解或接 近完全降解，而70% M16P和70% M32P支架表面则仍残留大量PGS涂覆层。
[0187] 实施例30
[0188] MBG/PGS复合支架材料的蛋白缓释速率和缓释蛋白活性
[0189] 将实施例6制得的固载BSA蛋白的MBG支架和实施例24~27制得的固载BSA蛋 白的MBG/PGS复合支架材料浸泡于PBS缓冲溶液，置于恒温振荡箱在37°C、IOOrpm频率恒 温振荡，在各个时间点收集蛋白缓释液后加入新鲜PBS继续浸泡降解。用BCA蛋白浓度检 测试剂盒测定各时间点的缓释蛋白浓度，从而计算出各个时间点的蛋白缓释百分比并作缓 释曲线图；用圆二色谱分析不同支架缓释的蛋白结构变化。
[0190] 通过图9中A可以看到，BSA蛋白的初期突释和之后的缓释速率随PGS涂覆量的 增加在10 %至60 %范围内逐级下降，说明复合支架的蛋白缓释速率可通过改变PGS涂覆量 进行调控。
[0191] 通过图9中B可以看到，不同支架缓释的BSA蛋白的圆二色谱谱图与BSA蛋白本 身的谱图无明显差异，表明本发明的涂覆操作不影响支架预固载蛋白的活性。
[0192] 实施例31
[0193] MBG/PGS复合支架材料的细胞相容性
[0194] 以鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs) (1、大鼠 100g左右，脱颈处死，75%酒精泡 lOmin。2、无菌剥离股骨、胫骨，再用纱布剥尽骨头上的肌肉。3、剪断干骺端，用5ml注射 器吸取含10%胎牛血清（没灭活）L-DMEM培养基冲洗骨髓腔，吹打制的单细胞悬液。4、离 心1000r/min、离心5min。5、弃上清，培养基重悬细胞，吹打成细胞悬液，接种在培养瓶中培 养）为模型，使用MTT法检测实施例3和实施例8~11制备的支架材料的细胞粘附和增殖： 向接种有细胞（2*10 4个/孔）的支架材料培养于24孔板内，每孔加入100 μ L的四甲基偶 氮唑盐试剂，37°C继续孵育4h后，吸弃上清液，加入ImL DMSO,轻轻震荡20min，使结晶物溶 解，离心后使用连续光谱酶标仪在490nm处测定溶液的光吸收值。
[0195] 通过激光共聚焦显微镜观察细胞在实施例3和12~15的支架材料上的渗透和铺 展：将2*10 4个/孔的细胞培养在材料上24h后PBS清洗三次，2. 5%戊二醛固定15min后 用异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽（FITC-Phalloidin)染色40分钟，PBS清洗5次、每次 5min，封片液封片后激光共聚焦下进行三维观察。
[0196] MTT法测得的细胞粘附和细胞增殖如图10中A和B所示，可见实施例3和12~ 15的支架上的细胞粘附数量随PGS涂覆量的增加而上升，且支架上粘附的细胞增殖速率也 随涂肤量增大。
[0197] 激光共聚焦显微镜拍摄的细胞黏附如图10中C中所示，可见复合支架材料的PGS 涂覆层有利于细胞的粘附，表现出良好的细胞粘附和相容性。
[0198] 实施例32
[0199] MBG/PGS复合支架材料的成骨诱导性能
[0200] 以鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs)为模型，接种于材料表面后24h将培基更换为成 骨诱导液（含2%胎牛血清、100U/mL青霉素、lOOU/mL链霉素、IOOnM地塞米松、IOOmM β -甘 油磷酸钠和0. 05mM抗坏血酸的a -MEM培养液），孵育至培养结束后测定其ALP活性：吸去 培基，用PBS小心冲洗一次后每孔加入1ml 1 % ΝΡ-40裂解液，37°C恒温振荡90min，得到的 细胞裂解液取10 μ 1测定总蛋白量（用BCA蛋白浓度测定试剂盒），50 μ 1至96孔板加入 200 μ I ALP工作液孵育2h显色，酶标仪测定405nm吸收波长。并通过rt-PCR测定细胞成 骨相关基因的表达。
[0201] 通过图11中A可看出，实施例3的70% MBG支架和12~15的孔隙率为70%的 MBG/PGS复合支架具有大致相同的ALP活性。
[0202] 图11中B的总蛋白量趋势与细胞增殖结果的趋势一致，表明PGS涂覆层在增强细 胞增殖的同时，并不影响MBG支架基体本身的成骨诱导性。从图11中C-E的成骨相关基因 表达数据可看出，MBG/PGS复合支架对成骨基因 Runx2、OPN和OCN的表达具有与MBG支架 相似的促进作用，再次证实了这一结果。
[0203] 对比例1
[0204] 采用浸泡法制备70 %孔隙率的MBG/PGS复合支架
[0205] 广泛使用的对支架表面进行的涂覆通常采用将支架浸泡于溶液中的方法，我们 按照这种常规方法进行了涂覆尝试。将实施例7制得的纯化非交联PGS与乙醇以0.1 g/ ml、0. 2g/ml、0. 4g/ml、0. 8g/ml、l. 6g/ml的质量体积比混合并超声处理使其均勾分散得到 PGS/乙醇溶液，将实施例3制得的70% MBG支架浸泡于不同浓度的溶液中，静置30分钟后 将支架取出冻干24h得到浸泡法制备的MBG/PGS复合支架。
[0206] 0. 4g/ml、0. 8g/ml、I. 6g/ml的质量体积比的PGS/乙醇溶液浸泡所得的复合支架， 由于溶液PGS含量过高、粘度过高，MBG支架的多孔结构被过量PGS覆盖而失去连通大孔结 构；0. lg/ml、0. 2g/ml的质量体积比的PGS/乙醇溶液浸泡所得的复合支架，其表面PGS涂 覆量与浓度不成正比，无法控制涂覆层厚度，从而无法对其力学强度、降解速率和蛋白缓释 速率等性能进行调控。
[0207] 对比例2
[0208] 采用浸泡法制备70 %孔隙率的负载BSA蛋白的MBG/PGS复合支架
[0209] 广泛使用的对支架表面进行的涂覆通常采用将支架浸泡于溶液中的方法，我们按 照这种常规方法进行了涂覆尝试。将实施例7制得的纯化非交联PGS与乙醇以0. lg/ml 的质量体积比混合并超声处理使其均匀分散得到PGS/乙醇溶液，将实施例6制得的70% MBG-BSA支架浸泡于溶液中，静置30分钟后将支架取出冻干24h得到浸泡法制备的70%孔 隙率的负载BSA蛋白的MBG/PGS复合支架。
[0210] 由于接触大量乙醇溶剂，将所得的负载BSA蛋白的MBG/PGS复合支架进行蛋白缓 释得到的蛋白进行圆二色谱分析，发现BSA蛋白结构变化率高达30%，严重失活。
[0211] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【主权项】
1. 一种介孔生物玻璃/聚癸二酸甘油酯复合支架，其特征在于，所述复合支架以介孔 生物玻璃多孔支架为基体，所述聚癸二酸甘油酯复合在所述介孔生物玻璃多孔支架上。
2. 如权利要求1所述的复合支架，其特征在于，所述聚癸二酸甘油酯占所述复合支架 总重量的5%~30%。
3. 如权利要求1所述的复合支架，其特征在于，所述复合支架具有以下一个或多个特 征： (1) 孔隙率为55 %~98% ; (2) 平均孔径为100~500 μπι ; (3) 平均孔壁厚度为90~150 μπι ; (4) 复合在所述介孔生物玻璃多孔支架上的所述聚癸二酸甘油酯的厚度为5~50 μ m。
4. 如权利要求1所述的复合支架，其特征在于，所述复合支架抗压强度为2~15MPa。
5. 如权利要求1所述的复合支架，其特征在于，所述聚癸二酸甘油酯为非交联聚癸二 酸甘油酯，数均分子量为10000~20000,分散性系数为1. 2-2。
6. 如权利要求1所述的复合支架的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步 骤： (a) 将聚癸二酸甘油酯溶液涂覆在所述介孔生物玻璃多孔支架上； (b) 将步骤a)获得的支架冻干后得到所述复合支架。
7. -种组织工程骨，其特征在于，所述组织工程骨包含权利要求1-5任一项所述的复 合支架。
8. -种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含： 权利要求1-5任一项所述的复合支架；和 用于骨修复的药物或生物活性因子。
9. 如权利要求1-5任一项所述的复合支架的用途，其特征在于，所述用途选自下组： (1) 用作骨组织工程支架； (2) 用作药物、蛋白和/或生长因子的释放载体； (3) 用作细胞培养载体； (4) 用于制备骨修改材料。
10. 如权利要求7所述的组织工程骨或权利要求8所述药物组合物的用途，其特征在 于，用于制备骨修复材料。
【专利摘要】本发明公开了一种介孔生物玻璃/聚癸二酸甘油酯复合支架及其制备方法和应用。本发明的复合支架，以介孔生物玻璃多孔支架为基体，聚癸二酸甘油酯复合在介孔生物玻璃多孔支架上。本发明复合支架的力学强度、降解速率、药物缓释速率以及细胞行为等可通过介孔生物玻璃基体孔壁厚度以及聚癸二酸甘油酯涂覆层的厚度进行调控。利用PGS涂覆层成功解决了MBG支架的脆性问题，复合支架的力学强度在小梁骨的承重范围内可调控；实现了对降解速率和固载于MBG介孔内蛋白的缓释速率的调控，且温和的涂覆操作不影响固载蛋白的活性；细胞实验表明PGS涂覆层能促进支架表面的细胞粘附和增殖，且不影响MBG的成骨活性。
【IPC分类】A61K47-34, A61L27-54, A61L27-42, A61K47-04
【公开号】CN104645417
【申请号】CN201510107574
【发明人】刘昌胜, 林丹, 杨凯, 袁媛
【申请人】华东理工大学
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年3月11日