2](2)、CpG对球形金纳米粒子的功能化修饰:
[0073]将步骤(I)除杂处理后的反应液加入到实施例一得到的球形金纳米粒子中，使CpG的终浓度为3 μ mol/L,室温振荡24h得到CpG-球形纳米金复合物备用。
[0074]2、模式抗原OVA抗原肽(OVA antigen peptide,简写作OVAp，OVA是卵清蛋白)对球形金纳米粒子的功能化修饰:即将半胱氨酸修饰的OVAp (如OVA257 264抗原肽)与球形金纳米粒子偶联，操作如下:
[0075]首先将巯基化聚乙二醇(SH_PEG，Mw = 5000)与实施例一得到的球形金纳米粒子混合至SH-PEG的终浓度为lmg/mL，室温共孵育约0.5h，然后加入OVAp，使OVAp的终浓度为50 μ Μ，室温振荡24h，得到OVAp-球形纳米金复合物备用。
[0076]3、纳米金鸡尾酒的调配:
[0077]将步骤I得到的CpG-球形纳米金复合物(其中金纳米粒子的含量为500 μ g/mL)和步骤2得到的OVAp-球形纳米金复合物(其中金纳米粒子的含量为500 μ g/mL)等体积混合均匀，即得到本发明的可提高过继性树突状细胞功能化过程的促进剂一一CpG-OVAp球形纳米金鸡尾酒。
[0078]实施例四、CpG-mAGE-1球形纳米金鸡尾酒的制备
[0079]1、TLR9通路刺激剂CpG对球形金纳米粒子的功能化修饰:
[0080]同实施例三中的步骤1，得到CpG-球形纳米金复合物备用。
[0081]2、mAGE-1 (melanoma antigen-l,肿瘤抗原黑色素瘤抗原-1)对球形金纳米粒子的功能化修饰，即为mAGE-1与球形金纳米粒子的偶联:
[0082]构建重组质粒，体外纯化获得mAGE-1 ;将mAGE_l与实施例一得到的球形金纳米粒子混合至mAGE-1的终浓度为50-100 μ g/mL,并在范德华力作用下室温保持lh，得到mAGE-1-球形纳米金复合物备用。
[0083]3、纳米金鸡尾酒的调配:
[0084]将步骤I得到的CpG-球形纳米金复合物(其中金纳米粒子的含量为500 μ g/mL)和步骤2得到的mAGE-1-球形纳米金复合物(其中金纳米粒子的含量为500 μ g/mL)等体积混合均匀，即得到本发明的可提高过继性树突状细胞功能化过程的促进剂一一CpG-mAGE-1球形纳米金鸡尾酒。
[0085]实施例五、CpG-肝癌细胞破碎裂解物棒状纳米金鸡尾酒的制备
[0086]即是用肝癌细胞破碎裂解物修饰步骤I得到的CpG-棒状纳米金复合物，得到同时携带CpG和肿瘤抗原的双功能棒状金纳米粒子。
[0087]1、TLR9通路刺激剂CpG对棒状金纳米粒子的功能化修饰:
[0088]同实施例三中的步骤1，仅是将其中的实施例一得到的球形金纳米粒子换成实施例二得到的棒状金纳米粒子，得到CpG-棒状纳米金复合物备用。
[0089]2、肝癌细胞破碎裂解物的获得:
[0090]采用反复冻融法获得小鼠H印1-6肿瘤细胞系的全抗原:首先用胰酶消化获得体外培养的H印1-6单细胞悬液，200g离心15min后用PBS重悬细胞(I X 17个/mL)，60。。水浴加热I h ;水浴后细胞悬液迅速浸入液氮中速冻，I Om i η后取出，室温融化，离心(2000rpm, 20min)收取上清，反复加热、速冻、融化和离心5_6次后，得到肝癌细胞破碎裂解物。
[0091]3、纳米金鸡尾酒的调配:
[0092]将步骤2得到的肝癌细胞破碎裂解物与步骤I得到的CpG-棒状纳米金复合物等体积混合(其中细胞破碎裂解物终浓度为100-1000 μ g/mL)，室温下振荡孵育24h后离心分离(离心转速随采用的纳米金粒子大小而变化，粒子越大，离心转速越低)，即得到本发明的可提高过继性树突状细胞功能化过程的促进剂一一CpG-肝癌细胞破碎裂解物棒状纳米金鸡尾酒。
[0093]在体外实验中，细胞对于金纳米粒子较为合适的吞噬粒径在40nm-60nm范围内，但考虑到修饰后的纳米金鸡尾酒其表面的理化性质会发生改变，包括所带电荷、流体力学半径等均会发生改变，因此在具体的实验过程中，应通过后续的促进效果对纳米金载体进行筛选。
[0094]实验例一:金纳米粒子流体力学半径的筛选
[0095]按实施例一的方法制备得到一系列流体力学半径在10_90nm的球形金纳米粒子，按实施例二的方法制备得到一系列长径比在2-3之间，粒径分布均匀的棒状金纳米粒子；再按照实施例三和实施例五的方法得到一系列金纳米粒子流体力学半径不同的CpG-球形纳米金复合物、CpG-棒状纳米金复合物、OVAp-球形纳米金复合物、mAGE-1-球形纳米金复合物。
[0096]用流式细胞检测方法分别检测CpG-球形纳米金复合物和CpG-棒状纳米金复合物对DCs成熟的促进效果及OVAp-球形纳米金复合物和mAGE-1-球形纳米金复合物进入DCs后的抗原递呈情况。金纳米粒子根据电感耦合等离子光谱法(ICP)检测结果进行定量，每IX 16个/mL未成熟的DCs中加入50 μ g/mL金纳米粒子。以CpG-球形纳米金复合物和OVAp-球形纳米金复合物为例，37°C ,5% CO2孵箱中孵育48h后，所得到的流式细胞检测结果见图3 (金纳米粒子缩写为“AuNP+半径”形式，图3中A为DCs分群鉴定的流式结果，B为不同粒径OVAp-球形纳米金复合物抗原递呈效率的结果，C为不同粒径CpG-球形纳米金复合物促进DCs成熟表面标志物表达的流式结果)。可见，在本体系实验条件下，与金纳米粒子结合后的CpG-球形纳米金复合物比单独的CpG促进DCs成熟表面标志物表达的流式结果要好(见图C中的52.3%和55.8% );与金纳米粒子结合后的OVAp-球形纳米金复合物比单独的OVAp抗原递呈效率高(见图B中20.7%和30.5% )。CpG-球形纳米金复合物中对DCs的促成熟效果最优的球形金纳米粒子的流体力学半径为80nm，而OVAp-球形纳米金复合物中对抗原肽的递呈最合适的球形金纳米粒子的流体力学半径为60nm。因此确定:CpG-纳米金类复合物中对DCs的促成熟效果较好的球形金纳米粒子的流体力学半径为60-80nm，抗原类/蛋白类纳米金复合物中对抗原肽的递呈较好的球形金纳米粒子的流体力学半径为40_80nm。
[0097]实验例二、金纳米粒子加入量的筛选
[0098]将实验例一种优选的流体力学半径分别为80nm和60nm的CpG-球形纳米金复合物和OVAp-球形纳米金复合物以“鸡尾酒”的混合形式同时加入到骨髓诱导未成熟DCs中，考察不同金纳米粒子含量(相同的刺激剂及抗原修饰量)对免疫活化效果的影响，见图
4-图7，如DCs中抗原递呈情况(如图4)、上清中各细胞因子分泌(图5)、不同剂量下DCs对金纳米粒子吞噬量(图6)及DCs摄入后的透射电镜照片(图7，其中Al和A2分别是A左侧和右侧虚线区域的放大图，BI和B2分别是B左侧和右侧虚线区域的放大图)，将金纳米粒子含量分为低剂量(12.5 μ g/mL)、中剂量(25 μ g/mL)、高剂量(37.5 μ g/mL)和超高剂量(50 μ g/mL)四个组。
[0099]如图4及图5所示，在纳米金鸡尾酒的调配中，中剂量的纳米金鸡尾酒(两种复合物中金纳米粒子含量均分别为25 μ g/mL)能够获得更高的抗原递呈效率及更优的细胞因子分泌效果。在此剂量下，虽然DCs吞噬金纳米粒子剂量不高(如图6)，两种复合物中金纳米粒子含量均分别为25 μ g/mL时，吞噬剂量不到I y g/mL,即不足2% )，但金纳米粒子可以更多地进入溶酶体中，如图7所示，更有利于溶酶体途径的抗原交叉递呈。因此，纳米金鸡尾酒中金纳米粒子的含量在12.5 μ g/mL-37.5 μ g/mL时，对DCs的促成熟效果较好，在25 μ g/mL时对DCs的促成熟效果最好。
[0100]实验例三、用本发明纳米金鸡尾酒进行功能化的DCs对黑色素瘤的作用
[0101]将实施例四得到的纳米金鸡尾酒以25 μ g/mL金纳米粒子的剂量加入到I X 16个/mL未成熟DCs中，37°C，5% COj?箱中孵育48h后，用PBS溶液离心洗涤三次，得到功能化的DCs。给接种了黑色素瘤两周的小鼠(体重20-25g)以3X 16功能化的DCs/只的剂量进行功能化DCs细胞回输，得到的小鼠生存率曲线如图8所示。图中可以看出，接种10天、30天和40天后，用本发明纳米金鸡尾酒输注的小鼠存活率始终为100%，而使用游离抗原和佐剂(游离抗原和佐剂分别为与本发明组等量的游离OVAp和CpG)输注的小鼠在这三个时间段的存活率分别是100%、75%和不到50%，使用未成熟DCs输注的小鼠在这三个时间段的存活率分别是不到90%、50%和不到20%。可见，纳米金鸡尾酒功能化DCs的输注显著延长了黑色素瘤小鼠的荷瘤存活时间，显示了较好的抗原特异性抗肿瘤效果。
[0102]实验例四、用本发明纳米金鸡尾酒进行功能化的DCs对肝癌的作用
[0103]将实施例五得到的CpG-肝癌细胞破碎裂解物棒状纳米金鸡尾酒以50 μ g/mL金纳米粒子的剂量为加入到I X 16个/mL未成熟DCs中，37°C，5% CO 2孵箱中孵育48h后，采用PBS溶液离心洗涤三次，得到功能化的DCs。
[0104]给皮下接种了肝癌细胞H印1-6 (5 X 15个/只)两周的C57BL小鼠(体重20_25g)以3X 16功能化的DCs/只的剂量间隔两周(2w)进行了两次功能化DCs细胞回输，然后将肿瘤剥离下来，照片如图9所示。可见，使用游离抗原和佐剂促进(同实验例三)的DCs治疗组，相比未成熟DCs治疗组(空白组)，移植瘤大小无显著变化，而使用本发明纳米金鸡尾酒促进的DCs治疗组移植瘤明显变小，变小至空白组的10%，显示了较好的抗肿瘤效果。
[0105]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本