的免疫和炎症部分、眼创伤的炎症部分、由感染引起的眼炎、增生性玻璃体视网膜病变、急性局部缺血性视神经病变、结瘢过度，如青光眼滤过手术后的结瘢过度、对眼植入物的免疫反应和/或炎症反应以及与免疫和炎症相关的眼疾病、与中枢神经系统(CNS)或其它任何器官内的自身免疫疾病或病情或病症相关的炎症中对免疫和/或炎症进行抑制可带来好处的炎症、帕金森病、由帕金森病治疗导致的并发症和/或副作用、AIDS相关性痴呆复合HIV相关性脑病、德维克病、西德纳姆舞蹈病、阿尔茨海默病和其它CNS退行性疾病、病情或病症、斯托克斯病的炎症部分、脊髓灰质炎后综合症、精神疾病的免疫和炎症部分、脊髓炎、脑炎、亚急性硬化性全脑炎、脑脊髓炎、急性神经障碍、亚急性神经障碍、慢性神经障碍、Guillaim-Barre综合症、西德纳姆舞蹈病、重症肌无力、脑假瘤、唐氏综合症、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化症、CNS受压或CNS创伤或CNS感染的炎症部分、肌肉萎缩及营养不良的炎症部分，以及与免疫和炎症相关的中枢神经系统与周围神经系统疾病、病情或病症、创伤后炎症、感染性休克、传染病、外科手术的炎性并发症或副作用、骨髓移植或其它移植的并发症和/或副作用、基因治疗导致的炎性和/或免疫性并发症及副作用，如由病毒载体感染导致，或与AIDS相关的炎症，借此来排除或抑制体液免疫应答和/或细胞免疫应答，通过减少单核细胞或淋巴细胞的数量来治疗或改善单核细胞或白细胞增生性疾病，如白血病，从而预防和/或治疗在移植诸如角膜、骨髓、器官、晶状体、起搏器、天然或人造皮肤组织等天然或人造细胞、组织或器官情况下的移植物排斥反应。
本发明还提供一种药用组合物，用于通过基因疗法对个体进行治疗，其中该组合物含有治疗有效剂量的本发明所述含有一种或多种可递送的治疗性和/或诊断性NOI(s)的逆转录病毒载体或由该载体产生或获得的病毒颗粒。该药用组合物可用于人或动物。内科医生一般都能够确定最适合于个体的实际剂量，该剂量将随特定个体的年龄、体重和反应的不同而不同。
该组合物可选择性地含有一种药用载体、稀释剂、赋形剂或佐剂。药用载体、赋形剂或稀释剂的选择可根据预定的给药途径和标准的药学实践来确定。该药用组合物可含有作为载体、赋形剂或稀释剂的——或是除此以外的——任何适当的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、涂层剂、增溶剂和能够协助或促进病毒进入目标部位的其它载剂(例如一种脂类递送系统)。
在适当情况下，该药用组合物可采用任意的以栓剂或阴道栓剂形式吸入给药、通过使用皮肤贴剂，以洗剂、溶液、乳膏剂、软膏剂或撒粉剂的形式局部给药、以含有诸如淀粉或乳糖等赋形剂的片剂形式，或单独或与赋形剂混合置于硬胶囊或胚珠内(ovule)的形式，或以含有调味剂和着色剂的酏剂、溶液或悬浮液形式口服给药，或可进行胃肠外注射，如海绵体内、静脉内、肌内或皮下注射。就胃肠外给药而言，该组合物的最佳使用形式为无菌的水性溶液，溶液中可包含其它物质，如含有足以使该溶液与血液等张的盐或单糖。对颊部给药或舌下给药而言，该组合物可采用以传统方式配制的片剂或锭剂形式给药。
利用本发明的载体系统递送一种或多种治疗基因的方法可单独使用或与其它治疗或治疗成分一同使用。可治疗的疾病包括，但不局限于癌症、神经性疾病、遗传性疾病、心脏病、中风、关节炎、病毒感染和免疫系统疾病。适当的治疗基因包括编码肿瘤抑制蛋白、酶、前体药物活化酶、免疫调节分子、抗体、改造的免疫球蛋白样分子、融合蛋白、激素、膜蛋白、血管活性蛋白或肽、细胞因子、趋化因子、抗病毒蛋白、反义RNA及核糖酶的那些基因。
在本发明所述治疗方法的一项优选实施方案中，是利用本发明的载体系统将编码前体药物活化酶的一种基因递送至肿瘤部位，然后用适当的前体药物对个体进行处理。前体药物的实例包括磷酸鬼臼亚乙苷(与碱性磷酸酶配用，Senter et al 1988 Proc Natl Acad Sci854842-4846)；5-氟胞嘧啶(与胞嘧啶脱氨酶配用，Mullen et al 1994Cancer Res 541503-1506)；阿霉素-N-p-羟基苯氧基乙酰胺(与青霉素-V酰胺酶配用，Kerr et al 1990Cancer Immunol Immunother31202-206)；对-N-二(2-氯乙基)氨基苯甲酰谷氨酸(与羧肽酶G2配用)；头孢菌素氮芥氨基甲酸酯(与β-内酰胺酶配用)；SR4233(与P450还原酶配用)；更昔洛韦(与HSV胸苷激酶配用，Borrelli et al 1988Proc Natl Acad Sci 857572-7576)；芥子前体药物与硝基还原酶配用(Friedlos et al 1997 J Med Chem 401270-1275)以及环磷酰胺或异环磷酰胺(与细胞色素P450配用，Chen et al 1996 Cancer Res561331-1340)。
第十二方面，本发明提供本发明所述逆转录病毒载体、或逆转录病毒颗粒、或细胞在提高转导效率方面的应用。
第十三方面，本发明提供本发明所述逆转录病毒载体、或逆转录病毒颗粒、或细胞在改变该载体的转导能力方面的应用。例如，本发明的载体可具有转导非分裂细胞的能力，这与其对应的野生型载体不同。
第十四方面，本发明提供本发明所述逆转录病毒载体、或逆转录病毒颗粒、或细胞在促进正链合成方面的应用。
第十五方面，本发明提供本发明所述逆转录病毒载体、或逆转录病毒颗粒、或细胞在提高载体效价方面的应用。
第十六方面，本发明提供本发明所述逆转录病毒载体、或逆转录病毒颗粒、或细胞在产生一种药用组合物以将NOI递送至需要该NOI的目标部位方面的应用。
第十七方面，本发明提供一种方法，该方法包括用本发明所述逆转录病毒载体、或逆转录病毒颗粒、或通过使用本发明的细胞对一种细胞进行转染或转导。
第十八方面，本发明提供一种递送系统，该系统采用本发明所述逆转录病毒载体、或逆转录病毒颗粒、或细胞的形式。
第十九方面，本发明提供一种用于本发明所述逆转录病毒载体或逆转录病毒颗粒、或细胞的递送系统，其中该递送系统含有一种非逆转录病毒表达载体、一种腺病毒和/或一种质粒。
本发明的载体可利用一种病毒或非病毒载体递送至目标部位。
正如该领域技术人员所熟知的，载体是一种可用来或有助于将某一主体由一种环境转移至另一种环境的工具。举例来说，在DNA重组技术中使用的某些载体可用来将实体，如一种DNA片段(例如异源cDNA片段等异源DNA片段)，转移到靶细胞中。任选，一旦载体进入靶细胞，即可用来维持该细胞内的异源DNA，或作为一种DNA复制单位。DNA重组技术中使用的载体的实例包括质粒、染色体、人工染色体或病毒。
非病毒递送系统包括DNA转染方法，但并不局限于此。这里的转染包括用一种非病毒载体将基因递送到哺乳动物靶细胞中的过程。
转染方法一般包括电穿孔、DNA轰击、脂类介导的转染、致密DNA介导的转染、脂质体法、免疫脂质体法、脂转染、阳离子制剂介导的转染、阳离子表面两亲体法(CFAs)(Nature Biotechnology 199614556)以及这些方法的组合。
病毒递送系统包括，但不局限于，腺病毒载体、腺-相关病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体。其它载体实例还包括先体外后体内(ex vivo)递送系统，该系统包括，但不局限于，DNA转染方法，如电穿孔、DNA轰击、脂类介导的转染、致密DNA介导的转染等。
本发明还可使用该领域技术人员所了解的标准分子生物学技术。这些技术在文献中均有详细描述。例如，可参考Sambrook et al(1989)分子克隆实验手册；Hames and Glover(1985-1997)DNA克隆实验方法，I-IV卷(第二版)。
现在将利用实施例的方法对本发明做进一步的描述，其中涉及到以下图表

图1显示从基于MLV的表达盒中去除侧翼PPT序列对效价的影响；以及图2显示可在本发明中使用的正链合成因子的实例；和简并因子的实例。
更详细地说图1A从基于MLV的表达盒中去除侧翼PPT序列对效价的影响——野生型MLV原病毒与两种衍生表达载体的序列排列比较。在原病毒中，终止密码子(以黑体字显示)使包膜的翻译终止；在表达载体中，该终止密码子使neo的翻译终止。在原病毒序列中，假定的U形盒以小写黑体字显示，加下划线的为3’PPT。病毒的产生及X-gal染色按前人所述进行(Soneoka et al 1995)。图1B和C显示，加入侧翼PPT活性序列可极大提高基于MLV的表达载体的效价(约100倍)。图1B和C为10□1病毒稀释度时经X-gal染色的细胞层照片。图1B显示含有如Miller et al所述3’序列的表达载体；效价一般为每毫升500,000-1,000,000。图1C显示含有如Kim et al所述3’序列的表达载体；效价一般为每毫升5,000-10,000。
图2A显示可在本发明中使用的F-PPT/3’PPT因子(F-PPT为小写字母；3’PPT为大写字母)。图2B显示可在本发明中使用的C-PPT因子(F-PPT为小写字母；3’PPT为大写字母)。图2C显示可在本发明中使用的CTS因子(HIV具有t0、t1和t3三种终止信号)。图2D显示可在进化研究中使用的简并因子的实例——方法是，例如，构建含有该简并PPT序列的原病毒库，该序列可直接添加，也可取代野生型PPT序列，随后用适当细胞将该原病毒库传代，然后对选定的病毒进行分析。
在逆转录病毒表达载体中加入正链合成因子我们已证明(见下文实施例1)，诸如F-PPT区等正链合成因子对逆转录病毒表达载体的功能具有重要作用，将该序列引入pMOI等表达载体，其中包括最小化载体，可增强该载体的功能。
基于逆转录病毒的载体中PPT/第二链合成功能的优化我们已证明了F-PPT的改变可影响逆转录病毒表达载体的功能。这表明由F-PPT介导的作用对优化载体的功能十分重要。F-PPT的功能可能与PPT因子自身的功能相关。该因子与c-PPT和CTS相同，均参与了第二链的合成。因此，结合使用或单独使用这些因子至少可确定某些逆转录病毒表达盒中的载体功能。此外，这些因子对变化异常敏感。我们还说明了F-PPT及上述相关因子(3’PPT、c-PPT和CTS)的优化方法。该方法在此前的载体设计中均被忽略了。因此，应该了解的是，在载体基因组中含有修饰的或额外的第二链合成因子的任何逆转录病毒表达载体均可增强载体的功能。
在慢病毒载体中加入优化的第二链合成因子以及其鉴定野生型慢病毒与肿瘤逆转录病毒不同，它一般含有两种PPT序列中央PPT(c-PPT)和3’PPT。这些序列一般位于病毒蛋白的开放阅读框(ORFs)内。就HIV而言，c-PPT位于整合酶内，3’PPT位于NEF内。由于具有这种定位，因此可以说慢病毒PPT序列具有双重功能既作为蛋白编码序列，又作为第二链合成中的顺式作用元件。这种双重功能的结果是，这些序列因子的组成可能并不是最佳的，而是受到其定位的ORF的限制。因此，第二链的合成可能并不是最理想的。由于其中的所有蛋白均为反式，因而这种可能性使得能够在一定范围内对慢病毒载体中的这些因子进行优化，从而缓解对载体基因组PPT序列及相关的第二链合成因子的限制。这种优化可通过取代现有的第二链合成因子(3’PPT、c-PPT、F-PPT、U形盒及CTS序列)或在病毒表达载体中加入额外的因子来实现。事实上，载体第二链合成的优化可通过加入多种第二链合成起始位点来实现，而不是象原病毒那样只使用两种起始位点，或是象来源于慢病毒的多种表达载体那样只使用一种起始位点(3’PPT)(例如，可参考Zufferey et al 1997；Kim et al B1998)。
在基于逆转录病毒的载体中加入正链合成因子以协助对非分裂细胞的转导尽管细胞分裂对肿瘤逆转录病毒和来源于肿瘤逆转录病毒的载体的成功转导而言是必需的，但与其相当的慢病毒却能够转导非分裂细胞(Naldini et al 1996)。到目前为止，对产生这种差异的原因仍不清楚。这两种病毒类型之间的差异之一是，目前在慢病毒家族的多数成员中都发现了两种第二链合成起始位点一种起始于c-PPT，一种起始于3’PPT(例如，可参考Blum et al 1986，Charneau et al 1994)。而肿瘤逆转录病毒中仅存在一种即3’PPT。另一差异则与第一种相关，即慢病毒还具有一种特定的中央终止序列(CTS)，而肿瘤逆转录病毒不具有；该序列也参与了有效的第二链合成。
我们已证明了PPT相关序列因子对载体功能的重要作用。因此，我们认为第二链合成的不同导致了不同逆转录病毒载体间转导能力的差异。特别是通过改变基于肿瘤逆转录病毒的载体中的第二链合成参数可赋予它们转导非分裂细胞的能力。此外，基于慢病毒的载体中第二链合成参数的类似变化可提高其对非分裂细胞的转导效率。参数改变包括，但不局限于，在基于肿瘤逆转录病毒和慢病毒的载体中创建多种第二链合成起始位点。例如，在来源于MLV或HIV的载体基因组中加入额外的F-PPT/PPT序列因子，如果需要，也可加入适当的CTS因子。
进行基于pol的修饰以增强第二链合成我们已证明了在逆转录病毒表达载体中加入优化的第二链合成顺式作用元件对优化载体功能的重要性。第二链合成可能是限制载体功能和效价的一种被忽略的重要因素。通过修饰这些可促进第二链有效合成的顺式作用元件，以及加入、添加或将原有因子取代成那些具有最佳性能的因子均会增强载体的功能。但这并不是优化第二链合成的唯一方法。另一种方法是对逆转录病毒的pol基因进行修饰。该基因可编码逆转录及第二链合成过程所必需的酶蛋白产物(逆转录酶、RnaseH和整合酶)。因此，在逆转录病毒载体基因组中引入来自相关原病毒的或非自身起源的PPT优化序列时，可能还需要部分或完全改变用于反式提供载体基因组有效包装和递送所需的病毒蛋白的病毒pol基因表达盒(通常以更大的gag/pol表达盒形式存在)。举例来说，在慢病毒表达载体中引入肿瘤逆转录病毒PPT序列时，还需要在pol表达盒中加入或将其取代成类似的基于肿瘤逆转录病毒的pol序列。在发现了第二链合成对载体功能优化的重要性的基础上，也可以对能够与第二链合成所需的任何顺式作用元件相互作用的反式作用蛋白进行修饰以增强该合成。因此，可用来增强该相互作用从而增强第二链合成的这些修饰也包括在本发明中。
实施例1我们使用的表达载体来源于肿瘤逆转录病毒，其主链基于两种已发表的载体pLXSN(Miller et al 1989)和pMOI(Kim et al B 1998)。与pLXSN相比，pMOI载体中5’及3’LTR侧翼的来源于病毒的序列要少得多，因此可被认为更加“最小化”。特别是pMOI载体的5’端gag编码序列完全缺失，并且在env和3’PPT间不含有3’UTR(非翻译)序列。
我们以pLXSN和pMOI载体为待选对象研究了它们在基因治疗方案中递送基因方面的作用。有趣的是，当在这两种载体内加入相同的表达盒(p450IRESlacZ-Sv40Neo)时，pLXSN载体的效价比pMOI的效价超出了100倍(见图1)。起初我们认为该观测结果的原因是包装信号内缺乏gag序列(如前人报导；见Bender et al 1987)；但在pMOI中加入额外的基于gag的包装信号后，其效价仍未恢复到pLXSN的水平。这一结果很令人惊讶，因为这两种载体此时已包含了所有已知的用于优化载体功能的功能性因子。
通过这两种载体的序列比较发现，此时仅剩的差异(质粒主链除外)位于载体3’端3’PPT上游的病毒序列内。由此得出的结论是，该病毒序列——位于MLV原病毒的env和3’PPT之间——的存在必定是基于pLXSN的载体性能提高的原因。为了证实这一结论，用pMOI的3’序列取代基于pLXSN的载体的3’序列，并将两种序列进行比较，此时两种序列仅有细微的不同(18个碱基对，见图1)。基于pLXSN的载体果然比pLXSN-3’pMOI超出了约100倍，这与假设相同。
这些观测结果使我们认为，在逆转录病毒表达载体的3’PPT侧翼存在一种此前未被发现的功能区。这是第一次发现该区域对所有逆转录病毒表达载体的重要性。有趣的是，该区域与MLV中此前被归类为SIV内的U形盒(Llyinskii and Desrosiers 1998)的序列有部分重叠。尽管U形盒的功能仍不清楚，但已发现它在原病毒复制中具有重要作用，并且认为U形盒与3’PPT、c-PPT和CTS相同，是一种参与RT介导的第二链起始/合成的序列因子(Llyinskii and Desrosiers1998)。实施例2——在慢病毒中加入中央PPT序列和中央终止序列如前文所述，加入参与第二链合成的顺式作用元件，如中央多聚嘌呤段(cPPT)和中央终止序列(CTS)的顺式作用元件，可优化慢病毒载体的性能。该序列采用的是Stetor et al.(1999)描述的EIAV中的序列，它相当于EIAV基因组中Genbank登录号为U01866的第4916-5039位核苷酸。
由EIAV原病毒克隆扩增出带有少量侧翼残基的该序列，使用的引物中含有SalI和XbaI的酶切位点序列，它们在EIAV载体pONY4.0中均为单一酶切位点。pONY4.0载体在WO99/32646中已有描述。扩增出的序列如下CAGGTTATTCTAGAGTCGACGCTCTCATTACTTGTAACAAAGGGAGGGAAAGTATGGGAGGACAGACACCATGGGAAGTATTTATCACTAATCAAGCACAAGTAATACATGAGAAACTTTTACTACAGCAAGCACAATCCTCCAAAAAATTTTGTTTTTACAAAATCCCTGGTGAACATGGTCGACTCTAGAACGCATTCG加下划线的为XbaI位点，SalI位点则以斜体字显示。功能活性序列(4916-5039)以黑体字显示，其中包括称为中央PPT的CTS的因子。利用XbaI位点可将该因子置于CMV内部启动子的上游。利用SalI位点可将其置于pONY4.0内LacZ基因的下游。
利用常规技术将编码这种已修饰的pONY4.0载体的质粒与gag/pol表达质粒和VSV-G表达质粒共转染到293T细胞中，即可实现带有这些修饰的载体的制备。
对HIV载体进行了如下的类似修饰。
利用PCR由HIV基因组(HXB2毒株4771-4926 nt，Genbank登录号M38432)产生下文所示的cPPT/TCS序列，即代表了Charneau et al(1994)所述的中央PPT及CTS。
CATCCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGGGACAGCAGAAATTC加下划线的为cPPT，以黑体字显示并加下划线的为CTS。
然后将PCR产物插入pH4Z(Kim et al.，A 1998)的MscI位点，即产生了pH4ZcPPT。
表1逆转录病毒分类属 实例1.鸟肉瘤及造白细胞组织增生病毒群(Avian 劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)sarcoma and leukosis viral group)2.哺乳动物B型病毒群(Mammalian B-type viral 鼠乳腺瘤病毒(mouse mammary tumorgroup) virus)3.鼠白血病相关病毒群(Murine leukemia- 莫洛尼鼠白血病病毒(Moloneyrelated viral group) murine leukemia virus)4.人T细胞白血病-牛白血病病毒群(Human 人T细胞白血病病毒(Human T-cellT-cell leukemia-bovine leukemia viralleukemia virus)group)5.D型病毒群(D-type viral group)Mason-Pfizer猴病毒(Mason-Pfizermonkey virus)6.慢病毒(Lentiviruses) 人免疫缺陷病毒(human immuno-deficiency virus)7.泡沫病毒(Spumaviruses) 人泡沫病毒(human foamy virus)
表2主要逆转录病毒及其来源病毒 简称单纯逆转录病毒(Simple Retroviruses)鸟白血病病毒(Avian leukosis virus)ALV劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus) RSV劳斯相关病毒(Rous-associated virus) RAVFujinami肉瘤病毒(Fujinami sarcoma virus) FuSV鸟髓母细胞瘤病毒MH2(Avian myelocytoma virus MH2) MH2鸟幼红细胞增多病病毒(AvianAEVerythroblastosis virus)S13鸟幼红细胞增多病病毒(S13 avian erythroblastosisvirus)鸟髓母细胞过多症病毒(Avian myeloblastosis virus) AMV鸟逆转录病毒RPL12(Avian retrovirus RPL 12)CT10鸟肉瘤病毒(CT10 avian sarcoma virus) CT10鸟髓母细胞过多症-幼红细胞增多病病毒E26(Avian E26myeloblastosis-erythoblastosis virus E26)鸟髓母细胞瘤病毒MC29(Avian myelocytoma MC29) MC29鸟逆转录病毒RPL30(Avian retrovirus RPL30)劳斯相关病毒-0(Rous-associated virus-0) RAV-0鸟肉瘤病毒(Avian sarcoma virus) UR2鸟逆转录病毒(Avian retrovirus)SKVY73鸟肉瘤病毒(Y73 avian sarcoma virus)Y73鸟肉瘤病毒17(Avian sarcoma virus 17)鸟逆转录病毒AS42(Avian retrovirus AS42) ASV42鸟逆转录病毒(Avian retrovirus)ASV31鼠乳腺瘤病毒(Mouse mammary tumor virus) MMTV格罗斯鼠白血病病毒(Gross murine leukemia virus) Gross MLV格拉菲鼠白血病病毒(Graffi murine leukemia virus) Graffi MLV弗兰德鼠白血病病毒(Friend murine leukemia virus)Fr-MLV放射性白血病病毒(Radiation leukemia virus) RadLV脾坏死病毒(Spleen necrosis virus) SNV莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus) Mo-MLVHarvey鼠肉瘤病毒(Harvey murine sarcoma virus) Ha-MSV猫白血病病毒(Feline leukemia virus) FeLV脾病性形成病毒(Spleen focus-forming virus) SFFVFinkel-Biskis-Jinkins鼠肉瘤病毒(Finkel-Biskis-Jinkinsmurine sarcoma virus) FB-MSV莫洛尼鼠肉瘤病毒(Moloney murine sarcoma virus) Mo-MSV鸟网状内皮组织增生病病毒(Avian reticuloendotheliosisREVvirus)基斯腾鼠肉瘤病毒(Kirsten murine sarcoma virus) Ki-MSV狒狒内源病毒(Baboon endogenous virus) BaEV阿贝尔森鼠白血病病毒(Abelson murine leukemia virus) Ab-MLV长臂猿白血病病毒(Gibbon ape leukemia virus) GALVGardner-Arnstein猫肉瘤病毒(Gardner-Arnstein feline GA-FeSVsarcoma virus)McDonough猫肉瘤病毒(McDonough feline sarcoma virus) SM-FeSV猿肉瘤病毒(Simian sarcoma virus)SSVSnyder-Theilen猫肉瘤病毒(Snyder-Theilen feline sarcoma ST-FeSVvirus)鼠肉瘤病毒3611(Murine sarcoma virus 3611) MSV3611Hardy-Zuckerman猫肉瘤病毒(Hardy-Zuckerman felineHZ4FeSVsarcoma virus)鼠骨髓增生性白血病病毒(Mouse myeloproliferativeleukemia virus)Mason-Pfizer猴型病毒(Mason-Pfizer monkey-type virus)MPMVJaagsiekte病毒(Jaagsiekte virus)复合病毒(Complex Retroviruses)牛白血病病毒(Bovine leukemia virus) BLV人T细胞白血病病毒-1(Human T-cell leukemia virus-1)HTLV-1人T细胞白血病病毒-2(Human T-cell leukemia virus-2)HTLV-2马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus) EIAV绵羊脱髓鞘性脑白质炎病毒(Visnavirus)羊关节炎-脑炎病毒(Caprine arthritis-encephalitis CAEVvirus)牛免疫缺陷病毒(Bovine immunodeficiency virus) BIV人免疫缺陷病毒-1(Human immunodeficiency virus-1) HIV-1猿免疫缺陷病毒(Simian immunodeficiency virus) SIV人免疫缺陷病毒-2(Human immunodeficiency virus-2) HIV-2猫免疫缺陷病毒(Feline immunodeficiency virus) FIV人泡沫病毒(Human foamy virus) HFV猿泡沫病毒(Simian foamy virus)SFVWalleye皮肤肉瘤病毒(Walleye dermal sarcoma virus) WDSV
表3慢病毒核酸数据库位点名称 acc.no.HIV-1 HIVHXB2CG K03455HIVNL43 M19921HIVBRUCG K02013HIVNY5CG M38431HIVJRCCSF M38429HIVSF2CG K02007HIVMNCG M17449HIV-2 HIV2BEN M30502HIV2D194 J04542HIV2GH1 M30895HIV2ISY J04498HIV2ROD M15390HIV2STM31113HIV2UC1GNML07625SIV SIVAGM155 M29975SIVAGM3 M30931SIVAGM677AM58410SIVAGMAA M66437SIVCOMGNM L06042SIVMM239 M33262SIVMM251 M19499SIVMNEM32741SIVSMMPBJAM31345SIVSMMPBJBL03295FIV FIVCG M25381FIVPPRM36968FIU11820 U11820BIV BIM127M32690EIAVEIAVCGM16575EIACGIP M87581EIU01866 U01866Visna VLVCG M10608VLVCGAM51543VLVGAGA L06906VLVLV1A M60609VLVLV1B M60610CAEVCAEVCGM33677绵羊慢病毒 OLVCG M31646OLVSAOMVCGM34193
序列SEQ ID NO1ATAAAATAAAAGATTTTASEQ ID NO2CACATCTCATGTATCAATGCCTCAGTATGTTTSEQ ID NO3TGACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCACTTTTTSEQ ID NO4AATGACTTATAAACTTGCAGCGGATTTTTCGCACTTTTTSEQ ID NO5GACAGCTATTTGTAACTGCGAAATACGCTTTTGCATSEQ ID NO6ATAAAATAAAAGATTTTATTTAGTCTCCACSEQ ID NO7TACAAATGGCAGTATTCATCCACAATTTTSEQ ID NO8AGAAAAAGGGGGGAASEQ ID NO9AGAAAAACAAGGGGGGAASEQ ID NO10AAAAGAAAAGGGGGGASEQ ID NO11SSSSGAAAAGGGAGGASEQ ID NO12AGGGAGGGGGAAASEQ ID NO13AAAAAGGGGGGAASEQ ID NO14AAAAGAAAAGGGGGGATGGGGGGSEQ ID NO15TACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTCGGGGTTTATTASEQ ID NO16AACAAAGGGAGGGAAACTATGGGAGGACAGACACCATGGGAAGTATTTATCACTAATCAAGCACAAGTAATACATGAGAAACTTTTACTACAGCAAGCACAATCCTCCAAAAAATTTTGTTTTTSEQ ID NO17AAAAGAAAAGGGGGGSEQ ID NO18AAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTT
参考文献Bender et al(1987)莫洛尼鼠白血病病毒的包装信号延伸至gag区的证据。J.Virol.611639-1646Blum et al(1985)绵羊脱髓鞘性脑白质炎慢病毒的有间隙线性DNA在细胞培养物中的合成。Virology 142270-277Charneau et al(1994)HIV-1的逆转录基因组中央部位的终止步骤。J.Mol.Biol(194)241651-662Coffin et al(1997)逆转录病毒。Cold Spring Harbour LaboratoryPressIiyinskii and Desrosiers(1998)紧接多聚嘌呤段上游的猿免疫缺陷病毒复制所必需的序列的鉴定。EMBO.J 173766-3774Kim et al(1998)基于1型人免疫缺陷病毒的慢病毒载体的最低必要条件。Jn.Of Virology 72811-816Kim et al(1998)安全性、基因表达及多功能性均得以改善的逆转录病毒载体的结构。Jn of Virology 72994-1004Lavigne et al(1997)DNA曲率可控制正链DNA合成在HIV-1基因组中央部位的终止。JMB(1997)266507-524Miller et al(1989)用于基因转移和表达的改进型逆转录病毒载体。Biotechniques 7980-990Naldini et al(1996)利用慢病毒载体对非分裂细胞进行体内递送和稳定转导。Science 272263-267Soneoka et al(1995)用于发布高效价逆转录病毒载体的三质粒瞬时表达系统。Nucleic Acid Res 1995 23628-33Stetor et al(1999)Biochemistry 383656-3667Zufferey R et al(1997)多次减毒的慢病毒载体可实现高效的基因体内递送。Nature Biotech.1997 15871-权利要求
1.一种正链合成因子，该正链合成因子含有一种侧翼多聚嘌呤段(F-PPT)，或其衍生物、变异体或同源物。
2.逆转录病毒正链合成因子在改变逆转录病毒载体或逆转录病毒载体颗粒的转导能力方面的应用。
3.逆转录病毒正链合成因子在增加逆转录病毒载体效价方面的应用。
4.一种逆转录病毒载体，其中该逆转录病毒载体缺乏一种或多种附属基因，其特征在于含有一种正链合成因子。
5.一种逆转录病毒载体，该逆转录病毒载体能够递送NOI，并且含有一种外源性第二合成因子。
6.根据权利要求2-5的任意一条的一种逆转录病毒载体的应用，其中的正链合成因子为PPT、c-PPT、CTS、U形盒或F-PPT，包括其衍生物、变异体和同源物。
7.根据前述权利要求的任意一条的一种逆转录病毒载体的应用，其中载体可由慢病毒基因组获得。
8.一种逆转录病毒载体包装细胞或细胞系，或含有一种外源反式作用因子的逆转录病毒载体表达质粒或表达盒。
9.根据权利要求8的一种逆转录病毒载体包装细胞或细胞系或逆转录病毒载体表达质粒或表达盒，其中的反式作用因子为pol。
10.一种逆转录病毒生产系统，用于产生权利要求4-7的任意一条的逆转录病毒载体，该系统含有编码该逆转录病毒载体的一种核酸序列。
11.根据权利要求10的逆转录病毒生产系统，该系统进一步含有权利要求8或9的逆转录病毒载体包装细胞或细胞系，或逆转录病毒载体表达质粒或表达盒。
12.一种逆转录病毒载体，由权利要求10或11的生产系统产生。
13.一种逆转录病毒颗粒，可由权利要求4-7或权利要求12的任意一条的逆转录病毒载体获得。
14.一种细胞，该细胞经过权利要求4-7或权利要求12的任意一条的逆转录病毒载体的转染或转导。
15.根据权利要求4-7或12-14的任意一条的逆转录病毒载体或逆转录病毒颗粒或细胞在医药方面的应用。
16.根据权利要求4-7或12-14的任意一条的逆转录病毒载体或逆转录病毒颗粒或细胞在改变该载体转导能力方面的应用。
17.根据权利要求4-7或12-14的任意一条的逆转录病毒载体或逆转录病毒颗粒或细胞在促进正链合成方面的应用。
18.根据权利要求4-7或12-14的任意一条的逆转录病毒载体或逆转录病毒颗粒或细胞在提高载体效价方面的应用。
19.一种药用组合物，该组合物含有根据权利要求4-7或12-14的任意一条的逆转录病毒载体或逆转录病毒颗粒或细胞，以及一种药学容许的赋形剂、稀释剂或媒介物。
20.根据权利要求4-7或12-14的任意一条的逆转录病毒载体或逆转录病毒颗粒或细胞在产生一种药用组合物以将NOI递送至需要该NOI的目标部位方面的应用。
21.一种方法，该方法包括利用权利要求4-7或12-14的任意一条的逆转录病毒载体或逆转录病毒颗粒或细胞对一种细胞进行转染或转导。
22.一种递送系统，该系统采用根据权利要求4-7或12-14的任意一条的逆转录病毒载体或逆转录病毒颗粒或细胞的形式。
23.一种用于权利要求4-7或12-14的任意一条的逆转录病毒载体或逆转录病毒颗粒或细胞的递送系统，其中该递送系统含有一种非逆转录病毒表达载体、一种腺病毒和/或一种质粒。
全文摘要
一种能够递送NOI并且含有另一种外源合成元件的逆转录病毒载体。
文档编号A61P25/28GK1348497SQ9981351
公开日2002年5月8日 申请日期1999年11月19日 优先权日1998年11月20日
发明者K·米特罗法诺斯, M·乌登, J·罗尔, S·M·金斯曼, A·J·金斯曼 申请人:牛津生物医学(英国)有限公司