专利名称：负调节针对医用蛋白的免疫反应的方法
技术领域：
本发明部分地由NIH提供给美国红十字会的拨款号HL36099所支持。因此，政府可以在本发明中拥有特定的权利。
背景技术：
使用生物蛋白进行的医疗处理的一个主要限制是免疫反应，免疫反应由机体针对体内存在的外源物质所产生。当外源物质必须进行重复给药以获得最优效果时，这一免疫反应尤为问题所在。
这样的情况的一个例子是用于治疗止血障碍的药物的重复给药，止血障碍的例子如因子VIII缺陷症(例如，经典的血友病A和von Willebrand’s症)或因子IX缺陷，亦称为血友病B。经典的血友病，血友病A，是一种X连锁的障碍，每10,000个男性中有一例。von Willebrand’s症是最常见的遗传性血液障碍，每800-1000个个体中发生一例。血友病B，也已知为克里斯马斯病，每10000个男性中大概发生一例(哈里森内科学原理(Harrison’s Principles ofInternal Medicine).Isselbacher等，编著，第13版1994.McGraw-Hill N.Y.，N.Y.)。
因子VIII是一种265kD的单链蛋白，它在一复合体内同vonWillebrand因子(VWF)环化。因子VIII在血液凝聚级联中是一种重要的调控蛋白。它被止血酶激活后，通过激活因子IX(因子IXa)加速了因子X的激活速度，最终导致了纤维蛋白凝块的形成。VWF分子是一种粘着糖蛋白，它在血小板凝聚中发挥核心作用。它作为因子VIII在血浆中的载体并辅助血小板-血管壁相互作用。VWF由多亚基组成，各亚基可能相同，其分子量均为约230kD。VWF在内皮细胞和巨核细胞中合成。因子IX是一种55kD的单链酶原，它可以被因子XIa或组织因子-VIIa复合体转化成一种活性的蛋白酶(IXa)。被激活的因子IX和被激活的因子VIII随后激活因子X。
外源蛋白的重复给药可以在受体中导致针对这些蛋白的免疫反应。在对外源蛋白的T细胞反应中，抗原呈递细胞(APC)必须提供两种信号给静息T淋巴细胞(Jenkins，M.和Schwartz，R.(1987)药物实验杂志(J.Exp.Med.)165，302-319；Mueller，D.L.，等，(1990)免疫学杂志(J.Immunol.)144，3701-3709)。第一个信号赋予免疫反应特异性，在对存在于主要组织相容性复合物(MHC)中的外源抗原性肽识别后，该信号经T细胞受体(TCR)进行转导。第二个信号被称为共同刺激，它诱导T细胞增殖并变得具功能性(Lenschow等1996.免疫学研究年鉴(Annu.Rev.Immunol.)14233)。共同刺激既无抗原特异性，也无MHC限制性，它被认为是由APC所表达的一个或多个独特的细胞表面分子所提供(Jenkins，M.K.等，1998免疫学杂志(J.Immunol.)140，3324-3330；Linsley，P.S.，等1991药物实验杂志(J.Exp.Med.)173，721-730；Gimmi，C.D.，等，1991美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)88，6575-6579；Young，J.W.，等1992临床研究杂志(J.Clin.Invest.)90，229-237；Koulova，L.，等1991药物实验杂志(J.Exp.Med.)173，759-762；Reiser，H.，等1992美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)89，271-275；van-Seventer，G.A.，等(1990)免疫学杂志(J.Immunol.)144，4579-4586；LaSalle，J.M.，等，1991免疫学杂志(J.Immunol.)147，774-80；Dustin，M.I.，等，1989药物实验杂志(J.Exp.Med.)169，503；Armitage，R.J.，等1992，Nature 357，80-82；Liu，Y.，等1992药物实验杂志(J.Exp.Med.)175，437-445)。
在APC上表达的CD80(B7-1)和CD86(B7-2)蛋白是关键的共同刺激分子(Freeman等1991.药物实验杂志(J.Exp.Med.)174625；Freeman等1989免疫学杂志(J.Immunol.)1432714；Azuma等1993，自然(Nature)36676；Freeaman等，1993，科学(Science262909)Science262909)。
在初次免疫反应中B7-2表现得更为重要，而在免疫反应期后期被正调节的B7-1可能在延长初次T细胞反应或共同刺激T细胞次级反应中较为重要(Bluestone.1995.免疫学(Immunity).2555)。
B7-1和B7-2是在T淋巴细胞上表达的两种配基的反受体(counter-receptor)。CD28是为B7-1和B7-2所结合的一种配基，它在静息T细胞中组成型表达，并在激活后表达有所增加。在通过T细胞受体接收到信号后，CD28的连接和共同刺激信号的转导诱导T细胞增殖并分泌IL-2(Linsley，P.S.，等，药物实验杂志1991药物实验杂志(J.Exp.Med.)173，721-730；Gimmi，C.D.，等，1991美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)88，6575-6579；June，C.H.等，1990今日免疫学(Immunol.Today.)11，211-6；Harding，F.A.等，1992 Nature.356，607-609)。被称为CTLA4(CD152)的第二个受体与CD28同源但并不是在静息T细胞中表达并表现得紧随T细胞激活(Brunet，J.F.，等，1987Nature328，267-270)。CTLA4在对T细胞反应的负调节中表现得很重要(Waterhouse等1995Science270985)。CTLA4的障碍已被发现可去除抑制信号，而CTLA4的聚集已被发现可提供负调节T细胞反应的抑制信号(Allison和Krummel.1995.Science270932)。B7分子对CTLA4的亲和性要高于对CD28的亲和性高(Linsley，P.S.，等1991药物实验杂志，(J.Exp.Med.)174，561-569)，并且B7-1和B7-2已被发现结合于CTLA4分子的独特区域并且它们同CTLA4结合具有不同的动力学(Linsley等1994免疫学(Immunity.)1793).
10-25％的患有血友病的患者产生对因子VIII的免疫反应。这些患者产生的抑制剂通常为IgG抗体，该抑制剂中和因子VIII的活性并因此阻止了有效的治疗。已经确认出两种抑制剂。具有1型抑制剂的高效应器患者对因子VIII具有记忆反应，这产生了高滴度的针对因子VIII的抗体。具有2型抑制剂的低效应器患者具有低抗体滴度，该滴度不因因子VIII的给药而增加。近来用于钝化这些患者中的该抗体反应的的策略只有或多或少的成功。进一步，如果基因治疗在血友病或其他缺陷病症的治疗中获得成功，针对被替代蛋白的抗体的产生是一个需要解决的关键问题(Connelly S等，血液(Blood)883846，1996；Kuna S-H等，Blood91784，1998)。
发明概要本发明特别地提供了组合物和方法，该组合物和方法使以一种医疗蛋白进行给药以治疗一种障碍时降低针对该医疗蛋白的免疫反应的产生和/或发展。
在一方面，本发明涉及到一些组合物，它们包括的第一种试剂促进止血，第二种试剂抑制T细胞中的共同刺激信号。
在一个实施方案中，本发明组合物进一步包括一种药学上可接受的载体。
在一个实施方案中，该第一种试剂为因子VIII。在另一个实施方案中，该第一种试剂为B-结构域被删除的因子VIII变体。在一个实施方案中，该第一种试剂为因子IX。另一个实施方案中，该第一种试剂为von Willebrand因子。
在一个实施方案中，该第二种试剂为一种共同刺激分子的一种可溶形式。在一个优选方案中，该第二种试剂为CTLA4的一种可溶形式。在另一个优选方案中，该第二种试剂为B7-1的一种可溶形式，B7-2的一种可溶形式或B7-1的一种可溶形式与B7-2的一种可溶形式的组合。在一个更优选方案中，该第二种试剂为CTLA4Ig。在另一个更优选方案中，该第二种试剂为B7-1Ig或B7-2Ig。在另一个更优选方案中，该第二种试剂为CD40或CD40L的一种可溶形式。
在另一个实施方案中，该第二种试剂为一种抗体，该抗体可与共同刺激分子结合。在一个优选方案中，该第二种试剂选自抗-B7-2抗体，抗-B7-2抗体，以及抗-B7-1抗体和抗-B7-2抗体的组合。在一种实施方案中，该抗体是一种非活性形式的抗-CD28抗体。
本发明进一步涉及到用于治疗一个医疗对象的止血障碍的方法，该方法包括以本发明的组合物对一个医疗对象进行给药以对一种止血障碍进行治疗。
在一个实施方案中，该医疗对象具有很高滴度的可与第一种试剂结合的抗体。在另一个实施方案中，该医疗对象不具有很高滴度的与第一种试剂结合的抗体。
在一个实施方案中，该方法包括以一种组合物进行给药，该组合物含一种试剂，该试剂抑制T细胞中的一种共同刺激信号。
在一个实施方案中，止血障碍选自血友病A，血友病B和冯·维勒布兰德，氏症。
在另一方面，本发明涉及到用于治疗一个医疗对象的止血障碍的方法，该方法包括以促进止血的第一种试剂和抑制T细胞中的共同刺激信号的第二种试剂对该医疗对象进行给药，由此对一种止血障碍进行治疗。
在另一方面，本发明涉及到用于治疗一个医疗对象的止血障碍的方法，该方法包括以促进止血的第一种试剂和抑制T细胞中的共同刺激信号的第二种试剂对该医疗对象进行给药，由此产生了对第一种试剂的免疫耐受，从而对一种止血障碍进行治疗。
在一个实施方案中，该第一种试剂为因子VIII。在另一个实施方案中，该第一种试剂为B-结构域被删除的因子VIII变体。在一个实施方案中，该第一种试剂为因子IX。另一个实施方案中，该第一种试剂为von Willebrand因子。
在一个实施方案中，该第二种试剂为一种试剂的一种可溶形式，该试剂向T细胞递送一种共同刺激信号。在一个优选方案中，该试剂为CTLA4的可溶形式。在一个更优选方案中，该试剂为CTLA4Ig。在另一个更优选方案中，该试剂为B7-1的一种可溶形式，B7-2的一种可溶形式或B7-1与B7-2的组合。在另一个更优选方案中，该试剂为B7-1Ig，B7-2Ig或B7-1Ig与B7-2Ig的组合。
在一个实施方案中，该第二种试剂为一种抗体，该抗体与共同刺激分子结合。在另一个优选方案中，该第二种试剂选自抗-B7-1抗体，抗-B7-2抗体，以及抗-B7-1抗体和抗-B7-2抗体的组合。在另一种实施方案中，该抗体是一种非活性形式的抗-CD28抗体。
在一个实施方案中，止血障碍选自血友病A，血友病B和冯·维勒布兰德氏症。
在一个实施方案中，该医疗对象具有很高滴度的与第一种试剂结合的抗体。
图示简述
图1阐示的是实验设计，该实验用于实施例1以测试针对因子VIII的初次抗体反应的抑制。
图2显示，未接受CTLA4Ig的小鼠早在第20天便具有高滴度的抗体(G-1)，而接受CTLA4Ig的小鼠到第82天前也没有产生抗体(G-2和G-3)。
图3阐示的是实验设计，该实验用于实施例2以测试针对因子VIII的再次抗体反应的抑制。
图4显示，未接受CTLA4Ig的动物具有高滴度的抗因子VIII的抗体(G-1)，而接受CTLA4Ig的小鼠(G-2)除一只小鼠以外没有产生针对因子VIII的再次免疫反应。
图5显示的是mCTLA4-Ig对于抗因子VIII抗体的形成的影响。
图6显示的是以mCTLA4-Ig进行重复给药对于抗因子VIII抗体的形成的影响。
图7显示的是同时以mCTLA4-Ig和因子VIII进行给药的效果。
图8显示的是mCTLA4-Ig对于针对因子VIII的再次免疫反应的影响。
图9显示的是B7-1和B7-2在抗因子VIII的抗体反应中的作用。
图10显示的是血友病A/B7-1-/-和血友病A/B7-2-/-小鼠的针对因子VIII的T细胞反应。
发明详述本发明通过提供一些组合物和方法，成为治疗止血障碍中的一个重要的进步，该组合物和方法可以在以一种医疗蛋白进行给药以治疗一种障碍时降低针对该医疗蛋白的免疫反应的产生和/或发展。
在进一步描述本发明之前，为方便起见，将说明，实施例和附上的权利要求中使用的特定术语集中于此。I.定义本文所用的语言“止血障碍”包括导致异常出血和/或血栓症的障碍。正常的止血通过血管壁，血小板和血浆蛋白的成分间的一系列的相互作用限制了出血。止血障碍出现的原因诸如血小板聚集的失败和/或纤维蛋白凝块形成的失败，这可导致对疾病或外伤的不适当反应，例如，无法控制的出血。这些障碍的检测方法的例子有测定出血时间，局部促止血酶原激酶时间(PTT)，止血酶原时间(PT)，止血酶时间(TT)或通过该领域已知方法进行纤维蛋白原定量测定。示例性的止血障碍包括血友病A，血友病B和冯·维勒布兰德氏症。
本文所用的术语“促进止血的试剂”包括一种蛋白或多肽，它在医疗对象中有缺仝或缺失，并且在以其对该医疗对象进行给药时缓解或治疗止血障碍。优选的促进止血的试剂包括凝血因子，诸如因子VIII，因子IX，VWF和它们的类似物。
本文所用的术语“B7家族”或“B7分子”包括与诸如B7-1，B7-2或B7-3(为抗体BB-1所识别)这样的B7多肽有氨基酸序列同一性的共同刺激分子。此外，B7家族分子还具有相同的功能，例如，能够结合B7家族配基(例如，CD28，CTLA4或ICOS中的一种或多种)以及能够共同刺激T细胞激活。
B7多肽能够提供共同刺激作用以激活T细胞，从而诱导T细胞增殖和/或细胞因子的分泌，B7还可抑制T细胞的共同刺激，例如其在可溶形式下存在时。B7家族成员包括B7-1，B7-2或其可溶片段或衍生物。在一个实施方案中，B7家族成员与免疫细胞上的CD28，CTLA4，ICOS和/或其它配基结合并且具有抑制或诱导免疫细胞的共同刺激的能力。
本文所用的语言“抑制T细胞中的共同刺激信号的试剂”包括的试剂抑制通过抗原呈递细胞(APC)表面的共同刺激分子同其在T细胞上的反受体之间的相互作用而产生的信号，所述的共同刺激分子的例子如B7家族的分子。APC上的共同刺激分子(例如，B7家族成员)和它们在T细胞上的同源配基(例如，CTLA4，CD28和ICOS)在此统称为共同刺激分子。抑制共同刺激信号的试剂既可以在细胞外抑制共同刺激分子间的相互作用并从而阻断了细胞内信号的产生，也可以在细胞内抑制信号转导通路内的共同刺激信号。示例性的试剂在本文有进一步详细描述，该试剂包括例如共同刺激分子的可溶形式和与共同刺激分子结合的抗体。
本文所用的短语“免疫反应的负调节”包括不具有已经存在的免疫反应的患者中免疫反应的减少(例如，压制，减弱或抑制)，或已经存在的免疫反应的在长度或强度上的降低。术语“免疫反应”包括任何形式的免疫反应，该反应由共同刺激信号引发或依赖于共同刺激信号，免疫反应的例子有细胞反应或体液反应，它们可以在主体中产生以对外源抗原做出反应。在一个实施方案中，该免疫反应是一种针对促进止血的试剂(例如，因子VII，VWF或因子IX)的抗体反应。术语“免疫耐受化”包括抗原特异性耐受的诱导，该耐受可以使用本领域已知的技术进行测量，例如，通过测定对一个抗原的再次免疫反应(例如，细胞或体液反应)。II.促进止血的试剂在一个实施方案中，该促进止血的试剂为因子VIII。本文使用的术语“因子VIII”，包括表现出因子VIII的前凝血剂活性特征的蛋白。在本发明的一个实施方案中，因子VIII是天然存在的因子VIII蛋白。该蛋白可从血液中纯化或作为血液制品或富集血液制品进行给药。在一个实施方案中，高度纯化的因子VIII可通过血液制品在一个单克隆抗体柱子上吸附和洗脱来产生。或者，这样的天然存在的蛋白可使用核酸分子重组产生，优选情况下核酸分子为天然存在的核酸分子。例如，在一个实施方案中，利用本领域已知的技术，因子VIII通过在细胞中表达一编码因子VIII的核酸分子来制造，从而产生了因子VIII蛋白。人类因子VIII的核苷序列(以及相对应的氨基酸序列)在本领域中是已知的(例见Toole等Nature 1984.3125992；或Genbank Accesion Nos.X01179；K01740)。
在另一个实施方案中，该促进止血的试剂为非天然存在的因子VIII，例如因子VIII的突变形式，该突变形式保持了治疗功能，例如因子VIII的促进止血活性。例如，能与编码人类因子VIII的DNA杂交的DNA序列可以用来产生在本发明的范围内的因子VIII蛋白，该过程在避免同非因子VIII基因杂交的条件下进行(例如，在相当于65℃下5×SSC中(1×SSC＝150mM NaCl/0.15M柠檬酸钠)进行)，或者使用同编码对于因子VIII功能十分重要的蛋白结构域的核酸分子区域保持序列同一性的同源DNA序列来产生。作为例子，美国专利5,744,446；5,663,060；5,583,209；5,661,008；5,422,260和5,707,832被特别引入本文作为参考。
在另一个实施方案中，该促进止血的试剂为一种因子VIII蛋白，该蛋白中至少一个结构域(例如，非关键结构域)被删除。例如，在一个实施方案中，因子VIII蛋白为一种修饰过的因子VIII蛋白，该蛋白中在相对于天然因子VIII的90kD到69kD切点之间的一个或多个氨基酸被删除或替代，更详细的描述见美国专利4,868,112，其内容在此引入作为参考。
在另一个实施方案中，该促进止血的试剂为因子VIII的类似物，该类似物在50/40切点之间和73kD切点包含一个或多个氨基酸的删除，该删除可通过类似于美国专利4,868,112所披露的的方法来产生，其内容在此引入作为参考。在一个优选的实施方案中，一种因子VIII类似物保持了80kD到73kD切点之间的部分或全部的氨基酸区域。在其它一些实施方案中这一区域的部分或全部被与50/40切点毗邻的相对应酸性区域置换。在除此外的其他实施方案中，因子VIII为类似物(具有或不具有上述删除)，如在国际申请PCT/US87/01299(其内容在此引入作为参考)中所披露的，例如其中覆盖位置226,336,562,740,776,1313,1648或1721的精氨酸残基的一个或多个切点已经通过诸如以不同的氨基酸替代其中一个或多个氨基酸的方法被赋予对蛋白酶切割的抗性，可使用本领域已知的技术对cDNA进行诱变而进行该替代，该技术的例子如标准的定位诱变。
促进止血的试剂还包括杂种的因子VIII蛋白，该蛋白含有人类因子VIII的一部分和来自其它物种的非人类的因子VIII蛋白(例如，猪因子VIII)的一部分。这些杂种蛋白可以使用本领域已知的技术来制造，例见美国专利5,744,446；5,663,060和5,583,209所示。
美国专利5,693,499；5,681,746；5,663,060；5,583,209；5,563,045；5,460,951和5,455,031的内容也被特别在此引入作为参考。
在另一个实施方案中，该促进止血的试剂为因子IX。本文所用的术语“因子IX”包括从血浆和转化的细胞系分离而得的因子IX或从宿主细胞培养基分离的重组产生的因子IX，但不限于此。因子IX可以从血液中纯化或以血液制品或富集血液制品进行给药。在一个实施方案中，高度纯化的因子IX可通过血液制品在一个单克隆抗体柱子上吸附和洗脱来产生。示例性的纯化方法还披露于美国专利5,639,857；5,457,181和5,286,849。或者，这样的天然存在的蛋白可使用核酸分子重组产生，优选情况下核酸分子为天然存在的核酸分子。例如，在一些实施方案中，利用本领域已知的技术，因子IX蛋白通过在细胞中表达一编码因子XI的核酸分子来制造，从而产生了因子IX蛋白。用于表达因子IX的遗传学结构可见于美国专利5,650,503和4,994,371。
因子IX的核苷序列和氨基酸序列为本领域所已知(例见Yoshitake等1985.生物化学(Biochemistry)243726或GenebankAccession Nos.K02402；A07407；A01819或X54500)。
在另一个实施方案中，因子IX包括，例如，在美国专利4,994,371；5,171,569；5,679,639；5621039；和5,714,583所描述的蛋白，以上专利的全部披露在此引入作为参考。
除因子IX的天然存在形式外，术语因子IX还包括非天然存在形式，例如，因子IX的突变形式，该突变形式保持了治疗功能，例如因子IX的促进止血活性。例如，可以同编码人类因子IX的DNA杂交的DNA序列可以用来产生在本发明的范围内的因子IX蛋白，上述杂交过程在避免同非因子IX基因杂交的条件下进行(例如，在相当于65℃下5×SSC中(1×SSC＝150mM NaCl/0.15M柠檬酸钠)进行)。除此外，同编码对于因子IX功能十分重要的蛋白结构域的核酸分子区域保持序列同一性的DNA序列可以用来产生在本发明的范围内的因子IX蛋白。
因子VIII和因子IX蛋白还可以商品形式购得。例如，可购得浓缩形式的因子VIII，例如，Immunate(Immuno)，Beriate(Behring)；可购得单克隆抗体纯化形式的因子VIII，例如，Octanativ-M(Pharmacia)，Hemofil M(Baxter)和Monoclate-P(Armour)；可购得重组形式的因子VIII，例如，Recombinate(Baxter)和Kogenate(Bayer)。一种重组的B-结构域删除形式的因子VIII，r-VIII SQ(Pharmacia和Upjuhn，Stockholm)，也可购买到。因子IX可购买，如，Nanotiv(KabiPharmacia)或Immunine(Immuno)；。单克隆抗体纯化形式的因子IX也可购买如Mononine(Armour)。还可购得重组因子IX，例如BeneFIX(Genetics Institute)。
VWF是一种大的多亚基血浆蛋白，由单一种类糖蛋白亚基组成。VWF的亚基之间以二硫键相连。在血浆中VWF循环为多聚体，从二聚体到多于50个亚基的多聚体不等。二聚体由两个连在一起的亚基组成，连接可能通过它们的C端包括可伸缩的“鱼竿状”结构域进行，该二聚体被认为是多聚体化的原聚体。该原聚体通过可能为N端的巨大的球形结构域连接以形成多聚体。VWF看来以260kD的糖基化前体形式产生，该前体随后经加工和硫化。经二聚化和多聚化并经蛋白酶切割后，成熟的蛋白约为225kD。重组产生了VWF。VWF的核苷和氨基酸序列为本领域所已知。(例见Sadler等1986.冷泉港定量生物学研讨会冷泉苍定量生物学研讨会(Cold Spring Harbor Symposiumin Qunatitative Biology)51515或Genebank Accession Nos.L15333或K03028)。EP0197592B1的内容在此引入作为参考。
除天然存在的VWF外，术语“因子VWF”还包括非天然存在形式，例如，因子VWF的突变形式，该突变形式保持了治疗功能，例如因子VWF的促进止血性质。例如，可以同编码人类因子VWF的DNA杂交的DNA序列可以用来产生在本发明的范围内的VWF蛋白，上述杂交过程在避免同非因子VWF基因杂交的条件下进行(例如，在相当于65℃下5×SSC中(1×SSC＝150mM NaCl/0.15M柠檬酸钠)进行)，除此外，同编码对于因子VWF功能十分重要的蛋白结构域的核酸分子区域保持序列同一性的DNA序列可以用来产生在本发明的范围内的因子VWF蛋白。
在一个实施方案中，促进止血的试剂来源于哺乳类。在一个优选的实施方案中，促进止血的试剂来源于猪。在一个更为优选的实施方案中，促进止血的试剂来源于人类。在另一个实施方案中，促进止血的试剂为杂种分子。III.免疫调节试剂在一个实施方案中，抑制T细胞中的一种共同刺激信号的试剂为一种共同刺激分子的天然存在形式。共同刺激分子的天然存在形式可从细胞中纯化或使用本领域已知技术重组产生。例如，可以在细胞中表达一个编码一种共同刺激分子的核酸分子来制造共同刺激蛋白，从而产生了一种共同刺激分子。共同刺激分子的核苷序列在本领域中已知并可见于文献或数据库，例如Genebank.例见，B7-2(Freeman等1993Science.262909或Genebank Accession Nos.P42081或A48754)；B7-1(Freeman等1991.药物实验杂志(J.Exp.Med.)174625；或Genebank Accession Nos.P33681或A45803)；CTLA4(例见Ginsberg等1985Science.)2281401；或GenebankAccession Nos.P16410或291929)和CD28(Aruffo国家科学院院刊Seed.Proc.Natl.Acad.Sci.)848573或GenebankAccession Nos.180091)，ICOS(Hutloff等1999.Nature.397263；WO98/38216)以及相关序列。
除天然存在的共同刺激分子外，术语“共同刺激分子”还包括非天然存在形式，例如，共同刺激分子的突变形式，该突变形式保持了共同刺激分子功能，例如有结合同源反受体能力。例如，可以同编码B7分子，CTLA4分子，CD28分子或ICOS分子的DNA杂交的DNA序列为本发明的范围内的共同刺激分子，上述杂交过程在避免同非共同刺激分子基因杂交的条件下进行(例如，在相当于65℃下5×SSC中(1×SSC＝150mM NaCl/0.15M柠檬酸钠)进行)。或者，同编码对于共同刺激分子功能，例如与其他共同刺激分子结合的功能，十分重要的蛋白结构域的核酸分子区域保持序列同一性的DNA序列可以用来产生共同刺激分子蛋白，该蛋白可被用作抑制T细胞内的共同刺激信号的试剂。优选情况下，非天然存在的共同刺激分子同天然存在的共同刺激分子细胞外结构域的氨基酸序列具有很大(例如，大于70％，优选情况下大于80％，更优选的情况下大于90-95％)的氨基酸同一性。
为确定共同刺激分子中有可能在共同刺激分子与其反受体结合中十分重要的氨基酸残基，含有不同物种的，例如小鼠和人的共同刺激分子的胞外结构域的氨基酸序列经排列比较并标出保守残基(例如，相同的残基)。这可以使用任何标准的排列比较程序来完成，例如MegAlign(DNA STAR)。这些保守或相同残基很可能对于共同刺激分子同它们的受体的正确结合是必要的，因此可能是难于改变的。
对于结合十分重要的共同刺激分子的具体残基已被确认。例如，已经通过应用定位诱变，CD28单克隆抗体表位图谱，依据于受体的粘附性分析以及Ig-融合蛋白同细胞表面受体的直接结合确认出了CD28中对于其同B7-1和B7-2结合十分关键的部分。CD28中一段富含脯氨酸的序列，MYPPPY，已被发现对于该蛋白的这一功能十分关键(Truneh等1996.分子免疫(Mol.Immunol.)33321)。与此类似，通过诱变已经确认了B7-1分子中对于调控其同CD28和CTLA4的相互作用十分重要的区域。包括Y87残基在内的B7-1的V型区域内的两个疏水残基被发现是很关键的，这两个残基在从各种物种中克隆出的所有的B7-1和B7-2分子中均是保守的(Fargeas等1994.J.Exp.Med.182667)。使用这些或类似的技术可以确认出共同刺激分子胞外结构域中的十分关键并且不能改变的氨基酸残基。
共同刺激分子可以可溶形式表达或用作免疫原以制造抗体。这些可溶的共同刺激分子或抗体可用作抑制T细胞中的共同刺激信号的试剂，如本文的进一步详细描述。A.在细胞外抑制T细胞中的共同刺激信号的试剂1.可溶形式的共同刺激分子在一个实施方案中，阻断T细胞内的共同刺激信号的试剂为一种可溶形式的T细胞共同刺激分子(例如，CTLA4，CD28和/或ICOS)，该分子能阻断一种共同刺激信号在T细胞中的转导。
在一个实施方案中，该阻断T细胞内的共同刺激信号的试剂为一种可溶形式的CTLA4。编码人类和小鼠的CTLA4蛋白的DNA序列在本领域中为已知，例见Dariavich，等(1998)欧洲免疫杂志(Eur.J.Immunol.)18(12)，1901-1905；Brunet，J.F.，等(1987)，上文；Brunet，J.F.等(1988)免疫研究(Immunol.Rev.)10321-36以及Freeman，G.J.等(1992)免疫学杂志(J.Immunol.)149，3795-3801。在特定的实施方案中，可溶的CTLA4蛋白含有全部CTLA4蛋白。在优选的实施方案中，可溶的CTLA4蛋白含有CTLA4蛋白的胞外结构域。例如，一个可溶的重组形式的CTLA4的胞外结构域在酵母中进行表达(Gerstmayer等1997.FEBS Lett.40763)。在其它的实施方案中，可溶的CTLA4蛋白含有CTLA4蛋白胞外区结构域的至少一个部分，该部分保持了与B7-1和/或B7-2结合的能力。
在一个实施方案中，可溶的CTLA4蛋白或其一部分是一种融合蛋白，它至少含有CTLA4的与B7-1和/或B7-2结合的一部分和另一种非CTLA4蛋白的至少一部分。在优选的实施方案中，CTLA4融合蛋白含有一个CTLA4的胞外结构域，该结构域在氨基端与一个信号肽融合，例如，来自制瘤素M(例见WO93/00431)。
在特别优选方案中，可溶形式的CTLA4蛋白是一种融合蛋白，该融合蛋白含有CTLA4的胞外结构域，该结构域融合于一种免疫球蛋白分子的一部分。这样的融合蛋白CTLA4Ig可使用本领域已知的方法来产生(例见，Linsley 1994.Perspectives in Drug Discovery andDesign2221；Linsley WO93/00431和美国专利5,770,197)。
在一个实施方案中，该阻断T细胞内的共同刺激信号的试剂为一种可溶形式的抗原，该抗原呈递细胞共同刺激分子(例如，一种B7家族分子，例如B7-1，B7-2和/或一种ICOS配基)。例如，在一个实施方案中，可溶形式的共同刺激分子包括一种可溶形式的B7-1或一种可溶形式的B7-2或一种可溶形式的B7-1和一种可溶形式的B7-2的一种组合。编码B7蛋白的DNA序列在本领域中是已知的，例见，B7-2(Freeman等1993Science.262909或GenebankAccession Nos.P42081或A48754)；B7-1(Freeman等1991.J.Exp.Med.174625或Genebank Accession Nos.P33681或A45803)。在特定的实施方案中，可溶的B7蛋白含有全部B7蛋白。在优选的实施方案中，可溶的B7蛋白含有B7蛋白的胞外结构域。例如，已经在酵母中表达出一个可溶的重组形式的B7的胞外结构域(Gerstmayer等1997.FEBS Lett.40763)。在其它的实施方案中，可溶的B7蛋白含有B7蛋白胞外区结构域的至少一个部分，该部分保持了与CTLA4和/或CD28结合的能力。
在一个实施方案中，可溶的B7蛋白或其一部分是一种融合蛋白，它至少含有B7的与CD28和/或CTLA4结合的一部分和另一种非B7蛋白的至少一部分。在优选的实施方案中，B7融合蛋白含有一个B7的胞外结构域，该结构域在氨基端与一个信号肽融合，例如，来自制瘤素M(例见WO93/00431)。
在特别优选方案中，可溶形式的B7蛋白是一种融合蛋白，该融合蛋白含有B7的胞外结构域，该结构域融合于一种免疫球蛋白分子的一部分。这样的融合蛋白B7Ig可使用本领域已知的方法来产生(例见，Linsley1994.Perspectives in Drug Discovery and Design2221；Linsley WO93/00431，美国专利5,770,197和美国专利5,580,756)。
2.与共同刺激分子结合的抗体在一些实施方案中，该阻断T细胞内的共同刺激信号的试剂为一种与共同刺激分子结合的抗体。在与共同刺激分子结合的抗体的产生中，使用标准方法可以使用一种共同刺激蛋白，一种共同刺激蛋白的一部分，(例如，从一种共同刺激蛋白衍生的一种肽)或含有一种共同刺激分子的全部或部分氨基酸序列的全部或部分的融合蛋白来产生抗蛋白和/或抗肽段的多克隆抗血清或单克隆抗体。本文使用的术语“抗体”意思包括全部抗体以及其片段。抗体的片段(例如，Fab’片段，F(ab’)2片段或单链抗体)可通过本领域已知的方法产生。术语抗体还包括嵌合或人源化抗体。
例如，可以以一种免疫原形式的共同刺激蛋白或肽段使一种哺乳动物(例如小鼠，仓鼠或兔)免疫化，该免疫原形式的共同刺激蛋白或肽段可引发哺乳动物中的抗体反应。该免疫原可以是，例如，一种重组共同刺激分子蛋白或其片段，一种合成的肽片段或一种在其表面表达一种共同刺激分子的细胞。该细胞可以是，例如，一种抗原呈递细胞或T细胞或被一种核酸转染的细胞，该核酸编码一种共同刺激分子以使该共同刺激分子在细胞表面被表达。经转染以表达肽段的宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。例如，一个具有共同刺激分子活性的肽段可以在细菌细胞，如E.coli，昆虫细胞(杆状病毒)，酵母或哺乳细胞，如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)和NSO细胞中表达。其它适宜的宿主细胞和表达载体可见于上文的Goeddel，(1990)的文献或为本领域的技术人员所知。用于酵母啤酒糖酵母(S.Cerivisae)中表达的载体的例子包括pYepSec1(Baldari.等，(1987)Embo J.6229-234)，pMFa(Kurjan和Herskowitz，(1982)Cell30933-943)，pJRY88(Schultz等，(1987)Gene54113-123)，以及pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)。可得到的用于在培养的昆虫细胞(SF9细胞)中表达蛋白的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等，(1983)分子细胞生物学(Mol.Cell Biol.)32156-2165)和pVL系列(Lucklow，V.A.，和Summers，M.D.，(1989)病毒学(Virology)17031-39)。一般来说，COS细胞(Gluzman，Y.，(1981)Cell23175-182)与诸如pCDM8(Seed，B.，(1987)Nature329840)的载体共同用于在哺乳细胞中的瞬时扩增/表达，而CHO(dhfr-中国仓鼠卵巢)细胞同诸如pMT2PC(Kaufman等(1987)，EMBO J.6187-195)的载体共同用于在哺乳细胞中的稳定扩增/表达。用于重组蛋白生产的一个优选细胞系为NSO骨髓瘤细胞系，它可获自ECACC(目录号#85110503)，其描述见Galfre，G.和Milstein，C.((1981)酶学方法(Methods in Enzymology)73(13)3-46；和单克隆抗体的制备策略和方法(Preparation of MonoclonalAntibodiesStrategies and Procedures)，科学出版社，N.Y.，N.Y.)。载体DNA可通过传统技术引入哺乳细胞，例如磷酸钙或氯化钙共沉淀，DEAE-葡聚糖介导的转染，脂质体或电穿孔。用于转化宿主细胞的适当方法可见于Sambrook等(分子克隆实验手册(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第二版冷泉港实验出版社(1989))，以及其它实验室书籍。在哺乳细胞中使用时，表达载体的控制功能通常由病毒材料提供。例如，常用的启动子来自多瘤病毒，腺病毒2，细胞巨化病毒和最常用的猿猴病毒40。
在哺乳细胞或其它细胞中表达的具共同刺激分子活性的肽段可通过本领域的标准过程纯化，该过程包括硫酸铵沉淀，分离柱层析(例如，离子交换，凝胶过滤，电泳，亲和层析等等)以及最终的结晶(通常见于“酶纯化和相当技术(Enzyme Purification and RelatedTechiques)”，酶学中的方法(Methods in Enzymology)，22233-577(1971))。
本领域的技术人员将会赞同，通过以下的标准工艺产生针对人类共同刺激分子的抗体在他们的技术范围内。抗体可以是多克隆或单克隆抗体，或这些抗体的抗原结合片段。对于医疗应用具有特别意义的是抑制共同刺激分子同其在免疫细胞表面上的天然配基结合并因此而抑制免疫细胞的共同刺激的抗体。优选的抗共同刺激分子抗体能够通过与B淋巴细胞表面上的B7-2或B7-1结合并阻止同CTLA4和/或CD28的相互作用而抑制或负调节T细胞介导的免疫反应。其它的优选的抗共同刺激分子抗体能够同第二种可与另一种共同刺激分子结合的抗体共同作用，从而同第一种抗体单独作用相比产生对T细胞的共同刺激的加强的抑制，例如，抗B7-1同抗B7-2抗体的共同作用。
A.免疫原。本文所用的术语“免疫原”用于描述一种组合物，该组合物含有一种肽段，该肽具有作为用于制备抗共同刺激分子抗体的活性成分的共同刺激分子活性。当具有一种共同刺激分子活性的肽段被用于诱导抗体时，可以理解该肽段可以单独使用或连接于一种载体作为交联物或作为肽段多聚体使用。
为产生适当的抗共同刺激分子抗体，该免疫原必须含有有效的免疫原性量的肽段，该肽段具有一种共同刺激分子活性并通常作为连接于一种载体的偶联物。如本领域所已知，单位剂量的肽段的有效量除其它因素外还取决于被接种的动物种类，该动物的体重以及选择的免疫化方法。该免疫原制剂典型地是每一免疫剂量含有约10微克至约500毫克的肽浓度，优选情况下每剂量含有约50微克至约50毫克的肽段。一种免疫化制剂还可以包括作为稀释液的一部分的佐剂。诸如弗氏完全佐剂(CFA)，弗氏不完全佐剂(IFA)或矾这样的佐剂是本领域所熟知的物质并且可由多个商业来源购得。
本领域的技术人员将会赞同，合成肽段可以替代天然存在形式的用于免疫化的共同刺激分子被用于产生在本发明中使用的抗体。可溶的和膜结合形式的共同刺激分子或肽段均适合用作免疫原并且可通过免疫亲和纯化分离。一种共同刺激分子蛋白的一种纯化形式，如按上文或本领域所知方法分离而得的分子，本身可直接被用作免疫原，或在替代情况下可通过传统技术连接于一种适当的载体蛋白，该技术包括化学偶联法，以及利用共同刺激分子的被克隆基因所进行的遗传工程。
被选择用于免疫化的肽段或蛋白可经过修饰以提高其免疫原性。例如，用于赋予一种肽段以免疫原性的技术包括同载体交联或其他本领域所已知的技术。任何被选择用于免疫化的肽段还可以经合成产生。在特定的实施方案中，如本领域所已知，该肽段可以被合成为分支多肽以增强免疫反应(例见Peptides.Bernd Gutte AcademicPress出版1995.pp.456-493)。
该纯化的共同刺激分子蛋白还可以共价地或非共价地被诸如脂类或碳水化合物这样的非蛋白物质所修饰以增强其免疫原性或可溶性。在替代情况下，一种纯化的共同刺激分子蛋白可以偶联于或被包含入一种病毒粒子，一种复制病毒或其它微生物体以增强其免疫原性。例如，该共同刺激分子蛋白可以化学附着于病毒粒子或微生物体或它们的免疫原性部分。
在一个阐释性的实施方案中，一种纯化的共同刺激分子蛋白或一种具有一种共同刺激分子活性的肽段(例如，通过限制性的蛋白酶水解或重组DNA技术)被偶联于一个在动物体内具免疫原性的载体。优选的载体包括蛋白如白蛋白，血清蛋白(例如球蛋白或脂蛋白)和多聚氨基酸。可用的蛋白的例子包括牛血清白蛋白，兔血清白蛋白，甲球蛋白，钥孔血蓝素，卵清蛋白和牛γ一球蛋白。合成的多聚氨基酸，例如多聚赖氨酸或多聚精氨酸，也是可用的载体。对于一种共同刺激分子蛋白或肽段同适当的免疫原性载体的共价粘着，本领域的技术人员已知了一大批化学交联试剂。优选的交联剂为异双功能交联剂，它们可用于对蛋白逐步连接。本领域已知了相当多种的异双功能交联剂，包括琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，间-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)；N-琥珀酰亚胺基(4-碘代乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)，琥珀酰亚胺基4-(对-马来酰亚胺苯基)丁酸酯(SMPB)，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)；4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-a-甲基-a-(2-吡啶基二硫基)-tolune(SMPT)，N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚胺基6-[3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯]己酸酯(LC-SPDP)。
使用在其表面表达一种共同刺激分子蛋白的细胞进行简单的免疫化也是需要的。多种细胞系可被用作免疫原以产生针对共同刺激分子抗原的单克隆抗体，这些细胞系包括被激活的B细胞，但不止于此。例如，可以从一个受试者中获取脾脏B细胞并以抗免疫球蛋白激活。在替代情况下，如果一种共同刺激分子被一种B细胞在表面表达，该B细胞系便可被使用，例如Raji细胞系(B细胞Burkett’s淋巴瘤，例见Freeman，G.J.等(1993)Science262909-911)或JY B淋巴母细胞系(例见，Azuma，M.等(1993)Nature36676-79)。可被用作免疫原以产生共同刺激分子特异的抗体的全细胞还包括重组转化子。例如，通过以共同刺激分子的cDNA转染可以重新构建COS和CHO细胞以在细胞表面产生完整共同刺激分子，如Knudson等(1993，PNAS904003-4007)；Travernor等(1993，免疫遗传学(Imminogenetics)37474-477)；Dougherty等(1991，J.Exp.Med.1741-5)；以及Aruffo等(1990，Cell611303-1313)中所描述。这些转化子细胞随后被用作免疫原以产生具预选的特异性的抗共同刺激分子抗体。已知其它的转化子细胞的例子，尤其是能够糖基化共同刺激分子蛋白的真核细胞，但任何用于在细胞表面表达被转染的共同刺激分子基因的过程均可被用于产生全细胞免疫原。B.多克隆抗共同刺激分子抗体。
针对纯化的具有共同刺激分子活性的共同刺激分子蛋白或肽段的多克隆抗体可通过以共同刺激分子免疫原，如一种共同刺激分子蛋白的胞外结构域，和佐剂进行多次皮下(SC)或腹膜内(ip)注射而在动物体内产生。例如，如上文所述，将一种共同刺激分子(包括含特别的目的表位的片段)同在待免疫化物种中具免疫原性的蛋白相偶联可能是有用处的，后一蛋白的例子有钥孔血蓝素，血清白蛋白。
宿主动物或其产生的被培养的产抗体细胞的途径及时间的安排通常利用已有的用于抗体刺激和产生的传统技术。在一个阐释性的实施方案中，对动物进行的针对免疫原性共同刺激分子偶联物或衍生物的免疫化一般通过以大约1μg-1mg的偶联物和弗氏完全佐剂相结合并将该溶液在多个位置进行皮下注射来完成。一个月后，以含1/5-1/10原始量的交联物的弗氏完全佐剂(或其它适当的佐剂)在多个位置进行皮下注射来对给动物进行加强。7到14天后，对动物取血，并分析该血清的抗共同刺激分子滴度。动物被进行加强直至滴度平稳。在优选情况下，对动物的加强利用同样的共同刺激分子蛋白的偶联物，但该蛋白同与前次不同的蛋白或通过不同的交联剂进行偶联。偶联物还可以在重组细胞培养物中以融合蛋白形式产生。还可以使用凝聚试剂，例如矾来增强免疫反应。
这样的哺乳类生产的抗体分子群体被称为多克隆的，这是因为该群体含有具不同的免疫特异性的抗体，它们对共同刺激分子具不同的亲和性。该抗体通过本领域已知的技术从哺乳动物体内收集并分离以获得IgG组分，例如，使用DEAE Sephadex。为增强抗体的特异性，该抗体可使用固相固定的免疫原进行免疫亲合层析来纯化。该抗体与固相固定的免疫原接触足以使免疫原与抗体分子发生免疫反应以形成固相一固定的免疫复合体的时间。结合的抗体可通过标准技术从复合体中分离。
C.单克隆抗共同刺激分子抗体。本文所使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指的是一种抗体分子群体，该群体只含有一种抗体，该抗体只具有一种抗原结合位点，该位点可以与一种共同刺激分子的一个特定表位发生免疫反应。因此单克隆抗体组合物典型地对一种可与之免疫反应的特定的共同刺激分子蛋白表现出单一的结合亲和性。在优选情况下，在本方法中使用的单克隆抗体进一步的特征在于其与来自人类的共同刺激分子发生免疫反应。
本发明的组合物和方法中使用的单克隆抗体直接针对于一种共同刺激分子抗原的一个表位，这样，抗体和共同刺激分子抗原之间复合物的形成便抑制了共同刺激分子同其在免疫细胞表面的天然配基的相互作用并且因此抑制了通过共同刺激分子-配基相互作用而对T细胞的共同刺激。针对一种共同刺激分子的一个表位的单克隆抗体的制备可使用通过连续细胞系培养来产生抗体分子的技术。这些技术包括，Kohler和Milstein所原始描述的杂交瘤技术(1975，Nature256495-497)，以及最近的人类B细胞杂交瘤技术(Kozbor等(1983)今日免疫学(Immunol.Today)472)，EBV-杂交瘤技术(Cole等(1985)，单克隆抗体和癌症治疗(Monoclonal Antibodies andCancer Therapy)，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)和三体瘤技术，但不限于此。其它可有效地产生可用于本发明的单克隆抗体的技术包括噬菌体显示技术(Marks等(1992)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)16007-16010)。
在一个实施方案中，本发明方法使用的抗体制剂为产自杂交瘤细胞系的单克隆抗体。杂交瘤融合技术最早由Kohler和Milstein(Kohler等Nature(1975)，256495-497；Brown等(1981)免疫学杂志(J.Immunol.)127539-46；Brown等(1980)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)2554980-83；Yeh等(1976)PNAS762927-31；Yeh等(1982)Int.J.Cancer29269-75)所引入。这样，本发明的单克隆抗体组合物可以通过以下方法所产生，这包括下列步骤(a)以一种共同刺激分子免疫一种动物。该免疫化典型地通过以一种共同刺激分子免疫原对具免疫能力的哺乳动物进行给药来进行，给药量为免疫有效量，即足以产生免疫反应的量。在优选情况下，该哺乳动物为啮齿类动物，例如兔，大鼠或小鼠。随后使该动物存活一段时期，该期间应足以使该哺乳动物产生分泌同共同刺激分子免疫原发生免疫反应的抗体分子的细胞。通过对这样产生的抗体分子筛选与免疫原蛋白制剂的免疫反应来检测这样的免疫反应。任选地，可以在分析中被抗体分子检测的形式的蛋白制剂，例如膜结合形式的共同刺激分子，可以被用来筛选抗体分子。这些监测方法为本领域中的技术人员所已知。
(b)从各分泌目的抗体的免疫化动物中取出产抗体细胞，将其制成悬浮物。经过足量的时间后，该小鼠被杀死，取得产抗体体淋巴细胞。产抗体淋巴细胞可来自以上动物的淋巴结，脾脏和外周血液。脾脏细胞是优选的，它们可通过本领域已知的方法在生理耐受的介质中经机械分离成个体细胞。小鼠的淋巴细胞可同下述的小鼠骨髓瘤高比例稳定地融合。也可使用大鼠，兔和蛙的体细胞。通过将脾脏细胞同骨髓瘤细胞融合，编码目的免疫球蛋白的脾脏细胞染色体被永生化，该融合通常在融合试剂存在下进行，例如聚乙二醇(PEG)。任何数目的骨髓瘤细胞系均可被用作根据标准技术的融合伴侣，例如，P3-NS1/1-Ag4-1，P3-x63-Ag8.653或Sp2/O-Ag14骨髓瘤细胞系。这些骨髓瘤细胞系可获自美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection)(ATCC)，Rockville，Md。
所产生的包括所需杂交瘤在内的细胞随后在选择培养基，例如HAT培养基上生长，在选择培养基上未融合的亲代骨髓瘤或淋巴细胞将最终死亡。只有杂交瘤细胞存活下来并可在限制稀释条件下生长以获得分离的克隆。对杂交瘤的上清中具所需特异性的抗体进行筛选，例如，使用免疫化所用的抗原进行免疫分析技术。随后在限制性稀释条件下对阳性克隆进行亚克隆并分离所产生的单克隆抗体。有多种传统方法以分离和纯化单克隆抗体以将其从其它蛋白和污染物中分离。常用的纯化单克隆抗体的方法包括硫酸铵沉淀，离子交换层析和亲和层析(例见，Zola等单克隆杂克瘤抗体技术和应用(Monoclonal Hybridoma Antibodies Techniques AndApplications)，Hurell(ed.)pp.51-52(CRC Press 1982))。使用本领域已知的技术，根据这些方法所产生的杂交瘤可在体外或体内(在腹水中)繁殖。
通常情况下，各细胞系可以在体外繁殖，例如在实验室培养管中，并且可以通过倾析，过滤或离心来收集含高浓度的单一特异性单克隆抗体的培养基。或者，单克隆抗体的产率可通过将一杂交瘤样品注射入组织相容性动物中来提高，该动物类型与为原初融合提供体细胞和骨髓瘤细胞的动物同类。分泌产自融合细胞杂合体的特异性单克隆抗体的肿瘤在接受注射的动物体内发展。该动物的体液，如腹水或血清提供了高浓度的单克隆抗体。使用人类杂交瘤或EBV-杂交瘤时必须防止对外源移植物的排斥，该外源移植物被注射入动物，例如小鼠。可以使用免疫缺陷小鼠或裸鼠，或者首先将杂交瘤以实体皮下肿瘤的形式传代到照射的裸鼠中，进行体外培养并随后腹膜内注射入经降植烷致敏的照射过的裸鼠中，该小鼠产生出分泌大量的特异性人类单克隆抗体的腹水肿瘤。
可用于制备这些组合物的培养基和动物均在本领域内已知并可购得，它们包括合成组织培养基，自交的小鼠及其它类似物品。一种示例性的合成培养基是Dulbecco’s极限必需培养基(DMEM；Dulbecco等(1959)Virol.8396)并补充以4.5mg/l葡萄糖，20mM谷氨酸和20％胎牛血清。一种示例性的自交的小鼠品系是Balb/c。
D.人源化的抗共同刺激分子抗体的。当产自非人类对象的抗体被用于人类医疗时，它们在不同程度上被识别为外源物质并且患者体内可能产生免疫反应。一种将这一问题最小化或消除的方法是产生嵌合抗体衍生物，即，一种将非人类动物可变区和人类恒定区组合而成的抗体分子，该方法优于普通的免疫抑制。这样的抗体等效于上述的单克隆和多克隆抗体，但当对人类给药时可能具较低的免疫原性，因此更加可能为患者所耐受。
同共同刺激分子反应的嵌合小鼠-人类抗体(即嵌合抗体)可以通过一些技术生产，如近来所开发出的用于嵌合抗体生产的工艺。例如，人源化的抗体可以通过以相关的非免疫原性部分代替一个抗体的免疫原性部分来生产。因此，编码鼠类(或其它物种)抗共同刺激分子抗体的恒定区的基因被编码人类恒定区的基因所取代。(Robinson等，国际专利申请PCT/US86/02269；Akira，等，欧洲专利申请184，187；Taniguchi，M.，欧洲专利申请171，496；Morrison等，欧洲专利申请173，494；Neuberger等，PCT申请WO86/01533；Cabilly等，欧洲专利申请125，023；Better等(1988 Science2401041-1043)；Liu等(1987)PNAS 843439-3443；Liu等(1987)免疫学杂志(J.Immunol.)1393521-3526；Sun等(1987)PNAS84214-218；Nishimura等(1987)Canc.Res.47999-1005；Wood等(1985)Nature314446-449；Shaw等(1988)J.Natl CancerInst.801553-1559)。“人源化”嵌合抗体的一般性综述见Morrison，S.L.(1985)Science 2291202-1207和Oi等(1986)生物技术(BioTechniques)4214。这些方法包括对编码一种免疫球蛋白可变区的全部或部分的核酸序列的分离，操作处理和表达，该可变区来自一个重链或轻链中的至少一个。这些核酸的来源为本领域的技术人员所熟知，例如，可以获自产生抗共同刺激分子抗体的杂交瘤。该嵌合cDNA随后被克隆入一个适当的表达载体。
在替代情况下，可以通过CDR或CEA替代来产生适当的“人源化”抗体(Winter美国专利5,225,539；Jones等(1986)Nature321552-525；Verhoeyan等(1988)Science 2391534和Beidler等(1988)J.Immunol.1414053-4060)。
E.重组抗共同刺激分子抗体。本发明的单克隆和多克隆抗体组合物均可通过其它方法产生，这些方法为重组DNA技术领域中的技术人员所熟知。一种被称为“重组抗体显示”法的替代方法已被开发出来以确认并分离具特定抗原特异性的抗体片段，该方法可被用于生产单克隆抗共同刺激分子抗体以及多克隆抗共同刺激分子群(Sastry等(1989)PNAS 865728；Huse等(1989)Science 2461275；Orlandi等(1989)PNAS 863833)。按上文所说以一种共同刺激分子免疫原对动物进行免疫化后，对产生的B细胞库中的抗体库进行克隆。通常已知一些方法用于通过使用寡聚引物混合物和PCR来直接获得免疫球蛋白分子多样性库中的可变区的DNA序列。例如，与5’前导序列(信号肽)和/或构架1(FRl)相对应的混合寡聚核苷引物，以及对保守的3’恒定区引物的引物可被用于从大量的鼠类抗体中对重链和轻链可变区进行PCR扩增(Larrick等生物技术(Biotechniques 11152-156)。也可以使用类似的策略事扩增来自人抗体的人重链和轻链可变区Larrick等(1991)MethodsCompanion to Methods in Enzymology 2106-110)。克隆人类免疫球蛋白V-基因的能力对于促进在转基因动物中建立人类抗体库的进展具有特殊的意义(例见，Bruggeman等(1993)Year Immunol.733-40；Tuaillon等(1993)PNAS 903720-3724；Bruggeman等(1991)欧洲免疫学杂志，(Eur J Immunol.)211323-1326；Wood等PCT公开WO91/00906)。
在一个阐释性的实施方案中，RNA通过标准方案(例如，美国专利No.4,683,202；Orlandi等(1989)PNAS863833-3837；Sastry等(1989)PNAS865728-5732；Huse等(1989)Science2461275-1281)自激活的B细胞中分离，如外周血细胞，骨髓或脾脏制备物。使用对重链和各κ和λ轻链的恒定区特异的引物以及信号序列引物合成第一条链CDNA。使用可变区PCR引物扩增出重链和轻链可变区，将其分别或联合连接入适当的载体来进行进一步操作以产生显示包装物。用于扩增方案中的寡核苷引物可以是独特的或简并的或在简并位点引入次黄嘌呤。引物中还引入了限制性核酸内切酶识别序列以使被扩增的片段以预先确定的用于表达的读框克隆入一个载体。
从免疫化抗体库克隆的V基因文库可被一群显示包装物表达以形成抗体显示包装物文库(a population of display packages)，优选情况下该显示包装物来自丝状噬菌体。在理想情况下，该显示包装物包括一个系统，该系统可对种类繁多的抗体显示文库进行取样，经每一次亲和分离后进行快速筛选并可很容易地从纯化的显示包装物中分离出抗体基因。除已经商业化的用于产生噬菌体显示文库的试剂盒(例如，Pharmacia Recombinant Phage Antibody System，目录号no.27-9400-01；Stratagene SurfZAPTMphage display kit，目录号no.240672)外，特别适用于产生多样的抗共同刺激分子抗体显示文库的方法的例子和试剂可见于，例如，Ladner等的美国专利号No.5,223,409；Kang等的国际公开No.WO92/18619；Dower等的国际公开No.WO91/17271；Winter等的国际公开No.WO92/20791；Markland等的国际公开No.WO92/15679；Beritling等的国际公开No.WO93/01288；McCafferty等的国际公开No.WO92/01047；Garrard等的国际公开No.WO92/09690；Lander等的国际公开No.WO90/02809；Fuchs等(1991)生物技术(Bio/Technology)91370-1372；Hay等(1992)Hum AntibodHybridomas381-85；Huse等(1989)Science2461275-1281；Griffths等(1993)EMBO J12725-734；Hawkins等(1992)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)226889-896；Clakson等(1991)Nature352624-628；Gram等(1992)PNAS893576-3580；Garrad等(1991)Bio/Technology91373-1377；Hoogenboom等(1991)核酸研究(Nuc Acid Res)194133-4137；Barbas等(1991)PNAS887978-7982。
在特定的实施方案中，重链和轻链的V区结构域可以在同一条多肽上表达并以柔性连接部分相连以形成单链Fv片段，随后将该scFv基因克隆入所需的表达载体或噬菌体基因组中。如在McCafferty等，Nature(1990)348552-554中的一般性描述，一个抗体的VH和VL的完整结构域经一柔性连接部分(Gly4-Ser)3连接后可被用于产生一个单链抗体，该抗体使该显示包装物可被抗原亲和性分离。具共同刺激分子免疫反应性的被分离的scFV抗体可随后配入医药制剂用于本发明方法。
F.杂交瘤及制备方法。用于本发明的杂交瘤的特征在于它们具有产生单克隆抗体的能力，该抗体与一种共同刺激分子进行特异的免疫反应。如下文所述，该产生抗共同刺激分子抗体的杂交瘤细胞可直接植入受体动物以提供恒定的抗体来源。使用免疫分离设备以包装该杂交瘤培养物可以防止针对该植入细胞的免疫原反应并可防止杂交瘤细胞在免疫不应答宿主中的未校验繁殖(uncheckedproliferation)。本发明的一种优选杂交瘤的特征在于它可产生抗体分子，该抗体分子可与在激活的人类B细胞表面表达的共同刺激分子进行特异的免疫反应。
本领域中已知一些方法用于产生杂交瘤，该杂交瘤产生的，例如分泌的抗体分子具有所需的免疫特异性，既具有结合一种特定的共同刺激分子和/或一共同刺激分子的可确认表型的能力。在Niman等(1983)PNAS804949-4953以及Galfre等(1981)酶学方法(Meth.Enzymol.)733-46中所描述的杂交瘤技术尤其适用。
在另一个阐释性的方法中，携带人类抗体库的转基因小鼠可以用一种人类共同刺激分子进行免疫化。来自于这些免疫过的转基因小鼠的脾脏细胞随后可以被用于产生分泌人类单克隆抗体的杂交瘤，这些抗体可与一种人类共同刺激分子进行特异性反应(例见，Wood等PCT公开WO91/00906；Kucherlapati等PCT公开WO91/10741；Lonberg等PCT公开WO92/03918；Kay等PCT公开WO92/03917；Lonberg N.等(1994)Nature368856-859；Green，L.L.等(1994)Nature Genet.713-21；Morrison，S.L.等(1994)美国国家科学院院刊816851-6855；Bruggeman et al.(1993)Year Immunol733-40；Tuaillon等(1993)PNAS903720-3724；Bruggeman等(1991)欧洲免疫学杂志(Eur J Immunol)211323-1326)。
本文所用的术语“抗体”包括其片段，该片段如本文所述同样与一种共同刺激分子进行特异性反应。抗体可以使用传统技术被片段化并以上文所述的用于完整抗体的方法检测该片段的实用性。例如，可以用胃蛋白酶处理抗体以产生F(ab’)2片段。所产生的F(ab’)2经处理将二硫键还原以产生Fab’片段。
使用这些或其它方法所产生的抗体可经下文所述方法进行检测以确定其是否抑制T细胞中的一种共同刺激信号。
在一个实施方案中，抑制T细胞中的一种共同刺激信号的试剂为一种抗体，该抗体同B7-1和B7-2均结合。在这样的一种抗体的制造中，例如，在这两种共同刺激分子中保守的部分细胞外结构域被用作免疫原。例见，Metzler等1997Nat Struct.Biol.4527。
在一个实施方案中，抑制T细胞中的一种共同刺激信号的试剂为一种抗体，该抗体同B7-1结合。这样的抗体为本领域所已知或可如上文使用B7-1分子或其一部分作为免疫原来产生，并可通过上文方法或其它标准方法来筛选。B7-1抗体的例子包括在美国专利号5,747,034和Mchugh等1998.Clin.Immunol.Immunopathol.8750或Rugtveit等1997.监床免疫实验(Clin Exp.Immunol.)110104中描述的那些。
在另一个实施方案中，抑制T细胞中的一种共同刺激信号的试剂为一种抗体，该抗体同B7-2结合。这样的抗体为本领域所已知或可如上文使用B7-2分子或其一部分作为免疫原来产生，并可通过上文方法或其它标准方法来筛选。B7-2抗体的例子包括在Rugtveit等1997.Clin Exp.Immunol.110104中描述的那些。
在一个实施方案中，阻断T细胞中的一种共同刺激信号的试剂为一种与B7-1结合的抗体和一种与B7-2结合的抗体的组合物。
在其它的实施方案中，抑制T细胞中的一种共同刺激信号的试剂为一种抗体，该抗体同CD28结合，但并不向T细胞转导共同刺激信号(例如，一种抗CD28抗体的Fab片段)。这样的抗体为本领域所已知或可如上文使用CD28分子或其一部分作为免疫原来产生，并可通过上文方法或其它标准方法来筛选。抗CD28抗体的例子包括在Darling等1997.Gene Ther.41350中描述的那些。
在优选的实施方案中，一种与CD28结合的抗体的Fab片段被使用。这些不能交联T细胞表面的CD28的抗体片段被发现阻断T细胞的共同刺激(Walunas等1994.免疫(Immunity)1405)。
在其它的实施方案中，抑制T细胞中的一种共同刺激信号的试剂为一种同CTLA4结合的抗体，该抗体通过向T细胞递送T细胞中的一种负信号而阻断T细胞中的一种共同刺激信号(即，该抗体为CTLA4的一种拮抗剂)。例如，已经表明CTLA4在T细胞表面的交联抑制增殖和IL-2的产生(Krummel和A1lison.1996.J.Exp.Med.1832533)。这样的抗体可如上文使用CTLA4分子或其一部分作为免疫原来产生，并可通过上文方法或其它标准方法来筛选。示例性的例子还包括在Vandenborre等1998.Am.J.Pathol.152963中描述的那些。
在另一个实施方案中，抑制T细胞中的一种共同刺激信号的试剂为一种同ICOS结合的抗体，该抗体阻断T细胞中的一种共同刺激信号。这样的抗体可如上文使用ICOS分子或其一部分作为免疫原来产生，并可通过上文方法或其它标准方法来筛选。IV.调节共同刺激分子表达的试剂在另一个实施方案中，抑制T细胞中的一种共同刺激信号的试剂为一种干扰共同刺激分子表达的试剂。例如，已经发现抗原呈递细胞上的CD40同T细胞上的CD40配基之间的作用对于B7-1或B7-2在抗原呈递细胞上的表达的维持、增强或延长很重要，其结果为共同刺激的增强(Van Gool，等1996.免疫学研究(Immunol.Rev.)15347；Klaus等1994.免疫学杂志(J.Immunol.1525643)。
在一个实施方案中，阻断一种共同刺激分子的表达并由此而阻断T细胞中的一种共同刺激信号的试剂为一种可溶形式的CD40或CD40L。编码CD40或CD40L的DNA序列在本领域中是已知的，CD40例见GenBank Accession Nos.Y10507或Stamenlovic等1988.EMBOJ.71053-1059；CD40L例见Gauchat等FEBS315(3)259-266；Graf等1992.欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)223191-3194；Seyama1996.Hum.Genet.97180-185或GenBank AccessionNos.L07414，X67878，X96710。
在一个实施方案中，阻断一种共同刺激分子的表达并由此而阻断T细胞中的一种共同刺激信号的试剂为一种可溶形式的CD40或CD40L。在一个实施方案中，可溶形式的CD40或CD40L蛋白包括该全蛋白。例如，一种可溶的重组形式CD40或CD40L蛋白或其部分的细胞外结构域可以以融合蛋白形式制造，该融合蛋白至少含有CD40或CD40L的一部分以便于中断在APC上的CD40同T细胞上的CD40L之间的相互作用并抑制共同刺激信号向T细胞的传送。这样的可溶的重组形式CD40或CD40L蛋白至少含有该分子的一部分，该部分使其足以结合于其对应受体并至少含有非CD40或CD40L的第二种蛋白的一部分。在优选的实施方案中，该CD40或CD40L融合蛋白含有一种CD40或CD40L的细胞外结构域，该结构域在其氨基末端与一种信号肽融合，例如，来自于制瘤素M的信号肽(例见，WO93/00431)。
在一个特别优选的方案中，可溶形式的CD40或CD40L是一种融合蛋白，该融合蛋白含有CD40或CD40L的细胞外结构域，该结构域同一种免疫球蛋白分子的一部分相融合(例如，Chen等1995 J.Immunol.1552833)。这样的融合蛋白CD40Ig或CD40LIg可以使用本领域已知的方法进行制造(例见，Linsley1994.药物发现和设计展望(Perspectives in Drug Discovery and Design)2221；Linsley的WO93/00431，美国专利号5,770,197和美国专利号5,580,756)。
另外，已经发现针对CD40配基的抗体同抑制T细胞中的一种共同刺激信号的试剂协同作用可以提高移植耐受性(Kirk等1997.美国国家科学院院刊948789；Larsen等1996 Nature 381434)。因此，在一个实施方案中，针对CD40或CD40L的抗体可以被用作阻断T细胞中的一种共同刺激信号的试剂，该抗体与这些分子结合但并不诱导共同刺激分子的表达。V.在细胞内作用以抑制一种共同刺激信号的试剂在一个实施方案中，抑制T细胞中的一种共同刺激信号的试剂为一种在细胞内作用以抑制这样的信号的试剂。通过CD28表面受体对T细胞的刺激(即，一种共同刺激信号)导致T细胞中的D-3磷酸肌醇的产生。因此，在一个实施方案中，可以通过抑制T细胞中的D-3磷酸肌醇的产生来抑制一种共同刺激信号并由此而抑制T细胞反应，该抑制例如通过T细胞增殖和/或细胞因子的产生来衡量。术语“D-3磷酸肌醇”包括磷脂酰肌醇的衍生物，该分子中肌醇环的D-3位置被磷酸化，该术语还包括化合物磷脂酰肌醇(3)-单磷酸(PtdIns(3)P)，磷脂酰肌醇(3，4)-二磷酸(PtdIns(3，4)P2)，磷酸肌醇(3，4，5)-三磷酸(PtdIns(3，4，5)P3)。
D-3磷酸肌醇在细胞内通过一种磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的活性产生。PI3K是一种异二聚体，它由一个85kDa的亚基和一个110kDa的催化亚基组成，该85kDa的亚基通过其SH2结构域同酪氨酰磷酸化的蛋白相结合。PI3K最初被认定为脂类激酶，它磷酸化磷脂酰肌醇，PtdIns(4)P和PtdIns(4，5)P2的肌醇环的D-3位置。近来的两项研究表明PI3K实际上是一种双特异性激酶，它既有脂类又有丝氨酸激酶活性(Dhand，R.等(1994)EMBO J.13522和Carpenter，C.L.等(1993)分子细胞生物学Mol.Cell.Biol.131657)。
因此，在一个实施方案中，抑制T细胞中的一种共同刺激信号的试剂为一种抑制PI3K活性的试剂。一种抑制T细胞中PI3K活性的优选试剂为真菌代谢渥曼青霉素(wortmannin)或其衍生物或其类似物。渥曼青霉素是一种强力的PI3K抑制剂，它来自于T.wortmannii(Kyowa Hakko Kohyo Co.Ltd.)或来自于P.fumiculosum(Sigma)。渥曼青霉素衍生物或类似物包括在结构上与渥曼青霉素相关的化合物，该化合物保持了抑制PI3K和T细胞反应的能力。渥曼青霉素的衍生物或类似物的例子披露于Wiesinger，D.等(1974)Experientia30135-136；Closse，A.等(1981)J.Med.Chem.241465-1471和Baggiolini，M.等(1987)Exp.Cell.Res.169408-418。另一种可以使用的PI3K活性的抑制剂为生物黄酮素(bioflavenoid)木斛皮素或其衍生物或其类似物。木斛皮素或其衍生物或其类似物包括在结构上与木斛皮素相关的化合物，该化合物保持了抑制PI3K和抑制T细胞反应的能力。木斛皮素的衍生物或类似物的例子披露于Vlahos，C.J.等(1994)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)2695241-5284。一种抑制PI3K活性的优选的木斛皮素衍生物为LY294002(2一(4-吗啉基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮，Lilly Indianapolis，IN)(描述见上文引用的Vlahos等人的文献)。
已经表明CD28刺激导致T细胞中蛋白质的酪氨酸磷酸化(例见，Vandenberghe，P.等(1992)药物实验杂志(J.Exp.Med.)175951-960；Lu，Y.等(1992)免疫学杂志(J.Immunol.)14924-29)。因此，在一个实施方案中，抑制T细胞中的一种共同刺激信号的试剂抑制T细胞中的酪氨酸磷酸化。一种优选的蛋白酪氨酸激酶的抑制剂为一种抑制src蛋白酪氨酸激酶的抑制剂。在一个实施方案中，该src蛋白酪氨酸激酶的抑制剂为除莠霉素A，或其衍生物或其类似物。除莠霉素A的衍生物或其类似物包括在结构上与除莠霉素A相关的化合物，该化合物保持了抑制蛋白酪氨酸激酶活性的能力。在另一个实施方案中，该抑制蛋白酪氨酸的磷酸化的试剂为一种蛋白酪氨酸磷酸酶或一种蛋白酪氨酸磷酸酶的一种激活剂。通过提高T细胞中的酪氨酸磷酸酶活性，蛋白质酪氨酸磷酸化净量被降低。该蛋白酪氨酸磷酸酶可以是T细胞内的细胞蛋白酪氨酸磷酸酶，例如，CD45或Hcph。对T细胞上的一种细胞表面酪氨酸磷酸酶的活性的激活可以通过使T细胞同一种与磷酸结合并刺激其活性的分子结合来完成。例如，一种直接针对CD45的抗体可以被用来刺激在表面表达CD45的T细胞中的酪氨酸磷酸酶活性。因此，在一个实施方案中，抑制T细胞中的蛋白酪氨酸磷酸化的试剂为一种抗CD45抗体，或其一个片段，该片段保持了刺激CD45活性的能力。抗体片段的例子包括Fab和F(ab’)2片段。抗体或其片段可以以刺激形式提供，例如多聚化或固定化等等。
另外，已经发现CD28连接同磷脂酶C活性的提高(例见，Nunes，J.等(1993)Biochem.J.293835-842)和胞内钙水平的提高(例见Ledbetter，J.A.等(1990)Blood 751531-1539和实施例)相联系。因此，一种在细胞内作用以抑制T细胞内的一种共同刺激信号的试剂的作用可以通过抑制磷脂酶C的活性和/或抑制细胞内钙水平的提高来实现。例如，酪氨酸激酶抑制剂除莠霉素A还抑制CD28诱导的T细胞内钙流(flux)。
同时已经表明，蛋白质丝氨酸和丝氨酸-苏氨酸激酶参与同CD28相关的信号转导通路(Siegel，J.N.等(1993)J.Immunol.1514116-4127；Pai，S.V.等(1994)免疫学杂志(J.Immunol.)242364；Parry等1997.欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)272495)。这样，在本发明的另一个实施方案中，一种在细胞内作用以抑制T细胞内的一种共同刺激信号的试剂抑制丝氨酸或丝氨酸-苏氨酸激酶活性。VI.其它阻断T细胞共同刺激的试剂其它阻断T细胞中的一种共同刺激信号的试剂可以使用标准技术来确认。例如，可以通过抑制T细胞增殖和/或细胞因子产生的能力来确认这样的试剂。例如，可以使用一种共同刺激分析系统。在这样的一个系统中，人类CD28+T细胞被分离，例如，通过使用针对B细胞，自然杀伤细胞和巨噬细胞的单克隆抗体来进行免疫磁珠消除，如上文所述(Gimmi，C.D.，等，1993美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)90，6586-6590)。抗原呈递细胞，如完整的脾脏细胞，或纯化的B细胞或B7-1或B7-2转染的COS细胞，可以经放射照射或使用丝裂霉素-C(例如，25μg/ml)处理一小时后经充分的冲洗以抑制其增殖。105的CD28+T细胞可以同，例如105-104的APC(例如，被B7分子转染的COS细胞)，进行温浴。在这一示例性的分析中，一个群体的T细胞只收到一个原初激活信号(例如，一个T细胞受体信号)；另一个群体的T细胞只收到一个共同刺激信号；再一个群体的T细胞收到一个原初激活信号和一个共同刺激信号，并且另有一个群体的T细胞在存在其阻断T细胞中的一种共同刺激信号的能力待测试剂的情况下，收到一个原初激活信号和一个共同刺激信号。原初激活信号的传递可以被诸如一个亚致分裂剂量的PMA(例如，1ng/ml)，一个亚致分裂剂量的促细胞分裂原，一个亚最佳量的抗原或一个亚致分裂剂量的抗T细胞受体抗体这样的试剂来完成。信号2被带有B7分子的抗原呈递细胞所传递。潜在的阻断试剂可以在一个浓度范围内被检测。例如，可以以杂交瘤上清或纯化抗体(例如，约10μg/ml)的形式使用潜在的阻断抗体。T细胞的增殖可以通过3H-胸腺嘧啶(1μCi)在72小时的温育的最后12-18小时进行掺入来测量。原初激活信号的传递应该导致一些增殖，但同时收到原初激活信号和共同刺激信号的T细胞应该获得最大的增殖。通过检测试剂减小共同刺激信号诱导的最大的增殖的能力来确认阻断试剂。
此外，或者作为测量T细胞增殖的替代方法，可以使用本领域所熟知的技术来测量T细胞细胞因子的产生。例如，可以使用商业化的ELISA(R&D Systems，Minneapolis，MN and BioSource，Camarillo，CA)在培养开始后24-72小时所收集到的培养物上清中分析T细胞培养物中产生的IL-2和IL-4。如上文所述，可以根据试剂减小共同刺激信号诱导的最大的细胞因子产生的能力来确认阻断试剂。
对于抗体，使用这一分析或其它分析所确认的任何“阻断抗体”可以使用本领域所已知的技术来进一步测试以确定该抗体所结合的共同刺激分子。例如，可以测量该抗体降低一个标记抗体同一个已知配基的结合的能力。VII.附加的用于负调节免疫反应的试剂在特定的实施方案中，本发明的组合物和方法可以包括附加试剂或使用附加试剂以增强对促进止血的试剂的免疫耐受性。在一个实施方案中，可以向本发明组合物加入一种试剂或在本发明方法中用其进行给药，该试剂促进免疫耐受，但并不通过抑制一种T细胞中的共同刺激信号来起作用。例如，抗CD40配基(例如，针对人类CD40配基的单克隆抗体，5C8(Kirk等1997.美国国家科学院院刊948789))可被包括入一种组合物。CD40和其以T细胞为基础的配基CD40L(CD154)在正调节B7和建立B细胞活性中起到重要的作用(美国专利号5,683,693；Yang等1996.Science2731862；Grewal等1996.Science2731864；Leterman等1992.J.Exp.Med.1751091；Lederman等1992.J.Immunol.1493817)。已经发现针对CD40配基的抗体同抑制T细胞中的一种共同刺激信号的试剂协同作用以提高移植耐受(Kirk等1997.美国国家科学院院刊948789；Larsen等1996 Nature 381434)。在另一个实施方案中，本发明组合物中可以使用一种试剂，该试剂在细胞内作用以促进免疫耐受，但并不抑制T细胞中的共同刺激信号。例如，在一个实施方案中，环孢菌素A(CSA)，FK506，雷帕霉素或其它抑制免疫反应的试剂可以被包括入本发明组合物或用其进行给药以作为本发明方法的一部分(例见，Sigal等1992.Annv.Rev.Immunol.10519；Ruhlmann等1997免疫生物学(Immunobiology).198-192；Shaw等1996.临床化学(Clin.Chem.)421316)。VIII.含有一种医疗蛋白和一种免疫耐受化试剂的组合物的使用方法在一个实施方案中，本文所描述的本发明的组合物和/或试剂被用以对医疗对象给药，该对象患有止血障碍并先前已经接受促进止血的试剂的治疗。在另一个实施方案中，本文所描述的本发明的组合物和/或试剂被用以对医疗对象给药，该对象尚未接受促进止血的试剂的治疗。
在另外的一个实施方案中，本文所描述的本发明的组合物和/或试剂被用以对医疗对象给药，该对象尚未发展出针对促进止血的试剂的免疫反应。在其它实施方案中，本文所描述的本发明的组合物和/或试剂被用以对医疗对象给药，该对象具有已经存在的针对促进止血的试剂的免疫反应。可以通过使用本领域已知的技术测量该医疗对象体内的同促进止血的试剂反应的抗体滴度，以此决定是否一个医疗对象具有“已经存在的免疫反应”。如果这样的一个医疗对象同参照个体的滴度相比较具有可测量滴度的该抗体(例如，一个统计学上相当显著的滴度)，就可以说该对象具有已经存在的针对促进止血的试剂的免疫反应。在替代情况下，可以测量针对促进止血的试剂的细胞免疫反应以确定是否该对象具有正在进行的针对促进止血的试剂的免疫反应。这些技术在本领域是已知的。
在一个实施方案中，两种试剂被用来治疗一种止血障碍，第一种试剂促进止血，第二种试剂抑制或阻断T细胞中的一种共同刺激信号。在另一个实施方案中，使用由两种试剂组合的组合物来治疗一种止血障碍，第一种试剂促进止血，第二种试剂抑制T细胞中的一种共同刺激信号。
本文所描述的组合物和/或试剂的给药可以以任何药学形式来进行，所述形式包括治疗活性量的一种试剂和一种药学上可接受的载体。治疗活性量的本发明试剂和/或组合物的给药被定义为一个有效量，该有效量在剂量和时间上对于使促进止血的试剂达到对止血障碍的治疗以及实现抑制T细胞中的一种共同刺激信号的试剂建立对促进止血的试剂的免疫耐受性是必需的。治疗活性量的试剂或组合物可根据众多因素变化，例如，疾病阶段，个体的年龄、性别和重量以及是否该个体已经发展出针对促进止血的试剂的免疫反应。该领域的技术人员容易地决定该量。
该试剂和/或组合物的最佳给药时期也根据待治疗对象而不同。在特定的实施方案中，医疗对象将需要以两种试剂同时进行治疗。在该情况下，同时以一种促进止血的试剂和一种抑制T细胞中的一种共同刺激信号的试剂进行给药较为理想，例如，以含这两种试剂的组合物的形式。
在其它的实施方案中，较为理想的是以这些试剂分别进行给药，例如，这样可以促进该试剂的稳定，或辅助该试剂的交错给药。在一个实施方案中，交错给药对于促进止血的试剂达到最佳疗效并同时最有效地抑制针对该试剂的免疫反应可能是理想的，优选情况下该免疫反应为抗体反应。例如，一种抑制一种共同刺激信号的试剂可单独地先于促进止血的试剂进行给药，或者在以促进止血的试剂进行给药后数天单独进行给药。
在一个实施方案中，阻断T细胞中的一种共同刺激信号的试剂可连续缓慢地(chronically)进行给药，例如，随着每一次以促进止血的试剂进行给药。在另一个实施方案中，阻断T细胞中的一种共同刺激信号的试剂可间断地进行给药。例如，一个医疗对象可能要求以促进止血的试剂进行有规律的治疗，但可能只需要以抑制T细胞中的一种共同刺激信号的试剂进行周期性治疗。例如，用促进止血的试剂进行治疗，而以阻断T细胞中的一种共同刺激信号的试剂对治疗对象进行少至1次或2次的治疗便足够；以阻断一种共同刺激信号的试剂进行的进一步给药可能并不需要。在一个优选的实施方案中，阻断T细胞中的一种共同刺激信号的试剂以适当的时间间隔进行给药，该间隔至少为约6个月。
在一个实施方案中，如果患者被发现具有已经存在的抗体，该试剂或组合物被用来对该患者给药。在另一个实施方案中，该试剂或组合物被用来对先前未经治疗的患者给药，即，该患者不具有已经存在的抗体。在再一个实施方案中，该试剂或组合物被用来对患者给药，该患者先前接受过治疗但并不具有针对促进止血的试剂的抗体滴度。
无需不适实验，用药剂量方案可以针对每个医疗对象进行调整以提供最佳医疗反应。例如，可以测量针对一种促进止血的试剂的抗体滴度以确定是否该对象正在发展针对该试剂的免疫反应并据此调整试剂和用药剂量方案。例如，如果针对一种促进止血的试剂的抗体滴度增加，可以用更多剂量的阻断T细胞中的一种共同刺激信号的试剂进行给药。
为通过肠胃外给药以外的方式以试剂或组合物对医疗对象进行给药，有必要对试剂或组合物进行包被或以一种材料进行共给药以防止该试剂或组合物的失活。本发明的试剂或组合物可以在适当的载体或稀释剂中，同酶抑制剂共给药或在诸如脂质体这样的适当载体中对个体进行给药。药学上可接受的稀释剂包括含盐和含水的缓冲溶液。酶抑制剂包括胰脏的胰蛋白酶抑制剂，二异丙基氟磷酸盐(DEP)和trasylol。脂质体包括水包油包水乳化液以及传统的脂质体(Sterjan等(1984)神经免疫学杂志(J.Neuroimmunol.)727)。
活性试剂或组合物还可以进行肠胃外或腹膜内给药。分散物(dispersion)的制备可以在甘油，液体聚乙二醇(liquidpolyethylene glycols)及它们在油中的混合物中进行。在普通的贮藏和使用条件下，这些制剂可以含有防腐剂以防止微生物的生长。
适用于注射的药学组合物包括灭菌的含水溶液(水溶性)或分散液和灭菌粉末，该粉末用于无菌的可注射溶液或分散液的即时制备。在所有情况下，该试剂或组合物必须是无菌的并且其流动程度必须容易用于注射。该试剂或组合物必须在制造和贮藏条件下稳定并一定要经防腐处理以防止微生物的污染活动，例如，细菌和真菌。载体可以是溶剂或分散物介质，它们含有，例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油，丙二醇和液体聚乙二醇及其它类似物)和它们的适当的混合物。适当的流动性的维持可以通过，例如，使用覆盖物如卵磷脂，维持分散物中所需的颗粒大小，以及使用表面活性剂。微生物活动的防止可以通过各种抗细菌和抗真菌的试剂完成，例如，对羟基苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚，维生素C酸，硫柳汞及其它类似物。在许多情况下，在组合物中包括入等渗试剂是优选的，例如，糖，多元醇如甘露醇，山梨醇，氯化钠。通过在组合物中包括如延长吸收的试剂，例如，硬脂酸铝和明胶，可以形成对被注射的组合物的延长的吸收。
通过向所需量的适当溶剂中加入活性组合物或试剂以及前文列举的组分的一种或多种的组合，根据需要，随后进行过滤灭菌，可制备出无菌的可注射溶液。通常通过向含有碱性分散介质的无菌容器中加入活性化合物和前文列举的其它所需的组分来制备分散物。对于用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末，优选的制备方法为真空干燥法和冷冻干燥法，该方法得到活性成分(例如试剂或组合物)加先前经过滤灭菌的溶液中的附加的所需组分的粉末。
当该活性试剂或组合物如上文所述经适当的保护时，该蛋白可以例如同一种惰性稀释剂或可同化的可食载体进行口服给药。本文所用的“药学上可接受的载体”包括任何和所有的溶剂，分散介质，糖衣，抗细菌和抗真菌试剂，等渗试剂和吸收延迟试剂，以及其它类似物。这些介质和试剂对于药学活性物质的应用在其领域中为人所熟知。除该范围外，当任何传统的介质或试剂同活性化合物不相容时，应仔细考虑该介质或试剂在治疗组合物中的使用。组合物中还可以加入其它补充性的活性化合物。
配置剂量单位形式的肠胃外组合物对于给药的方便和剂量的制度化是尤其有好处的。本文所使用的剂量单位形式指的是适合于用于待治疗的哺乳类对象的单位化剂量的物理不连续单位；每单位含有一预先确定量的活性化合物，该量同所需的药学载体一起经计算可产生所需的疗效。本发明的剂量单位形式的说明对应于并直接决定于(a)活性化合物的独特性质和所达到的特定疗效以及(b)制备这样一种用于个体的治疗的活性试剂或组合物的领域中已经存在的限制。
本文所用的“药学上可接受的载体”包括任何和所有的溶剂，分散介质，糖衣，抗细菌和抗真菌试剂，等渗试剂和吸收延迟试剂，以及其它类似物。这些介质和试剂对于药学活性物质的应用在其领域中为人所熟知。还可以加入其它补充性试剂。
除非另外指出，本发明的实际应用将使用细胞生物学，细胞培养，分子生物学，微生物学，重组DNA和免疫学的传统技术，它们在本领域的技术之内。这些技术在文献中有全部说明。例见，遗传学；分子克隆实验手册(Genetics；Molecular Cloning A LaboratoryManual)，第二版Sambrook，J.等编著(冷泉港实验出版社(1989))；Short Protocols in Molecular Biology，第三版，Ausubel，F.等编著(Wiley，NY(1995))；分子克隆(DNA Cloning)，第I卷和第II卷(D.N.Glover编著，1985)；寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)(M.J.Gait编著(1984))；Mullis等美国专利号No4,683,195；核酸杂交(Nucleic AcidHybridizaton)(B.D.Hames & S.J.Higgins.编著(1984))；治疗，酶学方法(the treatise，Methods in Enzymology)(科学出版社，Inc.，N.Y.)；细胞和分子生物学方法(ImmunolchemicalMethods in Cell And Molecular Biology)(Mayer和Walker，编著，科学出版社，伦敦(1987))；实验免疫学手册(Handbook OfExperimental Immunology)，I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell，编著.，(1986))；Miller，分子遗传学实验杂志(J.Experiments in Molecular Genetics)(冷泉港出版社，冷泉港，纽约(1972))。
在本申请中所引用的所有的参考文献，正进行的专利申请和已出版的专利的内容在此明确引入作为参考。
本发明由以下的实施例进一步阐释，这些是实施例不应被解释作为进一步的限制。
实施例在实施例中，血友病A的一种小鼠模型被用于评估用于对抑制剂形成的防止和治疗的新方法。通过对因子VIII基因的外显子16定向破坏而产生的血友病A小鼠在它们的血浆中不具有可检测的因子VIII活性(BiL.，自然遗传学(Nature Genetics)10119，1995)并在这一方面类似于患有严重的血友病A的患者。正如预期，如果尾巴经切除并且不使用止血手段，血友病A小鼠的止血途径具有致命的出血缺陷的体内迹象，并且在经处理或暂时的固定化之后它们发展出皮下或肌间出血(Qian J.，Borovok M.，BiL.，Kazazian HH.，HoyerL.，Thromb Haemost 81940，1999；Evans GL，等，美国国家科学院院刊955734,1998)。
静脉内输入0.2μg人类因子VIII，在一次注射后在这些血友病A小鼠中导致最小或不导致抗体反应，该剂量当日以重量为基础，但是反复输入导致高滴度抑制抗因子VIII(Qian J.，等，Thromb Haemost81940，1999)。另外，第一次暴露于人类因子VIII三天后，在检测到抗体之前检测到因子VIII特异的T细胞增殖。实施例1.针对因子VIII的初次免疫反应的抑制用于这一实施例的实验设计在图1中给出。在0天以因子VIII对三组小鼠进行静脉内注射。一组小鼠还在因子VIII注射前一天和后一天经CTLA4-Ig注射。第二组小鼠接受了同样的CTLA4-Ig处理(腹膜内)，随后在第2天到12天每天接受因子VIII注射。第三组小鼠不及受任何CTLA4-Ig。所有的小鼠随后在第23天和44天进行两次额外的因子VIII注射。在第20，37，58和82天对动物们取血。不接受CTLA4-Ig的小鼠早在第20天开始具有高滴度的抗体，而接受CTLA4-Ig的小鼠直到第82天不产生出抗体(图2)。实施例2.针对因子VIII的再次免疫反应的抑制用于这一实施例的实验设计在图3中给出。在这一实施例中，在两周期间内对小鼠进行了多次的因子VIII静脉注射，随后将其分为两组。小鼠在第1，20和37天被重注射因子VIII。一组小鼠在相对于第1，20和37天的-1和+1天被注射CILA4-Ig。不接受CTLA4-Ig的小鼠具有高滴度的抗因子VIII抗体，而接受CTLA4-Ig的小鼠(除一只外)不发展出对因子VIII的再次免疫反应(图4)。
以下的方法和材料被用于实施例3-6。
动物.血友病小鼠的外显子-16(E-6)株的特征已被BiL，等自然遗传学(Natrue Genetics)10119，1995；BiL，等血液(Blood)883446，1996所报道。10-20周大的成年雄性和纯合E-16雌性小鼠被用于这些研究。通过眶最下点静脉丛放血来获得血样，并且通过在600g离心3分钟来分离血清。血清样品贮存于-20℃直至分析。为避免动物的严重出血和死亡，在某些实验中没有使用耳标签来分辨小鼠。为此原因，图5没有表明个体小鼠的结果数据。
E-16/B7-1和B7-2双剔除小鼠通过以E-16同B7-1和B7-2剔除小鼠进行杂交来产生(Boriello F，等1997.免疫学(Immunity)6303)。通过基因型测定来确认纯合的E-16/B7-1和B7-2双剔除小鼠(BiL.等，自然遗传学(Nature Genetics)10119，1995；Boriello F，等免疫学(Immunity)6303，1997)。使用Coatest显色原生物分析(Chromogenix，MoIndal，Sweden)(BiL，等Blood883446，1996)证实了降低的因子VIII活性。在E-16/B7-1和E-16/B7-2缺陷小鼠中因子VIII活性均低于1％。
抗原.重组人类因子VIII获自Hyland Division of BaxterHealthcare Corp.(Glendale，CA)。
mCTLA-4Ig.鼠类CTLA4-Ig cDNA表达质粒的制备通过将鼠源CTLA4的引导和细胞外结构域同IgHg2a的铰链，CH2和CH3结构域连接来完成，IgHg2a已经如Streurer等人所描述经诱变以除去其效应子功能(Streurer，免疫学杂志(J Immunol)1551165，1995)。该插入元件被克隆入表达载体pED并如前所述稳定地转染入CHO细胞(Lollar P等，临床研究杂志(J Clin Invest)932497，1994)。浓缩的条件培养基被上样至rProtein A Sepharose Fast Flow层析柱(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)。以pH7.1的PBS洗柱并以20mM pH3.0的柠檬酸洗脱mCTLA4-Ig。以1M pH8.0的Tris中和峰组分至最终pH7.5并使用Amicon搅拌池和YM30膜将峰组分配制入pH7.1的PBS。使用Poros PI(PerceptiveBiosystem)层析柱对mCTLA4-Ig进行脱致热原化并且用在25mM pH7.5的Tris中的0-1M的NaCl线性NaCl梯度将产物从柱子上洗脱。随即使用Amicon搅拌池和YM30膜将该mCTLA4-Ig配制入pH7.1的PBS。
抗体测量.以ELISA测定抗因子VIII滴度(Qian J，等血友病A鼠类中对人类因子VIII的抑制剂抗体的产生和细胞反应(Inhibitorantibodv development and cell response to human factor VIIIin murine hemophilia A).Thromb Heamost 81940，1999.)。使用微滴度孔(microtiter well)来进行ELISA分析，该孔包被有重组人类因子VIII，其存在于0.05mol/ml pH9的碳酸盐-碳酸氢盐中，浓度为0.8μg/ml。将小鼠血浆样品在4℃下于孔中孵育过夜后随即进行冲洗，向其中加入偶联有碱性磷酸酶的山羊抗小鼠IgG(Southern Biotechnology Associates Inc.，Birmingham，AL)在室温下放置2小时。洗涤后加入对确基苯基磷酸酯(Sigma，St.Louis，MO)，其浓度为2mg/ml，存在于pH10.4 100mmol/L的甘氨酸，1mmol/L的MgCl2，2mmol/L的ZnCl2溶液中，随后使用ELISA自动微滴度板读数仪测定在410nm下的吸光度。从标准曲线估测抗因子VIII的抗体浓度，该标准曲线使用结合于A2结构域(Mab413)的单克隆鼠源IgG抗人类因子VIII抗体来获得(Lollar P等，临床研究杂志(J Clin Invest)939497，1994)。从落在该分析标准曲线的线性部分的点来计算该滴度。
以Bethesda分析(Kasper CK.Thromb et Diath Heam 30263，1973)来测量抗因子VIII抑制剂滴度的Bethesda单位(BU)。
T细胞增殖分析.使用脾脏作为增殖分析的T细胞来源。在96孔平底板中培养脾脏细胞(5×105/孔)。向培养基中加入不同量的重组因子VIII，该培养基含有含0.5％血友病小鼠血清的完全RPMI-1640。37℃下培养72小时后加入37hkBp的3H-胸腺嘧啶/孔(6.7Ci/mmol，ICN Pharmaceutical Irvine CA)。16小时后使用Matrix9600收集培养物(Packard，Meriden，CT)。数据以三个孔中掺入不可溶DNA的cpm的平均值来表示。实施例3.mCTLA4-Ig阻断对抗因子VIII的反应的诱导在参照小鼠中，通过以3周间隔重复静脉内注射1μg的重组人类因子VIII来对抗因子VIII的抑制性抗体进行诱导。在这一实施例中，以重组人类因子VIII在第0，23，44和66天注射4组血友病A小鼠(最初，静脉内注射1μg，随后第2，3，4次注射0.2μg)。G-3和G-4组小鼠还在第2-12天以0.2μg因子VIII进行了腹膜内注射。用于抗因子VIII分析的血样在第20，37，58和82天获得。空心环为参照组G-1和G-3，它们只被因子VIII注射。实心环为G-2和G-4组，它们还在第一次因子VIII注射前和注射后一天经mCTLA4-Ig注射(250μg，腹膜内注射)。通过ELISA测定抗因子VIII抗体浓度。标示为＜0.16μg/ml的抗因子VIII分析数据点类似于获自未免疫化的血友病A小鼠的血浆样品。这一实验的该结果显示于图5(注意图5重复了图2显示的一些数据，但添加了另外的数据)。
在第一次注射后20天5只小鼠中有4只检测到了抗因子VIII，并且在接受了2到4次注射后所有的参照小鼠产生出了高滴度的抗因子VIII。4次注射后的平均抑制剂水平为1860Behesda单位(BU)。在第一次因子VIII注射前和注射后一天经250μg的鼠源CTLA4-Ig腹膜内注射的小鼠体内，抗因子VIII抗体的形成被明显地抑制(图5，G-2组)，即使随后在第23，44和66天的3次因子VIII注射时没有进一步注射mCTLA4-Ig。在第1和第2次因子VIII注射后G-2组的任何小鼠体内均检测不到抗因子VIII。第三次注射因子VIII后三周，在G-2组的6只小鼠中的2只体内检测到了微弱的免疫反应。
为研究不应答的有限持续是否是由于在这些小鼠体内人类因子VIII半寿期较短(在鼠源血友病A中为4-5小时(Evans GL等，美国国家科学院院刊955734，1998))，参照组小鼠和经mCTLA4-Ig处理的小鼠(图5，G-3和G-4组)在第0天被静脉内注射以1μg因子VIII，随后在第2-12天期间每天腹膜内注射1μg因子VIII。在第20天参照组小鼠(G-3组)体内出现了高滴度的抗因子VIII通过ELISA检测大于350μg/ml，平均抑制剂滴度为694BU。与之相比，在第一次因子VIII注射前和注射后一天经mCTLA4-Ig注射的G-4组小鼠体内在第20天检测不到抗因子VIII。在这些小鼠体内，3次额外的因子VIII注射后的延迟抗因子VIII抗体反应与G-2组动物相同。这样，CTLA4-Ig注射后因子VIII在血浆中的有限的保持并非是在经CTLA4-Ig处理的小鼠中的不应答的有限持续的原因。实施例4.CTLA4-Ig的反复给药的效果当只在第一次因子VIII注射时提供mCTLA4-Ig时，由于在反复输入因子VIII后检测到延迟的抗因子VIII反应，就测定出mCTLA4-Ig是否可以防止抗因子VIII的产生，如果每次输入因子VIII时均提供mCTLA4-Ig。在该实验中(图6)，血友病A小鼠被以3周为间隔同时输入了6次的因子VIII和mCTLA4-Ig。血友病A小鼠以3周为间隔经静脉内注射1μg的因子VIII和250μg的mCTLA4-Ig(实心环)，或在第一次注射因子VIII和mCTLA4-Ig后只注射因子VIII(空心环)。用于抗因子VIII分析的血清样品在第6次因子VIII注射后4周获取。这样处理的小鼠在第6次因子VIII注射后4周检测时，十只中无一只可检测到抗因子VII。与之相比，在只进行了一次mCTLA4-Ig注射(在第一次暴露于因子VIII时)并随后进行了5次因子VIII单独注射的小鼠的血清中存在高滴度的抗因子VIII。
对这些经mCTLA4-Ig处理的小鼠随后检测以测定它们在无mCTLA4-Ig情况下进行的额外的因子VIII注射后是否具有了免疫反应。以3周为间隔进行了两次静脉内注射后，五只小鼠中无一发展出了抗因子VIII，而在先前未暴露于因子VIII或mCTLA4-Ig的四只参照小鼠中有两只检测到了低水平的抗因子VIII(图7)。在这一实验中，按照对图6的描述以因子VIII和mCTLA4-Ig同时注射处理6次血友病A小鼠，随后以3周为间隔给予其静脉注射6次0.2μg的因子VIII，没有另外的mCTLA4-Ig(实心环)。未经预先暴露于因子VIII处理的参照组小鼠以平行方式进行免疫化(空心环)。用于抗因子VIII分析的血清样品于第2次和第6次注射后获取。6次因子VIII的单独注射后，对于预先接受了因子VIII和mCTLA4-Ig的小鼠，其因子VIII平均滴度为93μg/ml，而参照组小鼠的平均滴度值为155μg/ml。这些数据证实了随着因子VIII和mCTLA4-Ig反复共给药而来的抗原特异性免疫抑制的限制。实施例5.mCTLA4-Ig抑制针对因子VIII的再次免疫反应。
为确定mCTLA4-Ig是否影响针对因子VIII的再次免疫反应，在对已经发展出抗因子VIII的血友病A小鼠提供因子VIII时也同时对其注射mCTLA4-Ig。起初，所有的血友病A小鼠均经0.2μg因子VIII注射三次并通过ELISA确定其抗因子VIII水平。参照组小鼠随后接受三次额外的因子VIII注射，其余的小鼠则在接受三次额外的因子VIII注射的第一次时被给予了mCTLA4-Ig。尽管多数小鼠在本实验期间由于反复的注射和血样收集而死于出血并发症，对于两个试验组，其结果仍有显著差异。
在本实施例中，所有的小鼠均以两周为间隔接受了3次0.2μgFVIII的静脉内注射。随后以因子VIII对参照组小鼠(空心环)再进行3次注射并且收集其血样进行分析(上组)。其它的小鼠(实心环)在第4次因子VIII注射前一天和后一天被给予mCTLA4-Ig(250μg，腹膜内进行)(以箭头标明)，随后以3周为间隔单独注射两次以上的因子VIII。血样在抗因子VIII检测前所进行的因子VIII注射次数在横轴上标明。
参照组小鼠在第4次因子VIII注射后被注意到有抗因子VIII滴度的增加，其平均滴度从16升至230μg/ml(图8A)。第5次因子VIII注射后，4只存活参照小鼠体内的抗因子VIII滴度均超过了350μg/ml。与之对比，在第4次因子VIII注射时经mCTLA4-Ig处理的小鼠在抗因子VIII上有最小的增加或无增加(图8B和C)。对于已经发展出相对较高的抗因子VIII水平的小鼠，mCTLA4-Ig的给药抑制了该再次免疫反应，相当于5-90BU的抑制剂滴度(Qian J，等Thromb Heamost 81940，1999)(图8C)，而对于在3次初始注射后具有最小抗因子VIII的小鼠，小于5BU(图8B)。实施例6.B7-1和B7-2在针对因子VIII的初次免疫反应中的作用的确定。
由于B7-1和B7-2与CD28的相互作用据认为在使用mCTLA4-Ig的实验中被阻止，因此随后估测了抗原呈递细胞上的B7-1和B7-2共同刺激配基的作用。为此我们进行了血友病A小鼠同B7-1-/-和B7-2-/-小鼠的杂交(Borriello F，等B Immunity 6303，1997；Freeman GJ等，Science 262907，1993)并且通过基因型分析选出了因子VIII与或者B7-1或者B7-2均缺陷的小鼠。血友病A/B7-1-/-和血友病A/B7-2-/-小鼠随后以两周为间隔进行0.2μg人类因子VIII的静脉内注射。血清样品于第2和第6次因子VIII注射后12天获取。4次注射后，全部9只血友病A/B7-1-/-小鼠(空心环)均发展出了抗因子VIII，其滴度超过350μg/ml，平均抑制剂水平为712BU(图9)，该值类似于经因子VIII注射的其它性状正常的血友病A小鼠(Qian J，等Thromb Hemost 81940，1999)。与之相比，8只A/B7-2-/-血友病小鼠(实心环)中无一只可检测到抗因子VIII。以抗B7-1和抗B7-2抗体处理血友病A小鼠可获得类似结果。
为估测这些B7-1和B7-2缺陷型血友病A小鼠的T细胞反应，在第5次静脉内注射因子VIII后3天获取了脾脏细胞。来自3只小鼠的混合脾脏细胞被用于建立增殖数据。图10中的空心和实心方形分别对应于来自未处理的血友病A/B7-1-/-和B7-2-小鼠的细胞。空心环对应于接受了5次FVIII静脉内注射的血友病A/B7-1-/-小鼠的细胞，实心环对应于接受了5次因子VIII静脉内注射的血友病A/B7-2-/-小鼠。培养物中因子VIII的浓度被标明在横轴上。根据掺入的3H-胸腺嘧啶所测定的T细胞增殖活性显示了来自血友病A/B7-1-/-小鼠的细胞中的因子VIII剂量依赖性反应(图10)。与之相比，对于来自血友病A/B7-2/-小鼠的脾脏细胞，在任何因子VIII水平上均未检测到T细胞反应。这样，B7-2对于支持针对静脉内注射的因子VIII的免疫反应具有重要作用，如果它被缺失，抗因子VIII的形成将被阻止。等效物只需使用常规实验，本领域的技术人员将识别或将能够确认出本文所描述的具体组合物或方法的等效物。这样的等效物被认为属于本发明的范围并被下列权利要求所涵盖。
权利要求
1.一种组合物，它包括第一种试剂，该试剂促进止血，以及第二种试剂，该试剂抑制T细胞中的一种共同刺激信号。
2.权利要求1中的组合物，它进一步含有一种药学上可接受的载体。
3.权利要求1中的组合物，其中第一种试剂为因子VIII。
4.权利要求1中的组合物，其中第一种试剂为B-结构域被删除的因子VIII的变体。
5.权利要求1中的组合物，其中第一种试剂为因子IX。
6.权利要求1中的组合物，其中第一种试剂为Yon Willebrand因子。
7.权利要求1中的组合物，其中第二种试剂为一种可溶形式的共同刺激分子。
8.权利要求7中的组合物，其中第二种试剂为一种可溶形式的CTLA4。
9.权利要求7中的组合物，其中第二种试剂为一种可溶形式的B7-1，一种可溶形式的B7-2，或所述的可溶形式的B7-1和所述的可溶形式的B7-2的一种混合物。
10.权利要求8中的组合物，其中第二种试剂为CTLA4Ig。
11.权利要求9中的组合物，其中第二种试剂为B7-1Ig或B7-2Ig。
12.权利要求1中的组合物，其中第二种试剂为一种可溶形式的CD40或CD40L。
13.权利要求1中的组合物，其中第二种试剂为一种抗体，该抗体与一种共同刺激分子结合。
14.权利要求13中的组合物，其中第二种试剂选自抗-B7-1抗体，抗-B7-2抗体，抗-B7-1抗体和抗-B7-2抗体的一种混合物。
15.权利要求13中的组合物，其中的抗体是一种抗CD28抗体的非活性形式。
16.一种用于治疗医疗对象体内的一种止血障碍的方法，该方法包括以权利要求1-15中的任何一个权利要求的组合物对医疗对象进行给药，以此治疗止血障碍。
17.权利要求16中的方法，其中的医疗对象具有已经存在的针对第一种试剂的免疫反应。
18.权利要求16中的方法，其中的医疗对象并不具有已经存在的针对第一种试剂的免疫反应。
19.权利要求16中的方法，它进一步包括以一种组合物进行给药，该组合物含有一种额外的免疫抑制试剂。
20.权利要求16中的方法，其中的止血障碍选自血友病A，血友病B和冯·维勒布兰德氏症。
21.一种用于治疗医疗对象体内的一种止血障碍的方法，该方法包括以促进止血的第一种试剂和抑制T细胞中的一种共同刺激信号的第二种试剂对医疗对象进行给药，以此治疗止血障碍。
22.一种用于治疗医疗对象体内的一种止血障碍的方法，该方法包括以促进止血的第一种试剂和抑制T细胞中的一种共同刺激信号的第二种试剂对医疗对象进行给药，这样便负调节了针对第一种试剂的免疫反应，以此治疗止血障碍。
23.权利要求21或22的方法，其中第一种试剂为因子VIII。
24.权利要求21或22中的方法，其中第一种试剂为B-结构域被删除的因子VIII的变体。
25.权利要求21或22中的方法，其中第一种试剂为因子IX。
26.权利要求21或22中的方法，其中第一种试剂为VonWillebrand因子。
27.权利要求21或22中的方法，其中第二种试剂为一种可溶形式的试剂，该试剂向T细胞传递一种共同刺激信号。
28.权利要求27中的方法，其中该试剂为一种可溶形式的CTLA4。
29.权利要求28中的方法，其中该试剂为CTLA4Ig。
30.权利要求27中的方法，其中该试剂为一种可溶形式的B7-1，一种可溶形式的B7-2，或所述的可溶形式的B7-1和所述的可溶形式的B7-2的一种混合物。
31.权利要求30中的方法，其中该试剂为B7-1Ig，B7-2Ig或B7-1Ig和B7-2Ig的一种混合物。
32.权利要求21或22中的方法，其中第二种试剂为一种抗体，该抗体与一种共同刺激分子结合。
33.权利要求32中的方法，其中第二种试剂选自抗-B7-1抗体，抗-B7-2抗体，抗-B7-1抗体和抗-B7-2抗体的一种混合物。
34.权利要求32中的方法，其中的抗体是一种抗CD28抗体的非活性形式。
35.权利要求21或22中的方法，其中的止血障碍选自血友病A，血友病B和冯·维勒布兰德氏症。
36.权利要求21或22中的方法，其中的医疗对象具有足量滴度的与第一种试剂结合的抗体。
全文摘要
所提供的为使用促进止血的试剂和抑制T细胞中的共同刺激信号的试剂来治疗止血障碍的方法和组合物。经过负调节针对医用蛋白的免疫反应,本发明组合物和方法实现了利用外源医用蛋白来止血障碍的治疗。
文档编号A61P7/04GK1331602SQ99813510
公开日2002年1月16日 申请日期1999年9月21日 优先权日1998年9月21日
发明者J·钱, L·W·霍耶尔, M·科林斯, G·S·格雷 申请人:遗传研究所有限公司, 美国红十字会