冷冻保存的可植入细胞培养装置及其用图
【专利说明】冷冻保存的可植入细胞培养装置及其用途
[0001] 相关申请 本申请要求于2012年5月30日提交的U.S.S.N. 61/653, 191的优先权，所述U.S.S.N. 61/653, 191整体引入本文作为參考。 发明领域
[0002] 本发明一般涉及封装细胞治疗领域。
[0003] 发明背景 过去二十年分子生物学中的进展已导致发现具有有希望的治疗潜カ的许多蛋白质分 子，包括细胞因子、神经营养因子、可溶性受体以及抗血管生成抗体和分子。然而，这些新分 子的价值仍未完全实现临床使用，主要是由于缺乏有效递送系统。血脑屏障（BRB)阻止血 流中的大分子进入视网膜。避开这个屏障是蛋白质对视网膜的长期持续递送的主要挑战之 〇
[0004] 对于蛋白质递送至视网膜，常规方法是相当有限的。存在将蛋白质递送至视网膜 的两个选项：纯化的重组蛋白质的弹丸注射和基因治疗。MacugeruLucentis或Eylea的弹 丸注射已批准用于治疗湿润形式的年龄相关性黄斑变性。然而，这些试剂具有短半衰期且 需要反复的长期施用。另ー方面，基因治疗可以实现给定蛋白质的持续表达。然而，由于没 有可靠的方法可用于调节转基因的表达水平的事实，治疗蛋白质的剂量难以控制。此外，一 旦基因被递送，就无法逆转治疗。
[0005] 封装细胞技术或ECT是使用活细胞分泌治疗剂的递送系统。这通常通过遗传改造 特定类型的细胞以过表达特定试剂来实现。经改造的细胞随后封装在半透性聚合物胶囊 中。随后将胶囊植入靶手术部位内。半透性膜允许营养素和治疗分子的自由扩散，同时防 止宿主免疫系统细胞与装置内的细胞的直接接触。
[0006] 发明概述 本发明描述了用于ECT装置的冷冻保存过程。冷冻保存过程允许冷冻保存的ECT装置 无限地贮存，从而使贮存期限从目前数周/数月范围延长到潜在无限。本发明代表细胞培 养装置物品的制造、贮存、分布和成本中的重大优点。
[0007] 细胞系(例如ARPE-19细胞)可以被遗传改造为产生治疗量的ー种或多种生物活性 分子。例如，ー种或多种生物活性分子可以是抗血管生成抗体和分子，抗血管生成抗体-支 架或可溶性VEGF受体或TOGF受体，如整体引入本文作为參考的W02012/075184中所述。 ー种或多种其他生物活性分子可以包括但不限于神经营养蛋白、白细胞介素、细胞因子、生 长因子、抗凋亡因子、血管生成因子、抗血管生成因子、抗体和抗体片段、抗原、神经递质、激 素、酶、淋巴因子、抗炎因子、治疗性蛋白质、基因转移载体和/或其任何ー种或多种组合。 在多个实施方案中，此类分子可以包括但不限于脑源性神经营养因子（BDNF)、NT-4、睫状 神经营养因子（CNTF)、Axokine、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)、胰岛素样生长因子-1 (IGFI)、胰岛素样生长因子II(IGFII)、酸性成纤维细胞生长因子（aFGF)、表皮生长因子 (EGF)、转化生长因子a(TGFa)、转化生长因子0(TGFP)、神经生长因子（NGF)、血小板衍 生的生长因子（PDGF)、神经胶质衍生的神经营养因子（⑶NF)、中期因子、佛波醇12-肉豆蘧 酸13-乙酸酯、tryophotin、活化素、促甲状腺素释放激素、白细胞介素、骨形态发生蛋白、 巨噬细胞炎性蛋白、硫酸肝素、双调蛋白、视黄酸、肿瘤坏死因子a、成纤维细胞生长因子受 体、表皮生长因子受体化6?1〇、？￡0?、1^06?、阶^、神经鞘胚素（他油1 &8衍11)、￥￡6?抑制剂和 /或预期对潜在靶组织具有治疗上有用的效果的其他试剂。
[0008] 此类细胞系可以使用本领域已知的任何ー种或多种方法封装在封装细胞治疗 (ECT)装置中。
[0009] 本文描述的是含有核心和围绕核心的半透性膜的可植入细胞培养装置，所述核心 含有细胞和/或细胞系中的ー种或多种，其中所述膜允许ー种或多种分子由其扩散，并且 其中此类装置是冷冻保存的（即在装置制造后和在植入前)。例如，核心中的细胞系可以包 括ー种或多种ARPE-19细胞系，其被遗传改造为产生治疗有效量的通过迭代转染过程引入 ARPE-19细胞内的细胞因子、神经营养因子、可溶性受体、抗血管生成抗体和分子和/或一 种或多种生物活性分子，其中迭代转染过程包括一次、两次或三次转染；或核心中的细胞系 可以包括ー种或多种ARPE-19细胞，其被遗传改造为分泌其为至少10, 000ng/天/IO6细 胞的治疗有效量的一种或多种细胞因子、神经营养因子、可溶性受体、抗血管生成抗体和分 子和/或ー种或多种生物活性分子。本文描述的冷冻保存装置中的任一种均还可含有遗传 改造的ARPE-19细胞，以分泌治疗有效量的ー种或多种生物活性分子。
[0010] 术语"胶囊"、"装置"和"植入物"在本文中可互換使用，以指含有遗传改造的细胞 和细胞系(例如ARPE-19细胞或细胞系)的任何人工生物器官或封装细胞治疗装置。此类冷 冻保存装置的核心还可以含有冷冻保护剂，其可以加入核心内含有的细胞培养基中。
[0011] 本领域已知的任何冷冻保存方法均可采用。作为非限制性例子，封装细胞治疗装 置可以置于冷冻贮存小瓶中，在控制速率冷冻下冻结(例如至-80°c的温度)，并且最后贮存 于气相液氮(例如-190°C)条件下。
[0012] 冷冻保存的装置可以在气相液氮(例如-190°C)条件下和/或在干冰(例如-70°C) 条件下运输。
[0013] 可以采用任何合适的ー种或多种冷冻保存技术。作为非限制性例子，本发明的ECT 装置可以贮存于干冰(例如-70°C)、冷冻器(例如-80°C)和/或气相液氮(例如-190°C) 中。例如，根据本发明的冷冻保存的ECT装置可以贮存于约-70°C、约-71°C、约-72°C、 约-73°C、约-74°C、约-75°C、约-76°C、约-77°C、约-78°C、约-79°C、约-80°C、约-81°C、 约-82°C、约-83°C、约-84°C、约-85°C、约-86°C、约-87°C、约-88°C、约-89°C、约-90°C、 约-91 °C、约-92 °C、约-93 °C、约-94°C、约-95 °C、约-96 °C、约-97 °C、约-98 °C、约-99 °C、 约-KKTC、约-101°C、约-102°C、约-103°C、约-104°C、约-105°C、约-106°C、约-107°C、 约-108°C、约-109°C、约-110°C、约-m°C、约-112°C、约-113°C、约-114°C、约-115°C、 约-116°C、约-117°C、约-118°C、约-119°C、约-120°C、约-12TC、约-122°C、约-123°C、 约-124°C、约-125°C、约-126°C、约-127°C、约-128°C、约-129°C、约-130°C、约-13TC、 约-132°C、约 _133°C、约 _134°C、约 _135°C、约 _136°C、约 _137°C、约 _138°C、约 _139°C、 约-140°C、约 _141°C、约 _142°C、约 _143°C、约 _144°C、约 _145°C、约 _146°C、约 _147°C、 约-148°C、约 _149°C、约 _150°C、约 _151°C、约 _152°C、约 _153°C、约 _154°C、约 _155°C、 约-156°C、约 _157°C、约 _158°C、约 _159°C、约 _160°C、约 _161°C、约 _162°C、约 _163°C、 约-164°C、约-165°C、约-166°C、约-167°C、约-168°C、约-169°C、约-170°C、约-171°C、 约-172°C、约 _173°C、约 _174°C、约 _175°C、约 _176°C、约 _177°C、约 _178°C、约 _179°C、 约-180°C、约-18TC、约 _182°C、约 _183°C、约 _184°C、约 _185°C、约 _186°C、约 _187°C、 约-188°C、约_189°C、和/或约_190°C或更低（或其任何ー种或多种组合）温度下。
[0014] 冷冻保存装置可以在使用前使用本领域已知的任何ー种或多种方法解冻。
[0015] 在一些非限制性实施方案中，ー种或多种生物活性分子(例如细胞因子、神经营养 因子、可溶性受体、抗血管生成抗体和分子和/或ー种或多种其他生物活性分子）可以使用 迭代转染过程引入ARPE-19细胞内，如W02012/075184中所述。具体地，迭代转染可以是ー 次转染、两次转染、三次转染或更多次转染(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次转染)。 当迭代转染过程是一次转染时，细胞系将含有ー种生物活性分子。当迭代转染过程是两次 转染时，细胞系将含有两种生物活性分子。本领域技术人员将认识到这些可以是相同或不 同的生物活性分子。当迭代转染过程是三次转染时，细胞系将含有三种生物活性分子。再 次，这些可以是相同或不同的生物活性分子。本领域技术人员将认识到在迭代转染过程中 的转染次数将决定在所得到的细胞系中的(相同或不同）生物活性分子数目。
[0016] 迭代转染过程可以用于将相同或不同的生物活性分子的多个拷贝引入ARPE-19 细胞内。
[0017]ARPE-19细胞可以进行遗传改造，以产生治疗有效量的一种或多种细胞因子、神经 营养因子、可溶性受体、抗血管生成抗体和分子和/或ー种或多种生物活性分子，其中治疗 有效量是至少 10, 〇〇〇ng/天/IO6细胞(例如至少 15,