5min)。超净台风干；沉淀不能过干或过湿，过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。视沉淀量加 入适量DEPC水（至少15ul)溶解沉淀。
[0122] 使用RNase-free的DNaseI(Promega)，按以下体系配置反应液，37°C消化30min， 65°C灭活IOmin。
[0123]
[0124] 然后按以下步骤操作：
[0125] 1)加入等体积的苯酚/氯仿，上下颠倒混匀，室温放置5min，后14,OOOrpm，离心 15min，取上清。
[0126] 2)加入等体积的氯仿，上下颠倒混勾，静置分层后14,OOOrpm，离心15min，取上 清。
[0127]3)加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8次），_20°C静置15min;
[0128] 4) 4°C下，14,OOOg离心15min，收集RNA沉淀，去上清；5)用75 %乙醇洗涤两次 (12,OOOg离心5min)，超净台风干；6)加入适量DEPC水（至少15ul)溶解沉淀。
[0129] 纯度检测：取IyIRNA样品50倍稀释，在核酸蛋白检测仪上测定OD值，0D260/ 0D280的比值应大于1.8。
[0130]总RNA完整性检测：取RNA样品IyI，1 %琼脂糖凝胶电泳80VX20min，EB染色 lOmin，用凝胶成像系统观察并拍照，总RNA的5srRNA，18srRNA和28srRNA条带，三条条 带完整的话即可证明总RNA抽提比较完整。
[0131] 计算好实验中需用多少份体系，则按具体量配置。总的体系配好后，在振荡器中振 荡均匀或用枪吸打均匀，然后15ul每管分装至8连管中。
[0132] cDNA用灭菌纯水稀释适当的浓度，一般为1:20稀释，如遇到基因表达低的样品， 则适当降低稀释比例至1:10或1: 5。cDNA按一定顺序排好后，即可加至刚配好的反应体系 中。加样完毕。把各排八连管放在掌上离心机上离心数秒，随后上机检测。
[0133] 本发明中所涉及的引物序列由表2给出。
[0134] 表2本发明中所涉及的引物序列
[0135]
[0138] 2.IOWesternblot检测
[0139] 蛋白抽提：细胞培养至所需要的密度时，细胞经预冷的PBS漂洗3次，加入450yI 裂解液，细胞刮刀收集，用移液器转移至离心管中，反复吹打。所得的样品用超声细胞破碎 仪超声处理，超声时为5S，间歇时间为10S，功率为100-120W至溶液清澈无粘稠为止，处理 过程在水浴中进行，后4°C25000g离心，上清液样品置KKTC水浴箱里水浴加热3-5分钟， 1000 Og离心10分钟，取出清液，将其移入另一洁净试管中。
[0140] 蛋白定量：
[0141] ①Bradford法浓染液的配制：将IOOmg考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇， 加入100mL浓磷酸；然后，用蒸馏水补充至200ml;此染液放4°C至少6个月保持稳定。
[0142] ②标准曲线蛋白质样本的制备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准 品，例如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准，如果待测样品是未知的，也可用抗体作为标 准蛋白，通常在20yg-150yg/100y1之间绘制标准曲线。
[0143] ③将待测样本溶于100y1缓冲溶液中，该缓冲溶液相同（最好用PBS)。
[0144] ④按照1:5用水稀释浓燃料结合溶液，如果出现沉淀，过滤除去。
[0145] ⑤每个样品加5ml稀释的染料结合溶液，作用5-30分钟，染料与蛋白结合，将由红 色变为兰色，在595nm波长下测定其吸光度，注意显色反应不超过30分钟。
[0146] ⑥根据标准曲线计算待测样品的浓度。
[0147] 制做分离胶、浓缩胶：
[0148] ①按比例配制分离胶，轻缓地摇动溶液（8-10下），使激活剂混合均匀，将凝胶溶 液平缓地注入两层玻璃极中，再在液面上小心注入一层水或正丁醇，以阻止氧气进入凝胶 溶液中，然后静置90min。
[0149] ②同前按比例配制浓缩胶，但摇动溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。吸 去不连续系统中下层分离胶上的水分，以连续平稳的液流注入凝胶溶液，然后小心插入梳 子并注意不得在齿尖留有气泡，静制90min以上以保证完全聚合。
[0150] 加样：预电泳后依次加入标准品和待分析样品，注意加样时间要尽量短，以免样品 扩散，为避免边缘效应，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液。
[0151] 电泳：加样完毕，盖好电泳槽的盖子并选择适当的电压进行电泳，通常在连续系统 中，上层浓缩胶的电泳电压要低于分离胶的电泳电压，使样品更好的进入凝胶，电泳时，应 采用恒压的模式，这样蛋白质才可以保证恒定的电泳迀移率。一般采用恒压浓缩胶80V，分 离胶120V，电泳直至溴酚染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳。
[0152] 转膜：
[0153] ①Tris/甘氨酸-SDS-PAGE结束后，取出凝胶，在Tris/甘氨酸缓冲液中漂洗数 秒。取凝胶方法：用刀片将两玻璃板分开，将多余的凝胶划去，上部以浓缩胶为准全部弃去， 下部以分子量标准最小分子带下一点全部划去，取一IOml注射器注满转印缓冲液，插入玻 璃板与凝胶之间注水，使水的压力将两者自然分开，边推边进，反复多次注水，直至凝胶从 玻璃板上滑落下来。
[0154] ②将NC膜和滤纸切出与凝胶一样大小，置转移缓冲液中湿润5-10min.
[0155] ③按照以下顺序放置滤纸，凝胶和NC膜到半干槽中。
[0156] ④每层之间的气泡要全部去除。可以用IOml吸管轻轻在上一层滚动去除气泡，然 后用一绝缘的塑料片中间挖空与凝胶一样大小或略小一点，以防电流直接从没有凝胶处通 过造成短路，盖好加上阳极电极板。
[0157] 膜的封闭：
[0158] 1)洗转印膜：室温漂洗3次XlOmin，以尽量洗去转印膜上的SDS，防止影响后面的 抗体结合。
[0159] 2)取漂洗的转印膜，放入5%No-fatmilk的封闭液内，摇床震动，室温封闭2h，也 可在4度过夜。
[0160] 3)用lxTBS-T，PH7. 6 洗液，室温漂洗 3 次xlOmin.
[0161] 抗体孵育：
[0162] 1)封闭后的杂交膜放入杂交袋中，加入抗体稀释液稀释的Abl浓度为lug/ml，封 口，4°C孵育过夜或室温（22-25°C)摇动孵育2h;
[0163] 2)液洗膜 3 次xlOmin;
[0164] 3)标记的Ab2 (羊抗兔-HRP)室温lh，洗膜3xl0min。
[0165]检测：
[0166] ①DAB显色液的配制：按照lmlH20加显色剂A，B，C各1滴，混匀。
[0167] ②显色：将适量DAB显色液平铺在Ab2杂交后的印迹膜上，室温放置观察，可出现 明显的棕褐色蛋白显色带。
[0168] ③终止：用Tris-HCl缓冲液或水漂洗杂交膜即可终止反应。
[0169] 3?实验结果
[0170] 3.IsiRNA干扰靶基因结果
[0171] 体外实验中，本发明筛选出了有效的SiRNA序列，相对于对照组，能够显著敲低大 鼠和人类Cdhl和FoxOl的基因表达，和蛋白水平的表达（图2)。
[0172] 3. 2E_Cadherin敲低后可逆转分化细胞成为干细胞
[0173] 体外实验中，我们发现皮肤角质形成细胞敲低E-cadherin的表达后，通过免疫荧 光检测，比较干预前后干细胞标记物的变化。PCR实验发现，诸多干细胞标记物相对于对 照组显著上升。例如：基底层干细胞和毛囊干细胞都表达的ITGB1、ITGA6、Krtl5、Krt5， Krtl4,毛囊干细胞特有标记物：⑶34,S0X9,Krtl9 (图3左）（毛囊干细胞是相对于基底 层干细胞更原始的干细胞标记物）。Westernblot实验进一步证实，基底层干细胞标记物 Keratin5，ITGA6表达量相对于对照组显著升高，除此以外，毛囊干细胞标记物Keratin 19,Keratin15 重新开始表达，而分化标记物，如Krtl，KrtlO，Involucrine，Filaggrin， Loricrin则显著降低（图3右）。在免疫荧光检测中，研宄发现诸多干细胞标记物表达高 于对照组，与westernblot实验结果相符（图4左）。
[0174] 3. 3E_Cadherin敲低后可促进角质形成细胞增殖、抗凋亡能力。
[0175] 在进一步实验中发现，皮肤角质形成细胞敲低E-cadherin的表达后，可显著增加 细胞的增殖能力，增殖指数显著高于对照组。在失巢凋亡的流式检测中，敲低E-cadherin 的表达后，可显著增加细胞的早期抗凋亡能力，增加细胞的生存活力（图4右）。
[0176] 3. 4E_Cadherin敲低后激活Wnt/ 0-catenin信号通路
[0177] 本发明发现，当干扰E-Cadherin表达后，可促进转录因子|3-catenin的基因 CTNNBl的表达及|3 -catenin蛋白核转移能力增加（图5)，并从而激活Wnt/ |3 -catenin信 号通路。在进入细胞核后，转录因子0-catenin能够结合端粒酶的启动子部位，并启动对 端粒酶基因T