2分钟95°C变性，接着进行95°CX20秒、 50°CX30秒、72°CX5分钟的30个循环。
[0126] 产品纯化的扩增
[0127] 使用AmpureAgencourtXP磁珠（BeckmanCoulter，cat#A63880)纯化 16S扩 增产品。首先,每个样品的三份反应物在1. 7毫升微量离心管中混合并以0. 7倍体积比加 入AmpureXP磁珠。涡流后,混合的样本在室温下培育10分钟,然后放在一个磁性表座上 分离磁珠（Invitrogen,cat. #123_21D)。将磁珠按照制造商的说明使用200ul70%的乙 醇洗涤2次。将磁珠在37°C下干燥5分钟，并用20u110iiM的三羟甲基氨基甲烷缓冲液 (Tris) /0.IUM:的乙二胺四乙酸（EDTA)洗脱DNA。在磁性表座上将洗脱液与磁珠分离，并转 移到新的1. 7毫升的微离心管中，使用Quant-ItdsDNA高灵敏度测定试剂盒（Invit.rogen， cat#Q33120)定量。然后将等量的每个样本汇集到454测序管中。
[0128] 454测序和序列分析
[0129] 采用使用钛化学的GS初级（Roche)进行454测序。除了利用GS初级的标准的过滤 器确定已经传递的测定的序列，我们使用修改的扩增子处理算法来减少错误丢弃的序列。 相对于大肠杆菌16S序列，由核糖体数据库项目人员在MSU进行对齐16SrRNA序列，和在 大肠杆菌16S核苷酸位置617到900进行整理。使用MOTHURV.1. 21(http:/7www.mothur. org/wi:ki/)进行后续处理和分析（包括多样性指标）。使用软件包PAST进行ANOSIM(相似 性分析）和主坐标分析。使用Bray-Curtis方法利用附图和表格测量两个或两个以上的微 生物群落之间的不相似程度。在这些分析中，我们选择临界值〇. 03的操作分类单位（OUT)， 这被认为是观察在种级的群落。从这些数据，我们得出结论是对切除卵巢的老鼠喂食罗伊 氏乳杆菌ATCCPTA6475的治疗产生了与改善骨骼健康相关的在回肠和空肠的微生物群落 的显著转变。（表1中的切除卵巢和乳酸杆菌）。
[0130]表 1
[0131]
【主权项】
1. 一种选择用于预防或治疗骨质疏松的乳酸杆菌菌株的方法,所述方法包括选择相对 于罗伊氏乳杆菌JCM 1112 (SEQ ID NO=I)的基因组具有至少95%的同一性的乳酸杆菌菌 株，并且所述乳酸杆菌菌株相对于罗伊氏乳杆菌JCM 1112 (SEQ ID NO: 1)的基因组具有相 同的核苷酸，所述核苷酸位于下列四个位置中的至少一个：碱基对271391中的C、碱基对 453 538中的G、碱基对529 228中的G和碱基对599 338中的C。
2. --种选择用于预防或治疗骨质疏松的乳酸杆菌菌株的方法,所述方法包括选择--种 罗伊氏乳杆菌，所述罗伊氏乳杆菌相对于罗伊氏乳杆菌JCM 1112 (SEQ ID NO: 1)的基因组 具有相同的核苷酸，所述核苷酸位于下列四个位置中的至少一个：碱基对271 391中的C、 碱基对453 538中的G、碱基对529 228中的G和碱基对599 338中的。
3. 根据权利要求1或2所述的方法,其中，所述乳酸杆菌菌株具有所述四种核苷酸中的 至少两种。
4. 根据权利要求1至3任一项所述的方法，其中,所述乳酸杆菌菌株具有所述四种核苷 酸中的至少三种。
5. 根据权利要求1至4任--项所述的方法,其中，所述乳酸杆菌菌株具有所述四种核苷 酸中的全部四种。
6. -种选择用于预防或治疗骨质疏松的乳酸杆菌菌株的方法，所述方法包括选择一种 相对于罗伊氏乳杆菌JCM 1112 (SEQ ID NO: 1)的基因组具有至少95 %同一性的乳酸杆菌 菌株,条件是所述乳酸杆菌菌株相对于罗伊氏乳杆菌JCM 1112 (SEQ ID NO: 1)的基因组不 具有至少一种突变，所述突变选自由碱基对271 391中的C到T、碱基对453 538中的G到 A、碱基对529 228中的G到A、和碱基对599 338中的C到T四种突变组成的组。
7. 根据权利要求6所述的方法，其中，所述乳酸杆菌菌株不具有所述四种突变中的至 少两种。
8. 根据权利要求6或7所述的方法，其中，所述乳酸杆菌菌株不具有所述四种突变中的 至少三种。
9. 根据权利要求6-8任一项所述的方法，其中，所述乳酸杆菌菌株不具有所述四种突 变中的任何一种。
10. -种根据权利要求1-9任一项所述方法选择的乳酸杆菌菌株，所述乳酸杆菌菌株 用于预防或治疗骨质疏松。
11. 一种乳酸杆菌菌株,所述乳酸杆菌菌株具有与罗伊氏乳杆菌JCM 1112 (SEQ ID NO :1)的基因组至少95 %的同--性，并且所述乳酸杆菌菌株相对于罗伊氏乳杆菌JCM 1112(SEQ H) N0:1)的基因组具有相同的核苷酸,所述核苷酸位于下列四个位置的至少一 个：碱基对271 391中的C、碱基对453 538中的G、碱基对529 228中的G、和碱基对599 338中的C,所述乳酸杆菌菌株用于预防或治疗骨质疏松。
12. 根据权利要求11所述的乳酸杆菌菌株,其中，所述乳酸杆菌菌株为罗伊氏乳杆菌 ATCC PTA 6475。
13. -种组合物,所述组合物包括根据权利要求1-9任一项所述方法选择的乳酸杆菌 菌株。
14. 一种包括乳酸杆菌菌株的组合物,所述乳酸杆菌菌株相对于罗伊氏乳杆菌JCM 1112(SEQ ID NO :1)的基因组具有至少95%的同一性，并且相对于罗伊氏乳杆菌JCM 1112(SEQ ID NO :1)的基因组具有相同的核苷酸,所述核苷酸位于下列四个位置中的至少 一个：碱基对271 391中的C、碱基对453 538中的G、碱基对529 228中的G、和碱基对599 338中的C。
15. 根据权利要求14所述的组合物,其中，所述乳酸杆菌菌株为罗伊氏乳杆菌ATCC PTA 6475。
16. 根据权利要求13-15任一项所述的组合物,其中，所述组合物用于预防或治疗骨质 疏松。
17. 根据权利要求13-15任一项所述的组合物,其中,所述组合物用在更年期女性、有 过子宫切除术的女性、糖尿病患者、骨质减少的个体、骨质疏松的个体和代谢紊乱的个体中 预防骨质疏松。
18. 根据权利要求13-15任一项所述的组合物,其中，所述组合物用于改进骨折后的骨 修复。
19. 根据权利要求13-15任一项所述的组合物,其中,所述组合物与维他命D相结合用 于预防或治疗骨质疏松。
20. 根据权利要求13-15任一项所述的组合物，其中,所述组合物与激素相结合用于预 防或治疗骨质疏松。
21. 根据权利要求13-20任一项所述的组合物,其中,所述组合物为药物组合物、食物 产品或食品补充剂。
22. -种乳酸杆菌菌株的用途，所述乳酸杆菌菌株相对于罗伊氏乳杆菌JCM 1112 (SEQ ID NO :1)的基因组具有至少95%的同一性，并且所述乳酸杆菌菌株相对于罗伊氏乳杆菌 JCM 1112(SEQ ID NO :1)的基因组具有相同的核苷酸,所述核苷酸位于下列四个位置中的 至少一个：碱基对271 391中的C、碱基对453 538中的G、碱基对529 228中的G、和碱基 对599 338中的C，所述乳酸杆菌菌株用于制备预防或治疗骨质疏松的药物组合物。
23. 根据权利要求22所述的用途,其中,所述乳酸杆菌菌株为罗伊氏乳杆菌ATCC PTA 6475。
24. -种用于治疗或预防骨质疏松的方法，所述方法包括对个体施用乳酸杆菌菌株，所 述乳酸杆菌菌株相对于罗伊氏乳杆菌JCM1112(SEQ m N0:1)的基因组具有至少95%的同 一性,并且所述乳酸杆菌菌株相对于罗伊氏乳杆菌JCM 1112 (SEQ ID NO: 1)的基因组具有 相同的核苷酸,所述核苷酸位于下列四个位置中的至少一个：碱基对271 391中的C、碱基 对453 538中的G、碱基对529 228中的G、和碱基对599 338中的C。
25. 根据权利要求24所述的方法，其中，所述乳酸杆菌菌株为罗伊氏乳杆菌ATCC PTA 6475。
【专利摘要】本发明包括一种选择有效用于预防人体骨质疏松的乳酸杆菌菌株的方法和根据所述方法选择的菌株。所述选择方法是基于所述菌株能够重建变异的微生物群落至正常态和/或具有四种特定SNP的至少一种。ATCC PTA 647520041221
【IPC分类】A23L1-30, A61K35-747, A61P19-08
【公开号】CN104755091
【申请号】CN201380029676
【发明人】埃蒙·康诺利, 罗伯特·艾伦·布里顿, 劳拉·雷·麦凯布
【申请人】生命大地女神有限公司, 密歇根州立大学
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2013年6月4日
【公告号】CA2875841A1, EP2854826A1, US20150150917, WO2013184064A1