一种分离纯化的无细胞百白破-b型流感嗜血杆菌-A群C群脑膜炎球菌联合疫苗及其制备方法

文档序号:8371064阅读:696来源:国知局
一种分离纯化的无细胞百白破-b型流感嗜血杆菌-A群C群脑膜炎球菌联合疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于疫苗生产制备技术领域,具体涉及一种分离纯化的无细胞百白破_b 型流感嗜血杆菌-A群C群脑膜炎球菌联合疫苗及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 百日咳、白喉、破伤风等疾病在我国流行范围广、危害严重,及时进行疫苗接种是 有效的预防保护性措施。百日咳、白喉和破伤风联合疫苗(DTP)作为最早纳入WHO扩大免 疫计划(EPI)的疫苗,已经在预防和控制这三种传染病方面发挥了重要作用。20世纪70年 代,由于接种全细胞百白破疫苗(DTwP)后出现了严重的不良反应,日本及荷兰等国家出现 了抵制疫苗接种及停用的现象,导致接种率下降,致使百日咳的发病率出现反弹。目前,绝 大多数发达国家均已经采用副反应较小的无细胞百白破疫苗(DTaP)为基础的联合疫苗, 作为常规免疫用疫苗。无细胞百日咳疫苗从生产工艺来讲可分为共纯化疫苗和分离纯化疫 苗。目前中国和日本部分企业采用的是共纯化工艺,即细菌培养后,盐析沉淀PT、FHA等保 护性抗原,然后用蔗糖密度梯度离心去除杂质,同时收集富含PT和FHA的有效成分。分离 纯化是采用柱层析将不同的保护性抗原分别纯化,然后再将各抗原定量配比成疫苗。分离 纯化法的成本较高,但优点是成分明确,容易进行质量控制,副作用更小。目前大多数发达 国家均采用柱层析分离纯化各组份来生产无细胞百日咳疫苗。
[0003] 流感嗜血杆菌(Haemophilus Influenza, Hi)迄今仍是导致人类侵袭性疾病的主 要致病菌,其中绝大部分由b型流感嗜血杆菌(Haemophilus Influenza type b,Hib)引 起。Hib脑膜炎居细菌性脑膜炎的首位,具有发病率高、病死率高和致残率高的特点;其另 一个特点是发病年龄小,婴幼儿感染率高,发病年龄主要集中在5岁以下,尤其是2岁以下。 全世界估计每年至少造成300万例严重疾病,其中约38. 6万人死亡,已成为全球性的一大 公共卫生问题。在发展中国家,Hib肺炎在儿童感染性疾病中占有重要地位,约占所有儿童 肺炎的20%,是发展中国家儿童肺炎的重要死亡原因。上世纪90年代初,西欧、美洲等国 家将Hib结合疫苗纳入常规儿童免疫规划,Hib侵袭性疾病的发病率迅速降低或消失。目 前,世界卫生组织(WHO)正致力于推动将其纳入其它国家的计划免疫程序中。在我国,3~ 5岁儿童中Hib自然感染抗体水平低,为Hib感染高危人群。我国医院临床研究提示,Hib 脑膜炎在小儿化脓性脑膜炎中占51. 7%,其中84%为2岁以下儿童;儿童中Hib肺炎占 34. 3%,因此我国有使用Hib结合疫苗的必要。
[0004] 流行性脑脊髓膜炎是一种由奈瑟氏脑膜炎球菌(Neisseriameningitidis)引起 的急性呼吸道传染病。一百多年来,一直在世界各地流行或散在发生,感染病原菌后可引 起败血症、脑膜炎。易感人群主要为儿童,以暴发型病死率最高,可达40%~60%。当今 世界各大洲发病率在1/10万~10/10万,总病死率在5%~15%,高达20%的脑膜炎患 者会有神经系统后遗症,包括智力受损和耳聋等。根据荚膜多糖型别进行血清学分类可分 13个血清型,其中A群,B群,C群约占流行菌群的90%。我国于1938年、1949年、1959 年、1967年和1977年发生过5次全国性流脑流行。其中以1967年春季最为严重,发病率 高达403/10万,病死率为5. 49%。我国过去90%以上的病例是A群病菌致病,现在B群 或C群病菌有时亦引起流脑暴发。2003年开始,C群流脑的发病率明显上升。目前A群和 C群共占所有血清群的50%以上,且C群仍有进一步增高的趋势。目前预防流脑最有效的 方法是接种疫苗。我国从2007年起已将流脑疫苗纳入国家免疫规划,在全国范围对适龄儿 童普及接种。
[0005] 目前在全世界可通过免疫接种来预防的疾病已经达三十多种,其中大部分是针对 儿童接种。自1974年WHO推行扩大免疫计划以来,疫苗的接种覆盖率得到大大提高,接种 次数也不断增加。据统计,儿童入学前需接受预防接种21次左右,在未来还会有新的疫苗 不断研究和开发出来,因此儿童免疫计划表中的疫苗种类也会随之增加。为了在儿童期有 限的时间内减少接种次数同时又能预防更多疾病,迫切需要研究开发联合疫苗。
[0006] 联合疫苗较以往的单价疫苗有很多优势,如更少的接种次数,降低婴幼儿创伤;提 高国家免疫计划表的实施效率,减少漏种;更高的免疫覆盖率;更低的空间存放要求;便于 未来增加新品种疫苗到免疫计划表中。因此从某种意义上说,联合疫苗在预防传染病的作 用中代表了未来疫苗的发展方向。其中,以无细胞百白破联合疫苗为基础的多联疫苗是近 年来的研究热点,联合疫苗中的组成成分也越来越多,如DTaP/Hib四联疫苗;DTaP-IPV/ Hib五联疫苗;DTaP-IPV-HBV-Hib六联疫苗。
[0007] 由于流行病分布的差异,目前国外还未上市DTaP-b型流感嗜血杆菌多糖结合物 与A群C群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物的联合疫苗(简称DTaP-Hib-AC)。国内虽然有在研 制中的相似产品百白破-Hib-AC联合疫苗,但其仍然采用传统甲醛杀菌工艺制备全细胞百 日咳疫苗原液,副作用较高。

【发明内容】

[0008] 本发明的目的在于克服现有技术的缺点,提供一种分离纯化的无细胞百白破_b 型流感嗜血杆菌-A群C群脑膜炎球菌联合疫苗及其制备方法,该疫苗具有安全、有效、可控 及一针防多病的特点,制备方法操作简单、制备方便、成本低,适宜于工业化大规模生产。
[0009] 本发明的目的通过以下技术方案来实现:一种联合疫苗,它由A组分和B组分组 成:
[0010] 所述A组分为液体制剂,它由以下组分组成:
[0011] 百日咳毒素:5~40μ g ;丝状血凝素:5~40μ g ;百日咳黏附素:2~10μ g ;白喉 类毒素:1〇~25LF ;破伤风类毒素:4~IOLF ;氢氧化铝:1. 0~2. Omg/ml ;氯化钠:7. 5~ 9. 5g/L ;
[0012] 所述B组分为冻干制剂,它由以下组分组成:
[0013] A群脑膜炎多糖结合物:10~30 Ug5C群脑膜炎多糖结合物:10~30 Ug5B型流 感嗜血杆菌多糖结合物:1〇~30μ g ;乳糖:5~20mg。
[0014] 一种联合疫苗的制备方法,它包括以下步骤:
[0015] SI.制备各单价疫苗原液:包括白喉类毒素原液、破伤风类毒素原液、无细胞百日 咳疫苗原液,所述无细胞百日咳疫苗原液包括百日咳毒素、丝状血凝素和百日咳黏附素;
[0016] S2.制备液体制剂:将百日咳毒素、丝状血凝素、百日咳黏附素、白喉类毒素原液、 破伤风类毒素原液加入用氯化钠稀释的氢氧化铝佐剂内,调pH至5. 8~7. 2,即为无细胞百 白破疫苗半成品;
[0017] S3.制备各单价疫苗原液:包括A群脑膜炎球菌结合疫苗原液、C群脑膜炎球菌结 合疫苗原液、b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液;
[0018] S4.制备冻干制剂:将A群脑膜炎球菌结合疫苗原液、C群脑膜炎球菌结合疫苗原 液、b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液按照I: I: I (w/w)合并混匀,加入乳糖,用注射用水稀 释,即为AC群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌联合疫苗半成品;
[0019] S5.分装和包装
[0020] 将上述制备的吸附无细胞百白破联合疫苗半成品分装于西林瓶或者预灌装注射 器中,AC群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌联合疫苗半成品分装于西林瓶中进行真空冷冻 干燥后再独立包装。
[0021] 进一步地,A组分由以下步骤制备而成:
[0022] SI.制备各单价疫苗原液
[0023] SlL白喉类毒素原液:开启白喉杆菌,先在产毒培养基种子管中传1~3代,再转 至产毒培养基制成生产用种子;采用培养罐液体培养,培养基采用改良林氏培养基,34~ 36°C培养45~52h,培养结束后加入甲醛杀菌,在培养物中加入硫酸铵沉淀杂蛋白,离心收 集上清;上清液超滤浓缩后再加入硫酸铵盐析沉淀白喉毒素蛋白,离心收集沉淀,加生理盐 水溶解,超滤去除毒素中的硫酸铵,加入甲醛,置35~37°C,脱毒30天,除菌过滤即为白喉 类毒素原液;
[0024] S12.破伤风类毒素原液:开启破伤风梭状芽孢杆菌,先在产毒培养基种子管中传 1~3代,再转至产毒培养基制成生产用种子;采用培养罐液体培养,培养基采用双胨培养 基,34~36°C培养62~72小时;培养结束后加入甲醛杀菌,培养液经过滤去除菌体,加入 硫酸铵沉淀毒素蛋白,离心收集沉淀,超滤去除毒素中的硫酸铵后加入甲醛,置35~37°C 脱毒30天,除菌过滤即为破伤风类毒素原液;
[0025] S13.无细胞百日咳疫苗原液:开启百日咳杆菌,接种于改良包-姜培养基或活性 炭半综合培养基,于35~37°C培养不超过48小时,再接种于CPB培养基中传两代,每代培 养时间18~26小时,进行扩增培养以制备足够的生产用种子,然后接种到发酵罐中液体培 养,培养基采用CPB培养基,37°C培养两天,培养结束后在培养物中加入0. 01 %硫柳汞进行 杀菌处理,将收获的培养物离心,离心收获的菌体和上清液2~8°C保存待下一步纯化。
[0026] A.百日咳黏附素的分离纯化:将菌体采用60°C热释放,超滤浓缩后,上样于Capto adhere层析柱,以醋酸缓冲液为流动相,收集含百日咳黏附素的洗脱组份,再上样于Capto SP层析柱,以醋酸缓冲液为流动相,以氯化钠梯度洗脱,收集洗脱峰,即为分离纯化的百日 咳黏附素;
[0027] B.百日咳毒素和丝状血凝素的纯化:将上清液超滤浓缩后上样于CaptoSP层析 柱,流动相采用含尿素的磷酸盐缓冲液,以氯化钠梯度洗脱,分别收集含百日咳毒素和丝 状血凝素的洗脱组份,将含百日咳毒素的洗脱组份上样于CaptoMMC层析柱,缓冲液采用 Tris-HCl缓冲液,以氯化钠梯度洗脱,收集百日咳毒素洗脱峰;将含丝状血凝素的洗脱峰 上样于羟基磷灰石层析柱纯化,收集洗脱峰;
[0028] C.制备无细胞百日咳原液:将百日咳毒素采用戊二醛、丝状血凝素和百日咳黏附 素采用甲醛进行脱毒,除菌过滤后即为无细胞百日咳原液;
[0029] S2.合并及稀释:将百日咳毒素、丝状血凝素、百日咳黏附素、白喉类毒素原液、破 伤风类毒素原液加入用氯化钠稀释的氢氧化铝佐剂内,调PH至5. 8~7. 2,即为无细胞百白 破疫苗半成品。
[0030] 进一步地,B组分由以下步骤制备而成:
[0031] SI.制备各单价疫苗原液
[0032] SlL A群脑膜炎球菌结合疫苗原液:开启A群脑膜炎球菌工作种子批菌种,接种至 流脑半综合培养基,温度35~37°C,培养16~24小时,然后经过三代扩增培养,制备生产 用种子,将其接种至发酵罐培养,温度35~37°C,培养时间6~12小时后加入甲醛杀菌; 将已杀菌的培养液离心收集上清,然后加入十六烷基三甲基溴化铵至终浓度I. 〇g/L,充分 搅拌后静置
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