时间2 min，所得分散液为金量子点。同样，采用上海交大新地实业公司生产的HIFU — 2011型高强度聚焦超声肿瘤治疗系统，聚焦功率控制在1200W/cm2，辐照lmin，所得分散液也转为金量子点。图3分别给出了其TEM图(a，b)。可以看出，由于聚焦作用，掺铜GNR在短时间内很快转化为不规则、直径为2?5nm的金量子点。
[0029]掺铜GNR的抗肿瘤作用
以下通过实验来进一步阐述本发明所述掺铜GNR在抗癌方面的应用。
[0030]GNR的PEG分散液简记为PEG-GNR。
[0031 ] 下列实施例中的MTT法主要过程如下:
1)收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ml，铺板使待测细胞调密度至5000/孔，(边缘孔用无菌PBS填充)；
2)5%C02，37°C孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，培养12h，待细胞贴壁后，生长状态良好时，去除旧的培养液，取出用含有/或不含、经/或未经超声处理的设定浓度的掺铜/或不掺铜金纳米棒(PEG-GNR使用之前均用紫外照射杀菌30min，防止污染)的培养液培养一定时间的细胞，每孔100 μ 1，设5个复孔；
3)继续在5%C02，37°C条件下孵育一定时间，倒置显微镜下观察；
4)取出培养板，每孔加入20μ I MTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT)，继续培养4h ； 5)终止培养，小心吸去孔内培养液；
6)每孔加入150μI 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪OD 490nm处测量各孔的吸光值；
7)同时设置调零孔即空白组(培养液、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的GNRs的溶解介质PEG、培养液、MTT、二甲基亚砜)；
8)结果分析:存活细胞％= (0D实验组-OD空白组)/ (0D对照-OD空白组)X 100%。
[0032]以下若非特别指明，所用掺铜GNR含铜量为0.1%，GNP代表金纳米颗粒(GoldNanoparticle)。
[0033]未掺杂GNR分散液的细胞毒性
细胞为培育好的肝癌ifepG2细胞，期间加入经300W超声仪超声30min、不同长径比PEG - GNR分散液(其UV-Vis消光谱如图4所示)，使其中浓度为12.5、25、37.5、50nM，观察温育24h、36h后肝癌细胞H印G2的活性，结果如图5 (a，b)。结果表明，不同长径比的未掺杂的GNR细胞毒性相差不大，对肝癌HepG2细胞基本无毒性，与文献公开报道的结果一致。
[0034]超声处理后PEG—掺铜GNR分散液的细胞毒性
采用MTT法，先将长径比为4.7的掺铜PEG - GNR用不同功率普通超声仪分散30min，再测试肝癌H印G2细胞活性vs.浓度与温育时间的关系。结果如图6。图6结果表明，与100 W超声后对癌细胞几乎无毒不同，300 W超声30min后，掺铜GNR分散液对肝癌H印G2细胞有显著毒性；而且，这种毒性随添加PEG —掺铜GNR分散液的浓度、培育时间增加而增强，48h (2d)后，肝癌!fepG2细胞活性降为10%。由此说明，PEG —掺铜GNR分散液经大功率(300W)普通超声后，抗癌活性增强，且对肝癌HepG2细胞毒性具有持续性,暗示经大功率超声后掺铜GNR特性已发生显著改变；而低功率(实验室通常用的100 W)超声仪超声相同时间，几乎没有细胞毒性，暗示此时掺铜GNR的形貌并无显著改变。
[0035]采用MTT法研究掺铜GNR在高功率超声波作用下对正常细胞L02及肝癌H印G2细胞的毒性，添加掺铜GNR的试验组中，掺铜GNR的浓度为250 nM，分组和处理情况下如下:
第一组细胞:对照组，不含掺铜GNR的培养液培养72小时、并且没有经过超声处理； 第二组细胞:仅经过300W的超声波处理15分钟；
第三组细胞:仅采用添加掺铜GNR的培养液培养72小时，没有经过超声处理；
第四组细胞:先采用添加掺铜GNR的培养液培养72小时后，将含有掺铜GNR的培养液去除，用不含GNR的培养液替代，再经过300W超声波处理15分钟；
第五组细胞:先采用添加掺铜GNR的培养液培养72小时后，培养液直接采用300W超声波处理15分钟。
[0036]实验结果如图7所示。具体如下:
第二组细胞中，两种细胞的存活率分别下降至86.9%和84.5%，表明高功率超声波对细胞存具有一定损伤，但是影响差异不明显；
第三组细胞中，两种细胞的存活率分别为74%和75%，二者差异也不明显。因为培养液中掺铜GNR的浓度已经达到250 nM,因此对细胞具有一定的毒性；
第四组细胞中，两种细胞的存活率分别降至44.3%和57%。
[0037]第五组细胞中，两种细胞的存活率分别降至21%和41%。
[0038]结果分析: 事实上，高功率超声波和高浓度掺铜GNR对肝癌细胞存活率的影响预计应该为86.9%^ 74%=64.3%。然而，当我们让细胞摄取掺铜GNR后再进行超声波处理，发现细胞的存活率仅有44.3% (超声波处理前去除含掺铜GNR的培养液)和21% (超声波处理前保留含掺铜GNR的培养液)，说明掺铜GNR在高功率超声波作用下转变成的小尺寸GNP对细胞产生了一定的毒性。由于细胞的摄取量有限，因此前者细胞的存活率要大于后者。
[0039]对于正常肝脏细胞，高功率超声波和高浓度掺铜GNR对肝癌细胞存活率的影响预计应该为84.5%r 75%=63.4%。然而，当我们让细胞摄取掺铜GNR后再进行超声波处理，发现细胞的存活率为57.1% (超声波处理前去除含掺铜GNR的培养液)和41% (超声波处理前保留含掺铜GNR的培养液)，也说明掺铜GNR在高功率超声波作用下转变成的小尺寸GNP对细胞产生了一定的毒性。
[0040]可以看出，在掺铜GNR和高功率超声波的共同作用下，正常肝脏细胞的存活率都要大于肝癌细胞的存活率，特别是在没有去除含GNR的培养液时，说明正常肝脏细胞具有一定的自修复功能。之前的研究表明，正常细胞在摄取GNR后，经过一段时间可以将GNR排除体外。因此，残存于正常细胞中的GNR数量较少，以至于在超声波作用下产生的GNP数量也较小，对细胞存活率的影响也就明显比肝癌细胞要小。
【主权项】
1.掺杂铜的金纳米棒在制备抗肿瘤药物的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:掺杂铜的金纳米棒中，铜的质量掺杂量为0.5% ?0.01%。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于:掺杂铜的金纳米棒中，铜的质量掺杂量为0.2% ?0.05%。
4.根据权利要求1?3任意一项所述的应用，其特征在于:金纳米棒上偶联有肿瘤靶向剂。
5.根据权利要求1?3任意一项所述的应用，其特征在于:金纳米棒的长径比为1.5以上。
6.根据权利要求1?3任意一项所述的应用，其特征在于:金纳米棒的直径为5?8nm。
7.一种金量子点的制备工艺，包括:将掺杂铜的金纳米棒分散在分散剂中，之后进行超声处理，得到金量子点。
8.根据权利要求7所述的制备工艺，其特征在于:掺杂铜的金纳米棒中，铜的质量掺杂量为 0.5% ?0.01%。
9.根据权利要求8所述的制备工艺，其特征在于:掺杂铜的金纳米棒中，铜的质量掺杂量为 0.2% ?0.05%。
10.一种抗肿瘤制剂，其特征在于:所述制剂中含有掺杂铜的金纳米棒。
【专利摘要】本发明公开了掺杂铜的金纳米棒在制备抗肿瘤药物中的应用。发明人研究发现，掺杂铜的金纳米棒在较高功率的超声作用下，会转化为2～5nm小尺寸金量子点，进而选择性杀伤肿瘤细胞，可作为在线抗癌制剂用于治疗各种癌症，缩短HIFU辐照时间。
【IPC分类】A61K41-00, B82Y20-00, C09K11-58, B82Y30-00, A61P35-00, A61K47-48
【公开号】CN104623660
【申请号】CN201510031636
【发明人】铁绍龙, 兰胜, 范海华, 乐琼, 梁杰霞, 刘露
【申请人】广州珂纳偲生物技术有限公司
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年1月21日