h);
[0058] FeCl3、HNO3均为分析纯，水为超纯水；
[0059] ICR小白鼠（江苏常州卡文斯实验动物有限公司）。
[0060] 2、实验方法
[0061] 2. 1血浆稳定性实验
[0062] 取两份200 y L正常小鼠的血浆，均加入一定量的？6(：13使血浆中Fe3+的浓度为 100 y g/mL，然后分别加入一定量的黑色素和聚乙二醇化黑色素纳米颗粒使血浆中其浓度 均为100 y g/mL，震荡，离心。
[0063] 2. 2生物相容性实验
[0064] 取ICR小鼠6只，尾静脉注射右旋糖酐铁（150mg/kg) 200 y L/20g建立铁过载模 型小鼠，一周后分为两组（N = 3)，分别尾静脉注射黑色素和聚乙二醇化黑色素纳米颗粒 (100mg/kg) 200 y L/20g，观察。
[0065] 2. 3半衰期的测定
[0066] 取ICR小鼠6只，尾静脉注射89Zr标记的黑色素溶液（200 y L/20g)，使剂量达到 2511^/1^。然后在各个时间点（0.25,0.5，1，1.5,2.5,3.5,4,6，15,24和4811)通过断尾取血 20 yL，以伽玛计数仪测定各个时间点的放射性活度来计算各时间点的血药浓度，以药动学 软件DAS2. 0分析药动学参数。
[0067] 2. 4铁的排泄和组织铁含量的测定
[0068] 取50只ICR小鼠，其中40只通过尾静脉注射右旋糖酐铁（150mg/kg) 200 y L/20g 建立铁过载模型，一周后以每组10只随机分成四组：聚乙二醇化黑色素纳米颗粒低剂量 组、聚乙二醇化黑色素纳米颗粒高剂量组、去铁胺组和模型组，另外10只作为正常组。
[0069] 聚乙二醇化黑色素纳米颗粒低剂量组一次性尾静脉注射聚乙二醇化黑色素纳 米颗粒（35mg/kg) 200 y L/20g，聚乙二醇化黑色素纳米颗粒高剂量组一次性尾静脉注 射聚乙二醇化黑色素纳米颗粒（1〇〇11^/1^)20(^172(^;去铁胺组注射去铁胺（15〇 1^/ kg) 200 y L/20g，隔天给药共5次，给药总剂量为750mg/kg ;模型组和正常组注射等体积的 生理盐水。
[0070] 每天记录各组小鼠体重，第8天开始以代谢笼收集尿液和粪便；21天后眼眶采血， 分离血清及血浆储存于-20°C，解剖各组小鼠以收集各个器官（心、肝、脾、肺、肾、胰腺），生 理盐水冲洗，称重，储存于10%的福尔马林中。
[0071] 尿液、粪便和各个器官中铁的含量用原子吸收光谱法来测定。取各个器官一部分 称重，然后加入500 y LPBS匀浆，接着加入800 y L浓硝酸在电热板上于70°C消解。最终用 来测定的样品（5mL)中HNO3的浓度为1%，铁标准溶液中HNO 3的浓度也为1%。
[0072] 3、实验结果与分析
[0073] 3. 1血浆稳定性实验结果
[0074] 在含有Fe3+的血浆中分别加入黑色素和聚乙二醇化黑色素纳米颗粒后震荡离心。
[0075] 如图I (a)所示，聚乙二醇化黑色素纳米颗粒组的血浆均匀存在；如图I (b)所示， 黑色素组的血浆产生沉淀。
[0076] 3. 2生物相容性实验结果
[0077] 图2(a)所示为正常小鼠的肺部；图2(b)是注射聚乙二醇化黑色素纳米颗粒后小 鼠的肺部图；图2(c)所示为注射黑色素后小鼠的肺部图。
[0078] 各组铁过载模型小鼠在给药后，黑色素组小鼠立刻死亡，聚乙二醇化黑色素纳米 颗粒组小鼠无异常。解剖后发现黑色素组小鼠肺部变黑，可能是由于栓塞而亡。
[0079] 3. 3药时曲线及主要药动学参数
[0080] 根据各个时间点的血药浓度得到血药浓度-时间曲线，如图3所示。
[0081] 以DAS2. 0程序对血药浓度数据进行拟合，确定其在体内符合二室模型，主要药动 学参数如表1所示。
[0082] 由图3和表1可知，聚乙二醇化黑色素纳米颗粒的消除半衰期t1/2 为 23. 803±1. 735h，远高于去铁胺的5min。
[0083] 表1聚乙二醇化黑色素纳米颗粒的主要药动学参数
[0084]
[0085] 注：11/2。表示的为分布半衰期，t 1/2{!表示的为消除半衰期。
[0086] 3. 4各组小鼠的体重变化
[0087] 各组小鼠的体重变化如图4所示。结果表明，各组小鼠的体重在给药前后的21天 内均有增长的趋势，各组之间无显著差（P>〇. 05)。
[0088] 3. 5小鼠的尿粪铁排泄
[0089] 以原子吸收光谱法来测定各组小鼠尿液和粪便中的铁含量，以模型组为标准 (1.0)计算各组铁含量的比率，结果如图5所示。结果表明，与模型组相比，去铁胺和聚乙二 醇化黑色素纳米颗粒治疗组的尿粪铁含量显著提高，而聚乙二醇化黑色素纳米颗粒高剂量 组尿粪铁含量显著地高于去铁胺组。
[0090] 3. 6不同组织的铁含量
[0091] 以原子吸收光谱法来测定各组小鼠各个组织（心、肝、脾、肺、肾、胰腺）的铁含量， 以模型组为标准（1.0)计算各组铁含量的比率，结果如图6所示。
[0092] 结果表明，相比于模型组，去铁胺和聚乙二醇化黑色素纳米颗粒治疗组的组织铁 含量显著下降，而聚乙二醇化黑色素纳米颗粒高剂量组的铁含量显著地低于去铁胺组。
[0093] 4、实验结论
[0094] 聚乙二醇化黑色素纳米颗粒生物相容性好，无毒安全，其血浆半衰期长达23h，相 比于传统的治疗药物去铁胺的半衰期5min显著提高。
[0095] 以铁过载小鼠模型的实验结果可知，聚乙二醇化黑色素纳米颗粒可显著降低组织 铁含量且尿粪铁含量的显著升高，说明聚乙二醇化黑色素纳米颗粒可有效的清除体内的 铁。与去铁胺需频繁给药才能达到治疗效果相比，聚乙二醇化黑色素纳米颗粒（剂量大于 35mg/kg)仅需一次给药即可达到优于去铁胺的疗效、且无明显的毒副作用，可以作为制备 治疗铁过载疾病的药物。
[0096] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对 于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或 变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或 变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
【主权项】
1. 一种聚乙二醇化黑色素纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 取黑色素溶于碱的水溶液，搅拌下加入酸调节至PH7. 0,离心，洗涤，冷冻干燥，得 水溶性黑色素纳米颗粒，备用； (2) 用端部含氨基的聚乙二醇对所述水溶性黑色素纳米颗粒进行表面处理； 所述碱选自碱金属氢氧化物、碱土金属氢氧化物、碱金属碳酸盐、碱土金属碳酸盐、碱 金属碳酸氢盐、碱土金属碳酸氢盐、碱金属醋酸盐、碱金属磷酸盐、碱金属醇盐、氨气、氨水、 胺中的至少一种； 所述酸选自氢卤酸、硫酸、硝酸、磷酸、乙酸中的至少一种。2. 根据权利要求1所述的聚乙二醇化黑色素纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述 表面处理的步骤为： 取所述水溶性黑色素纳米颗粒的水溶液，加入NH4OH溶液调节至pH9. 0,加入pH = 9的 端部含氨基的聚乙二醇的水溶液，离心，洗涤，冷冻干燥，即得。3. 根据权利要求1或2所述的聚乙二醇化黑色素纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所 述端部含氨基的聚乙二醇为NH2-PEGm。。-順2。4. 根据权利要求1-3任一项所述的聚乙二醇化黑色素纳米颗粒的制备方法，其特征在 于，所述碱为氢氧化钠，所述酸为盐酸。5. -种利用权利要求1-4任一项所述的制备方法制备得到的聚乙二醇化黑色素纳米 颗粒。6. 根据权利要求5所述的聚乙二醇化黑色素纳米颗粒，其特征在于，所述聚乙二醇化 黑色素纳米颗粒的粒径为1~l〇〇nm。7. 根据权利要求6所述的聚乙二醇化黑色素纳米颗粒，其特征在于，所述聚乙二醇化 黑色素纳米颗粒的粒径为1~l〇nm。8. 根据权利要求5-7任一项所述的聚乙二醇化黑色素纳米颗粒，其特征在于，所述聚 乙二醇化黑色素纳米颗粒为球形。9. 权利要求5-8任一项所述的聚乙二醇化黑色素纳米颗粒在制备金属螯合剂中的用 途。10. 权利要求5-8任一项所述的聚乙二醇化黑色素纳米颗粒在制备治疗铁过载疾病的 药物中的用途。
【专利摘要】本发明属于制药领域，具体涉及聚乙二醇化黑色素纳米颗粒及其制备方法与用途。该制备方法包括以下步骤：(1)取黑色素溶于碱的水溶液，搅拌下加入酸调节至pH7.0，离心，洗涤，冷冻干燥，得水溶性黑色素纳米颗粒，备用；(2)用端部含氨基的聚乙二醇对所述水溶性黑色素纳米颗粒进行表面处理。本发明制备的聚乙二醇化黑色素纳米颗粒粒径为1～10nm，在水等溶剂中分散性良好，可以与Fe3+螯合；ICR小鼠模型实验结果表明，其具有超强的铁排泄效率和良好的安全性，半衰期长达23h，减少了给药次数，延长了给药间隔，提高了用药的方便性，可以作为制备治疗铁过载疾病的药物。
【IPC分类】A61K47/48, A61P39/02, A61K45/00, A61K9/14
【公开号】CN105031665
【申请号】CN201510471038
【发明人】杨敏, 范曲立, 张朋俊, 杨润琳, 赵富宽, 潘栋辉, 徐宇平, 严骏杰, 王立振, 张波
【申请人】江苏省原子医学研究所
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年8月4日