用于选择性减少循环的生物活性可溶性tnf的组合物以及用于治疗tnf介导的疾病的方法
【专利说明】用于选择性减少循环的生物活性可溶性TNF的组合物以及 用于治疗TNF介导的疾病的方法
[0001] 以电子形式提交的材料的通过引用结合
[0002] 申请人特此通过引用结合与此同时以电子形式提交的序列表材料。这个文件被标 记为GGPllPCT_ST25.txt〃，建立于2014年1月23日，并且大小为2KB。
[0003] 发明背景
[0004] 肿瘤坏死因子（TNF ;先前称为肿瘤坏死因子-a )是一种在类风湿性关节炎和相 关炎性疾病如强直性脊柱炎、幼年型类风湿性关节炎、和银肩病关节炎的发病中起主要作 用的促炎细胞因子。人类原形式（proform)，跨膜结合的TNF (tmTNF)，是一种包含三个非共 价结合单体的26-kDa的同源三聚体，每个单体具有嵌入细胞膜中的N末端序列。tmTNF的 每个单体具有一个233个氨基酸的序列（UniProtKB/Swiss-Prot登录号P01375)。可溶性 TNF(sTNF)是由其原形式tmTNF经过酶切形成的同源三聚体。sTNF三聚体的每个单体具有 一个157个氨基酸的序列（SEQ ID N0:1)，其与公开的登录号P01374的aa77到233的序列 相同。
[0005] 活性TNF的两种形式（tmTNF和sTNF)作为同源三聚体15=13存在并且接合三聚体受 体，所述三聚体受体识别在组装的同源三聚体中的TNF单体之间的沟中的受体结合部位。 在这些单体之间的沟包括来自两个连续单体的氨基酸序列im。两种形式的TNF的受体结 合区域是相同的。
[0006] 三聚体完整性对于生物学功能是必需的。对于tmTNF，三聚体结构是在tmTNF插入 到细胞膜中之前建立的 1"并且通过穿过该膜的蛋白质茎的锚定加上在膜边界处的棕榈酰 化氨基酸侧链的进一步脂质销定而被维持在tmTNF中&相比之下，sTNF活性三聚体自由 解离成无活性单体SEQ ID NO: 1和二聚体，这些二聚体重新形成在这三种形式之间处于稳 态平衡中的活性sTNF同源三聚体'
[0007] 抗TNF生物制品已经提供了在用抗TNF单克隆抗体瑞米凯德（REMICADE)(英利 昔单抗；杨森生物科技集团（Janssen Biotech, Inc.))和HUMIRA(阿达木单抗，雅培公司 (Abbott Laboratories))、以及一种广泛使用的融合到Fc上的嵌合的溶解的TNF受体，即， ENBREL(依那西普，百健艾迪公司（Biogen，Inc.彡） 1'1处理上述炎性疾病上的重大进步。这 种治疗和销售成功被严重感染和恶性肿瘤的罕见但是统计学上显著的事件破坏w，这很可 能与损害免疫防御的tmTNF s'&的伴随阻滞相关。这些不良事件包括主要由于细胞内病原体 如结核分枝杆菌、单核细胞增多性李斯特菌和荚膜组织胞浆菌所致的结核病、全身性真菌 感染和其他细胞内感染、以及某些形式的癌症的产生。这些结果并不出人意料，因为这些因 子阻断了促炎性sTNF但也阻断了对于这种细胞内感染和恶性肿瘤的邻分泌细胞控制是必 需的 tmTNF3'7'9。
[0008] 由于两种形式的TNF的受体结合区域是相同的，开发出一种形式相对于另一种形 式选择性地阻断受体接合的新的单克隆抗体没什么希望。针对TNF的短序列的抗体未曾产 生过有用的治疗剂。例如，在1987年，索赫尔（Socher)等人 26在开发针对TNF的完全或部 分合成序列的抗体中观察到针对TNF片段1-15的高度多克隆抗体反应，其显现出阻断TNF 的生物活性和受体结合。然而，这一 16年之久的观察并未产生另外的治疗试剂的开发，这 很可能是由于TNF受体是不与TNF氨基酸1-15相关的不连续表面区域。后续研宄者在2001 年使TNF氨基酸4-23结合到乳头瘤病毒样颗粒上，并且观察到多克隆抗体的诱导、以及实 验性关节炎的减轻其他研宄者在2007年使用了相同的偶联到基于病毒样颗粒的组合 物上的片段TNF aa4-23并且诱导了减轻实验性关节炎的抗体。与全长TNF免疫相比，没有 发生针对感染的抗性的抑制M。由于这些TNF片段不是针对TNF的受体结合区域，这些出 版物没有显示进一步的这些生成的多克隆抗体的治疗用途的教导或建议；并且从那时起未 曾公开过进一步的研宄。
[0009] -项更近的选择性地抑制sTNF的促炎活性同时保留先天免疫所需要的tmTNF功 能的尝试涉及形成无活性的三聚体的合成的显性阴性TNF单体变体的设计 ' 这些变体显 示出减轻实验性关节炎而不抑制针对感染的先天免疫 ' 强调了 sTNF在关节炎发病机制中 的重大作用。另一个途径已经寻求与单体间接触区域相互作用的小分子药物。一种分子， SP304,以yM亲和力结合这样一个接触区域，从而引起三聚体的体外破坏^'气
[0010] 尽管在针对多种炎性病症的抗TNF治疗领域中的文献很多，在本领域中对于新颖 且有用的组合物以及用于产生针对这些疾病的治疗性或预防性免疫原性组合物的方法仍 然存在着需要，这些组合物并不导致由于细胞免疫的抑制所致的不良副作用。
[0011] 发明概述
[0012] 如本文所述，本发明人提供了选择性抗TNF单体特异性生物组合物及其不同使用 方法，所述方法不影响tmTNF的结构或生物活性或者不增加被治疗的受试者对由于细胞内 病原体所致的感染的易感性。
[0013] 在一个方面，提供了一种特异性结合到人TNF的解离单体的表位上的分离的或 合成的抗体或配体。抗体或配体与该单体的结合破坏或阻止该单体组装成生物活性三聚 体人sTNF。在一个实施例中，该抗体或配体特异性地结合SEQ ID NO: 1的氨基酸8-15的 PSDKPVAH或SEQ ID N0:1的氨基酸8-16的PSDKPVAHV序列的单体特异性表位A2。在又另 一个实施例中，该抗体或配体特异性地结合SEQ ID N0:1的氨基酸116到124的EPHLGGVF 序列的单体特异性表位F。在一个实施例中，该抗体是针对表位A2和F的双特异性抗体。
[0014] 在另一个方面，一种药物组合物包含特异性地结合人TNF的解离单体的表位的一 种或多种分离的或合成的抗体或配体、以及一种药学上可接受的载体或稀释剂，该结合破 坏或阻止该单体组装成生物活性三聚体人sTNF。在某些实施例中，该组合物含有上述抗体 的一种或两种。
[0015] 在又一个另外的方面，提供了用于制备或产生特异性地结合人TNF的解离单体的 表位的分离的或合成的抗体或配体的方法。
[0016] 在又另一个方面，一种用于治疗患有由可溶性人TNF(sTNF)介导的疾病的受试者 的方法包括减少患有该疾病的受试者的血液中的sTNF的量、浓度或生物活性，而不影响 tmTNF的量、浓度或生物活性。这是通过破坏、阻止或减少TNF的解离单体在体内组装或再 组装成生物活性三聚体人sTNF而不影响tmTNF的量、浓度或生物活性来完成的。在某些实 施例中，这种方法采用了在上文和在此描述的单体特异性抗体、双特异性抗体、配体和组合 物。在一个实施例中，该疾病是类风湿性关节炎（RA)、幼年型类风湿性关节炎、强直性脊柱 炎（AS)、银肩病关节炎或银肩病。
[0017] 在又另一个方面，sTNF升高还在初发HIV感染、以及潜伏HIV感染和II型糖尿病 的复发中涉及。因此，在又另一个方面，一种用于预防感染有HIV-1并且用抗逆转录病毒药 物进行治疗的受试者发生新的感染（或由于HIV所致的反弹感染）的方法包括在中断ART 之后向该用抗逆转录病毒治疗（ART)进行治疗的受试者给予如本文所述的一种分离的或 合成的选择性抗TNF单体特异性抗体或配体、或药物组合物。
[0018] 在又另一个方面，一种用于治疗患有II型糖尿病的受试者的方法包括定期地向 对其有需要的受试者给予如上所述的一种分离的或合成的选择性抗TNF单体特异性抗体 或配体、或药物组合物，任选地与已知的抗糖尿病治疗相结合。
[0019] 在其他方面，本文所述的这些TNF单体特异性抗体、配体、双特异性抗体、或组合 物被提供为用于在包括本文鉴定的任何疾病在内的由可溶性人TNF介导的疾病或失调的 治疗中使用。在其他方面，提供了本文所述的这些抗体、配体、或组合物在用于治疗包括本 文鉴定的任何疾病在内的由可溶性人TNF介导的疾病或失调的药剂的制备中的用途。
[0020] 这些方法和组合物的其他方面和优点进一步描述于以下详细说明中。
[0021] 附图简要说明
[0022] 图1展示了针对TNF界面A和TNF界面F的免疫原和表位检测子序列，其用来鉴 定本文所述的三种单体特异性TNF表位A1、A2和F的序列和边缘以及针对其产生的抗TNF 单体特异性抗体的结合活性。这些序列论述于以下实例1中。
[0023] 图2A是通过用sTNF氨基酸1-23免疫大鼠展示这些TNF单体特异性表位的柱状 图。采用指示的末端截短的TNF肽，在重组TNF(rTNF)(单体、二聚体和三聚体的混合物） 上、以及在合成肽上测量了抗体结合反应。这些合成检测子肽包括：显示根本不结合的SEQ ID NO:l的TNF氨基酸1-10;最小结合至不结合的SEQ ID NO:l的TNF氨基酸5-12;SEQ ID NO:l 的 TNF 氨基酸 4-12 的 A1 表位 SSRTPSDKP;SEQ ID NO:l 的 TNF 氨基酸 4-11 SSRTPSDK; SEQ ID NO: 1 的 TNF 氨基酸 9-15SDKPVAH ;SEQ ID NO: 1 的氨基酸 8-15 的 A2 表位序列；SEQ ID NO: 1的TNF氨基酸8-14PSDKPVA;以及展现出不结合的SEQ ID NO: 1的TNF氨基酸16-23 VVANPQAE。仅仅两个重叠表位通过针对TNF氨基酸1-23的大鼠抗血清清楚地检测到，为表 位A1 (TNF氨基酸4-12)和及A2 (TNF氨基酸8-15)。
[0024] 图2B是展示使用图2A中所述的相同程序用合成肽在小鼠血清中检测到的A2表 位PSDKPVAHV的边缘的柱状图。这些合成检测子肽包括：显示最小结合的SEQ ID N0:1的 TNF氨基酸10-17 DKPVAHVV ;具有最小结合的TNF氨基酸9-16 ;A2表位PSDKPVAHV，SEQ ID NO: 1的TNF氨基酸8-16 ;SEQ ID NO: 1的TNF氨基酸8-15PSDKPVAH ;以及没有接合的SEQ ID NO: 1的TNF氨基酸8-14 PSDKPVA。当使用大鼠和兔血清时，表位A2的边界是SEQ ID NO: 1的氨基酸8-15。小鼠的免疫系统仅仅可见TNF氨基酸8-16并且不结合TNF氨基酸 8-15,如图中所示。
[0025] 图 2C 是展示通过用 SEQ ID NO: 1 的 sTNF 氨基酸 112-128 KPffYEPIYLGGVFQL EK(加下划线的界面区；F表位以粗体表示）免疫大鼠或小鼠确定这些单体特异性TNF表位 的边缘的结果的柱状图。采用指示的四种末端截短的TNF肽，在重组TNF(rTNF)(单体、二聚 体和三聚体的混合物）上、以及在合成肽上测量了抗体结合反应。这些合成肽是HLGGVF， SEQ ID N0:1 的氨基酸 118-124;PHLGGVF，SEQ ID N0:1 的氨基酸 117-124，EPHLGGVF，SEQ ID N0:1的氨基酸116-124(表位F)和EPHLGGV，SEQ ID N0:1的氨基酸116-123。最大的 结合是针对aall6-124肽，由此指示该表位（称为表位F)的边缘。
[0026] 图3A展示了来自使用200ng/mL的sTNF、生物素标记抗体和非生物素标记抗 体的夹心测定的数据，如下文在实例2中所述。这些结合曲线显示，可商购的瑞米凯德 (REMICADE)抗TNF抗体，当用生物素标记并与sTNF(三聚体、二聚体和单体）混合时，结合 TNF的多聚体形式。在该混合物中的生物素化抗体-TNF仍然具有可用的TNF三聚体表位， 所述表位可与未标记的铺板瑞米凯德（REMICADE)抗体（?）结合并形成夹心。相比之下， 从用SEQ ID NO:l的TNF氨基酸1-23免疫的大鼠获得蛋白A/蛋白G纯化的IgG(〇）。这 种纯化的IgG含有选择性地结合表位A1的单体特异性抗TNF和选择性地结合表位A2的单 体特异性抗TNF的混合物。该纯化的IgG(〇）在该测定中并不夹入，因为一旦这些抗体结 合TNF混合物中的这些TNF单体，这些标记的单体特异性抗体-TNF复合物没有可用的、结 合到在该平板上的铺板的未标记的单体特异性抗体上的单体特异性表位。标记的TNF单体 特异性抗体-单体复合物只不过是从该平板上洗下来而没有接合。结合三聚体TNF的瑞米 凯德（REMICADE)抗体在这个测定中用作阳性对照。因此，抗A1和抗A2抗体两者都没有结 合sTNF的三聚体形式。
[0027] 图3B展示了来自与图3A类似的夹心测定的数据，使用了以下试剂：可商购的瑞米 凯德（REMICADE)抗T