的一抗，进行双标，4°C过夜。再孵育相应的二抗（荧光标记的山羊抗 小鼠IgG_Alexa488和山羊抗兔IgG-PE二抗），最后在特定的激发光下拍照，并计数海马齿 状回神经元增殖（BrdU +/DCX+)数。如图5所示，与正常对照组相比，小鼠慢性水浸拘束应 激后海马齿状回神经元增殖水平显著降低（P< 0.001)，而特咖宁能明显逆转这一作用（P < 0. 01)，提示特咖宁对应激导致神经元增殖水平低下有明显改善作用。
[0059] 试验例8特咖宁对roE4/cAMP/CREB/BDNF/TrkB信号通路的影响：模型建立及分组 如实例6,慢性水浸拘束应激后，取小鼠脑组织，并分离得到海马。采用Western blotting 的方法，对海马组织中的CREB与p-CREB、BDNF和TrkB及p-TrkB的蛋白表达水平进行检测； 用HPLC的方法考察特咖宁对磷酸二酯酶4 (PDE4)活性的影响。用ELISA的方法检测特咖宁 对PC12细胞中cAMP含量的影响。此外，用200iiM皮质酮作用于PC12细胞，模拟抑郁发病 的情况，在给予cAMP的拮抗剂Rp-cAMP后，并测定CREB与p-CREB、BDNF和TrkB及p-TrkB 的蛋白表达。如图6A所示，特咖宁对TOE4活性抑制作用的IC50为535. 41nM。与正常PC12 细胞相比，给予特咖宁可以促使细胞内cAMP含量升高（图6B)。小鼠慢性水浸拘束应激可 以显著抑制CREB/BDNF/TrkB信号通路的激活作用，而特咖宁能明显逆转这一作用（图6C)。 此外，特咖宁可以逆转皮质酮造成的细胞损伤，该作用部分被Rp-cAMP拮抗（图6D)。提示 特咖宁逆转应激导致神经元增殖水平低下这一作用机制可能不完全通过激活该通路，还与 其他靶点有关。
[0060] 试验例9特咖宁对低渗激活容积敏感性氯电流的影响：采用细胞膜片钳技术考 察特咖宁对PC12细胞膜上容积敏感性氯通道的影响。将贴附有细胞的玻片固定于灌流 装置上后，用等渗液浸浴5min后进行膜片钳实验。灌流槽的容积为250 y L，灌流速度为 4mL ? mirT1。全细胞记录形成后,测定全细胞电容即可进入记录模式,继续用等渗灌流液 灌流3min ;再灌流47%低渗灌流液，激活氯电流，待达到峰值再平稳3min ;灌流含特咖宁 (Tc)或咖啡因（Ca)的低渗灌流液，观察全细胞电流值的变化；咖啡因和特咖宁这两种生 物碱抑制容积敏感性氯电流的抑制率计算如公式所示：Inhibition(% ) = (Chyptj-Calkaltjid)/ (chyPQ-c ISQ) X 100% Chyp。；低渗激活的容积敏感性氯电流峰值电流密度；Calkaltjid :加入嘌呤生 物碱，电流平稳后的电流密度；CIS():等渗时的背景氯电流密度。如图7A-D所示，在低渗液灌 流下，记录到低渗激活的容积敏感性氯电流达峰后，细胞外液灌流中加入IOmM的特咖宁和 咖啡因，容积敏感性氯电流受到抑制。与咖啡因相比，无论是在_80mV还是在+80mV时，特 咖宁对低渗激活的氯电流的具有十分显著的抑制作用（P < 〇. 01)，其-SOmV对容积敏感氯 电流的抑制率为（91. 28±5. 3) %，其+80mV对容积敏感氯电流的抑制率为（89. 60±3. 2) % (图7E)。提示特咖宁可能是通过抑制容积敏感氯通道，减少兴奋性谷氨酸的释放，缓解神 经元损伤，促进神经元增殖。
[0061] 以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为 本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种具有式（I)结构的化合物特咖宁，在制备神经再生剂中的应用。2. 根据权利要求1所述的化合物特咖宁在制备神经再生剂中的应用，其特征在于：其 为神经疾病的治疗药物。3. 根据权利要求2所述的化合物特咖宁在制备神经再生剂中的应用，其中，神经疾病 为选自帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、认知症、唐氏症、脑血管障碍、脑中风，脊髓损伤、亨丁 顿氏舞蹈病、多发性硬化症、肌萎缩性侧索硬化症、癫痫、焦虑性障碍、综合失调症、抑郁症、 躁郁症、发育障碍、记忆缺陷多动障碍、学习障碍等神经疾病。4. 根据权利要求3所述的化合物特咖宁在制备神经再生剂中的应用，其特征在于：所 述促进神经再生作用为促进成年哺乳动物脑内的神经干细胞再生。5. 根据权利要求4所述的化合物特咖宁在制备神经再生剂中的应用，其特征在于：主 要是海马齿状回新生成神经元。6. 根据权利要求5所述的化合物特咖宁在制备神经再生剂中的应用，其特征在于：所 述海马神经元再生是通过有效激活cAMP/CREB/BDNF/TrkB信号通路实现的。7. 根据权利要求5所述的化合物特咖宁在制备神经再生剂中的应用，其特征在于：所 述神经元再生是抑制低渗激活的容积敏感性氯电流，减少病理情况下兴奋性谷氨酸的释 放，缓解神经元损伤，从而促进神经元存活。8. 根据权利要求5所述的化合物特咖宁在制备神经再生剂中的应用，其特征在于：特 咖宁可以降低应激导致的皮质酮水平升高，减少神经元损伤，逆转皮质酮对BDNF表达的抑 制作用。9. 根据权利要求1-8中任一项的化合物特咖宁在制备神经再生剂中的应用，其特征在 于：所述神经再生剂为药品、饮食品或者保健品。10. 根据权利要求9中所述的特咖宁用于神经再生剂，其适用于口服，肌肉和血管内等 多种不同途径的给药方式。11. 一种神经再生剂，其特征在于：所述保护剂中含有式（I)结构的化合物特咖宁，12. 根据权利要求11所述的神经再生剂，其特征在于：所述保护剂为药品、饮食品或者 保健品，该保护剂中特咖宁的的质量百分比含量为〇. 001~100%。13. 根据权利要求12所述的神经再生剂，其特征在于：所述保护剂为滴丸剂，滴丸剂中 还含有聚乙二醇，所述聚乙二醇的含量为特咖宁重量的1~60倍；或者所述保护剂为软胶 囊剂，软胶囊剂由胶囊包覆溶于植物油的特咖宁作为有效成分，所述植物油的含量为特咖 宁重量的1~60倍；或者所述保护剂为片剂，片剂中包含有重量为特咖宁重量1~60倍的 淀粉。14. 根据权利要求12神经再生剂，其特征在于：是固体食品、凝胶状食品或饮品。15. 根据权利要求12神经再生剂，其特征在于：是清凉饮料或茶饮料。
【专利摘要】本发明公开了具有式(I)结构的化合物特咖宁，在制备神经再生剂中的应用。另外，本发明还公开了一种有效成分为式(I)结构的化合物特咖宁的神经再生剂。本发明充分说明化合物特咖宁以及含有化合物特咖宁有效成分的药品、饮食品或者保健品能够有效地促进神经再生，可用于提供帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、唐氏症、脑血管障碍、脑中风，脊髓损伤、亨丁顿氏舞蹈病、多发性硬化症、肌萎缩性侧索硬化症、癫痫、焦虑性障碍、综合失调症、抑郁症、躁郁症等与神经再生相关疾病的临床防治与改善的应用。
【IPC分类】A61P25/00, A23L2/52, A61P25/16, A61P25/22, A61P25/28, A61P25/08, A61P25/24, A61K31/522, A61P25/14, A61P25/18, A23L1/30
【公开号】CN104971064
【申请号】CN201410142363
【发明人】何蓉蓉, 李怡芳, 胡惠华, 栗原博
【申请人】何蓉蓉
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2014年4月10日